Un optimisé Evans Blue protocole pour évaluer une fuite vasculaire chez la souris

Résumé

Un protocole simple, optimisé et économique décrit dans cet article, qui utilise la méthode du colorant bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN qui peuvent être adaptés à d’autres souches, espèces et autres organes ou tissus.

Résumé

Une fuite vasculaire ou l’extravasation plasmatique, a un certain nombre de causes et peut être une conséquence grave ou un symptôme d’une réaction inflammatoire. Cette étude pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. Il est important que les chercheurs aient les outils appropriés, y compris les meilleures méthodes disponibles, pour étudier l’extravasation plasmatique. Dans cet article, nous décrivons un protocole, à l’aide de la méthode de colorant bleu Evans, pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN. Ce protocole est volontairement simple, à aussi grand un degré possible, mais fournit des données de haute qualité. Bleu Evans a été choisi principalement parce qu’il est facile pour le laboratoire moyen à utiliser. Nous avons utilisé ce protocole pour fournir des preuves et le soutien pour l’hypothèse que l’enzyme néprilysine pourrait protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique. Toutefois, ce protocole peut être expérimentalement utilisé et facilement adapté pour être utilisés dans d’autres souches de souris ou chez d’autres espèces, dans de nombreux différents organes ou tissus, pour les études qui peut impliquer des autres facteurs qui sont importants dans la compréhension, la prévention ou le traitement, extravasation plasmatique. Ce protocole a été grandement amélioré et modifiés de protocoles existants et combine fiabilité, facilité d’utilisation, économie et la disponibilité générale des matériaux et équipements, rendant ce protocole supérieur pour le laboratoire moyens à utiliser dans quantifier l’extravasation plasmatique des organes.

Introduction

Une fuite vasculaire dans les organes se réfère à l’extravasation, ou fuite du plasma sanguin par des fentes produites dans l’endothélium des post veinules capillaires dans les organes. Cette extravasation plasmatique ou augmentation de la perméabilité vasculaire, qui peut-être découler d’une réaction inflammatoire quelconque, peut avoir des conséquences graves. Ainsi, il est important que ce phénomène, ses causes, les modulateurs et les conséquences, sont étudiés et compris, et même, que les enquêteurs ont bien des outils et protocoles permettant de les étudier. Les lacunes endothéliales peuvent être produits par un certain nombre de stimuli, mais sont habituellement produites par l’action des neurotransmetteurs peptidiques et/ou tachykinines sur l’endothelia. Un des principaux médiateurs naturels de ce processus, ce qui provoque l’extravasation plasmatique accrue, est l’undecapeptide TACHYKININE neuropeptide, la substance P¹.

Méthodes d’enquêter et de mesurer la perméabilité vasculaire ou l’extravasation plasmatique, qui utilisent la propriété de liaison de l’albumine de bleu Evans, ont été développés et sont généralement réputés pour leur précision, simplicité, économie, sécurité et aptitude à permettre le détermination de l’extravasation plasmatique de plusieurs tissus à la fois, dans l’affirmative désiré^{2,3,4,5,6,7,8,9} . Ce protocole de bleu Evans pour évaluer l’extravasation plasmatique dans les organes des souris FVBN utilise tous ces, mais ajoute quelques modifications importantes qui le rendent généralement utile et adaptable pour de futures études, impliquant le laboratoire moyens qui effectue ou qui seront mener des études importantes des facteurs liés à l’extravasation plasmatique ou perméabilité vasculaire. Dans ce protocole, la substance P est introduite à la souris à 1 nmol/kg, ce qui augmente l’extravasation de plasma par 1,5 fois. Ceci augmente la sensibilité du protocole, ce qui entraîne plus facilement des résultats observables et réalisables. Autres facteurs qui influent sur la perméabilité, telles que diverses autres peptides, produits chimiques ou certaines formes de lésions toxiques, peuvent être utilisés ou étudiés par d’autres laboratoires, comme vous le souhaitez. Veine jugulaire injections sont utilisés dans le présent protocole qui va présenter le bleu Evans et substance P systémique, qui nécessite une chirurgie terminale. Cependant, veine jugulaire injections^5,7,10, même après avoir examiné les techniques chirurgicales terminales nécessaires, sont plus faciles à maîtriser et conduire à la production de résultats plus cohérents qu’autre des injections veineuses, y compris la queue de la veine des injections^4,9. Bien qu’il serait possible de bleu Evans doivent être fournis par des injections de sinus veineux rétro-orbitaire, aucuns références dans la littérature n’ont été trouvés qui utilisent cette méthode de livraison de bleu Evans. Toutefois, en ce qui concerne les injections de queue de veine, le degré élevé d’expertise et de la pratique de façon reproductible maîtriser cette technique très limite son utilisation pour des injections de bleu Evans réussies. En revanche, la méthode d’injection de rechange veine jugulaire, comme décrit dans notre protocole, offre une solution techniquement possible. Une procédure cruciale pour la perfusion des veines de la souris, effectué juste après le sacrifice de la souris sous perfusion bleu Evans, supprime les excès bleu Evans et a été normalisé par le présent protocole. Méthodes précédemment décrites de perfusion ont été soigneusement examinés et modifiés pour obtenir la procédure actuelle. Autres modifications décrites ici sont tous optimisés, simple et peu coûteux.

Il y a certaines limitations importantes de la méthode de colorant bleu Evans. Par exemple, faible sensibilité, parfois associée à cette méthode peut empêcher certains examen brut supplémentaire de pathologique et histologique des tissus provenant d’animaux d’injection de bleu Evans. Cependant, ceux-ci et autres contraintes ont conduit au développement de méthodes alternatives et des modèles qui, néanmoins, toujours utilisent bleu Evans. La mesure de bleu Evans par fluorescence (plutôt que par la portée visuelle) spectroscopie peut augmenter la sensibilité de la méthode. En outre, la microscopie de fluorescence des tissus de coloration bleu Evans a été développée pour permettre l’observation d’une fuite vasculaire en plus distincts endroits¹¹. Aussi, confiné d’imagerie et d’analyse d’un animal vivant précédemment injecté avec Evans bleu¹² permet d’enquête des concentrations de bleu Evans d’une manière continue, plutôt qu’au une propre fois choisi le point de l’expérience. Toutefois, cette méthode requiert la disponibilité d’installations d’imagerie appropriées et peut être très coûteuse. Les adaptations impliquant Evans bleu et interprété dans un type in vitro de modèle, comme dans une cellule culture ou poussin modèle Chorio-¹³ (CAM) ont également été décrites. Ces modèles sont surveillées par fluorescence et de la microscopie intravitale¹⁴ et permettent la quantification des modifications de la perméabilité vasculaire au fil du temps, mais peuvent soulever des questions au sujet de la modélisation précise de in vivo des conditions et peuvent également être cher.

Il y a eu des autres méthodes mises au point afin de déterminer et de quantifier une fuite vasculaire ou perméabilité, qui n’impliquent pas l’administration de bleu Evans. Ces méthodes peuvent employer une molécule fluorescente appropriée (comme l’albumine ou fluorescéine), ou une molécule tagged isotopiquement étiquetée ou autrement, d’animaux vivants (ou à la cellule culture ou Chorio (CAM) modèles¹³, suivi non invasif imagerie (balayage d’animal de compagnie, MRI, la microscopie intravitale, corps entier balayage) ou invasive d’imagerie (microscopie fluorescente)^3,12,15. Bien que ces techniques peuvent offrir un certain nombre d’avantages par rapport aux autres Evans méthodes bleus, ils ont aussi des inconvénients, qui peuvent comprendre leur complexité considérable, compétences requises, les ressources et les coûts monétaires élevés.

Néprilysine¹⁶ (la peptidase enzyme NEP, également connu sous le nom CD10, MME ou enképhalinase) a été suggéré d’être impliqués dans l’inhibition de l’extravasation plasmatique, au moins en partie, par le métabolisme enzymatique et l’inactivation de P. de substance endogène Ainsi, dans les tissus où la peptidase de surface cellulaire NEP survient, il peut y avoir une atténuation de l’effet de la substance P, probablement par l’activité peptidase du NEP.

Au départ, nous avons testé pour l’extravasation plasmatique induite par la substance P utilisant ce protocole modifié de bleu Evans, avec FVBN sauvage (WT) et souris knockout (KO) de NEP. Participation de NEP à l’extravasation plasmatique augmentée la substance P a été soupçonnée de ces premières études, et nous décrire ces expériences plus rôle de NEP impliquant dans l’extravasation plasmatique. Toutefois, la mise au point de ce manuscrit n’est pas son rôle dans l’extravasation plasmatique ou NEP, mais plutôt l’extravasation plasmatique expériences eux-mêmes. Les résultats de la NEP sont représentatifs du type de résultats pouvant être obtenus via l’utilisation de ce protocole modifié. La méthode de bleu Evans pour mesurer l’extravasation plasmatique a été optimisée et modifiée, tel que décrit en détail ci-dessous pour les souris FVBN.

Protocole

Toutes les directives internationales, nationales et/ou institutionnels pour le soin et l’utilisation des animaux (souris) ont été suivis dans les expériences décrites dans ce manuscrit.

Cette méthode utilise des souris adultes FVBN, âgés de 16 à 20 semaines, jugées optimales pour l’application de la présente étude. Jour 1 comprend les étapes 1 à 5 et 2 jours comprend les étapes 6 et 7 (Figure 1).

1. matériel préparation

1. Garantir un approvisionnement suffisant de seringues stériles, jetables et aiguilles, si la kétamine/xylazine est utilisé comme l’anesthésie (comme recommandé). Si l’isoflurane est utilisé comme l’anesthésie, vérifier le réservoir d’oxygène et le niveau de liquide d’isoflurane pour s’assurer qu’un approvisionnement adéquat pour l’expérience avant de commencer. En outre, assembler l’ogive circuits de respiration et joignez-les à la boîte de l’induction ; Fixez nouvelles cartouches à charbon sur les circuits respiratoires. Préparer la zone induction en tournant sur l’oxygène et s’être assuré que la deuxième étape lit environ 50 lb/po2.
2. Mettre en marche le coussin chauffant à 37 ° C.
3. Préparer la sonde de température rectale à la chirurgie.

2. préparation souris

Cette étape comprend l’anesthésie, l’épilation et positionnement (FVBN souris-âge adulte 16 à 20 semaines).

1. Peser les souris et noter leur poids.
2. Anesthésier les souris.
   1. Administrer la kétamine et xylazine IP (80-100 mg/kg et 7,5-16 mg/kg, respectivement). Toutefois, il est recommandé de commencer avec faibles doses de kétamine et de xylazine (30 mg/kg et de 6 mg/kg, respectivement).
   2. Maintenir l’anesthésie avec environ 0,1 - 0,25 fois initiale des doses de kétamine/xylazine tout au long de la chirurgie. Kétamine et xylazine étaient les agents anesthésiques de choix dans cette étude, car plus de reproductibilité et de survie ont été observés. On trouvera les agents anesthésiques de choix dans d’autres études d’être différent.  Si l’isoflurane est utilisé, placez la souris dans une chambre à induction et allumez isoflurane à 5 % jusqu'à ce que la souris perd conscience complète. Ensuite, utilisez une pointe nasale fixée à 1,5 à 2,5 % isoflurane durant le reste de la procédure.
3. Surveiller les souris toutes les 2-3 min par pincement d’orteil pour vérifier la profondeur appropriée de l’anesthésie.
4. Raser la zone ventrale de cou de la souris.
5. Placez votre souris en position couchée sur le pad préchauffé. Fixez les pattes et les pieds de la souris sur la surface chirurgicale avec du ruban adhésif.
6. Placez la larme artificielle onguent sur les yeux pour éviter le dessèchement pendant la chirurgie.

3. chirurgies détails

1. Faire une incision de 1 cm dans le cou juste ventral sur la veine jugulaire.
2. Appliquer une ou deux gouttes de lidocaïne (1-2 %) dans la zone de l’incision pour la gestion de la douleur et à favoriser la vasodilatation. Attendez 2 min. de la lidocaïne prenne effet.
3. Exposer et isoler la veine jugulaire interne droite par l’intermédiaire de dissection non tranchante. Attacher la veine avec suture 4-0 et retirer doucement l’extrémité rostrale du navire avec une pince hémostatique. Découpez un trou, à l’aide des ciseaux, environ 3 mm ci-dessous ou caudale à la cravate, environ à mi-chemin à travers le diamètre de la veine.
4. Marquer un cathéter polyvinylique PV-1 à 1,5 cm de l’extrémité et insérez-le dans la veine jugulaire dans le trou à l’aide d’un dilatateur de navire et visser le cathéter vers l’extrémité caudale du navire, environ 1,5 cm.
5. Attacher le cathéter solidement dans la partie caudale du navire (en dessous de la coupe), avec de la soie de 4-0. Attacher la partie rostrale du navire à l’extérieur du cathéter avec les deux bouts de la suture qui servait à attacher la veine jugulaire rostrale, à l’étape 3.3.
6. Amure la peau lâche de retour ensemble autour de la sonde avec de la soie de 4-0 pour aider à prévenir la perte de chaleur corporelle et de la dessiccation des tissus.
7. Raccorder le cathéter à une seringue contenant du sérum physiologique hépariné (10 U/mL) et rincer le cathéter.

4. injections

1. Injecter la solution de bleu Evans (50 μL d’une solution de 30 mg/mL dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou environ 50 mg/kg) dans le cathéter de la veine jugulaire, suivi d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne.
2. 2 min plus tard, injecter la substance P (100 μL d’une solution de 0,3 μM dans une solution saline normale, unheparinized de 0,9 %, ou 1 nmol/kg), suivie d’une petite quantité de sérum physiologique hépariné pour rincer la ligne. La substance P augmente l’extravasation de protéines plasmatiques à travers la couche endothéliale ; dans ce protocole, il induit systématiquement une augmentation des valeurs de l’extravasation plasmatique d’environ 1,5 fois, faire de plasma extravasation valeurs, plus facile à mesurer.
3. Attendre 18 min après que la substance P est injecté. Pendant ce temps, le colorant bleu Evans s’équilibrer, faire circuler.
4. Mettre fin à l’expérience 18 min après l’injection de la substance P (20 min après l’injection de bleu Evans) en sacrifiant la souris avec dislocation cervicale. Il est probable que la souris peut être directement doivent disloqué, sans premier donner une surdose d’anesthésique, comme la souris est probablement encore bien anesthésié de la chirurgie. Toutefois, s’il le faut, une surdose de l’anesthésique kétamine/xylazine, isoflurane ou pentobarbital peut être donnée, suivie par dislocation cervicale.

5. isolation des organes

1. Fend la cavité thoracique de la souris et gravité-perfuse (d’une hauteur d’environ 51 cm ou 20"), le cœur et les vaisseaux sanguins avec 50 mL de 50 mM du citrate de sodium, pH de 3,5. pH 3.5 conserve sans doute contraignant de bleu Evans à l’albumine.
2. D’accise 1-5 organismes concernés (tissus) avec un scalpel dissection (p. ex. de la vessie, rein, estomac, foie, pancréas, proximale ou distale du côlon, iléon, duodénum, flanc peau, oreilles, queue, coeur, et poumons) et de supprimer tout contenu résiduel, si présents.
3. Rincez les organes à température ambiante (RT) tampon phosphate salin (PBS ; 1,44 g de Na₂HPO4, 0,24 g de KH₂PO4, 8,0 g de NaCl et 0,20 g de KCl dans 1 L, pH 7,4).
4. Épongez les organes avec tissu, couper chaque organe en deux et peser chaque moitié (wet poids, g).
5. Sécher une moitié du tissu dans une étuve à 150 ° C, sur une feuille, pendant 48 h.
6. Placez les autres tissus de la moitié dans un volume cohérent (200 µL) de formamide dans un microtube tube pendant 48 h (et jusqu'à 72 h) pour extraire le bleu Evans.

6. mesures de tissu OD

1. Enlever 50 µL de formamide d’infusé de bleu Evans (après une incubation de 48-72 h RT) du tube à centrifuger et lieu dans un puits d’une plaque 96 puits en polystyrène. Veillez à ne pas transférer des morceaux de tissu ainsi que le formamide.
2. Place 50 µL de nouveau, pure formamide dans chacun des deux puits vides de la plaque à 96 puits pour les blancs.
3. Mesurer et consigner la do₆₂₀ de chaque puits de la plaque de 96 puits sur un lecteur de plaque d’absorbance. 620 nm est l’absorbance maximale de bleu Evans.

7. calcul de l’Extravasation plasmatique

1. Peser le tissu sec la moitié qui a été dans le four pendant 48 h.
2. Calculer le ratio de poids poids humide/sec pour l’organe spécifique d’intérêt de chaque souris individuels, commençant par le poids de ce tissu moitié (obtenu en étape 5.4), divisé par le poids sec de ce même tissu moitié (obtenu en étape 7.1).
3. Calculer le poids sec (en g) du tissu moitié en formamide en divisant le poids du tissu moitié avant il a été placé en formamide (obtenu à l’étape 5.4) par la voie humide : ratio de poids sec pour l’organe spécifique d’intérêt (calculé à l’étape 7.2).
4. Calculer les valeurs de₆₂₀ OD corrigé . À partir de l' OD₆₂₀ valeur de chaque puits expérimental de la plaque à 96 puits (contenant du formamide de Evans bleu infusé de chaque tissu, obtenu à l’étape 6.3), soustraire la vierge bien OD₆₂₀ (la valeur moyenne OD₆₂₀ de les deux puits contenant du formamide pur, préparé à l’étape 6.2, OD₆₂₀ valeurs obtenues à l’étape 6.3) de chaque valeur expérimentale.
5. Calculer la valeur de l’extravasation plasmatique en divisant le corrigé do₆₂₀ (calculée en étape 7,4) par le poids sec du tissu moitié en formamide (calculée en étape 7.3). Les unités de l’extravasation plasmatique sera OD620/g de poids sec.
6. Analyser les données et explicite sous forme de moyenne ± SEM. statistiquement comparer les groupes de test t ou analyse de variance et test de comparaison multiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), selon le cas.

Résultats

Dans la Figure 1, un schéma de la procédure est montré, qui a été trouvé pour entraîner les valeurs de l’extravasation plasmatique induite par la substance P plus fiable et cohérente des organes des souris FVBN. Cette procédure prend généralement deux jours de travail, séparés par au moins 48 h de délai d’attente. Il est possible de l’étendre encore plus, si cela est fait systématiquement pour toutes les expériences à comparer. Par exe...

Discussion

Comme indiqué ci-dessus, l’étude de l’extravasation plasmatique pourrait déboucher sur les nouvelles connaissances concernant les causes du ou des nouveaux moyens d’inhiber ou de traiter l’extravasation plasmatique. L’utilisation efficace du protocole extravasation plasmatique (ci-dessus), à l’aide de bleu Evans, a été démontrée dans le manuscrit actuel. Bien que les données affichées en arrière l’hypothèse que le NEP peut protéger les vaisseaux contre l’extravasation plasmatique, c’est un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091