הקלטה במרחב מוגבל תנודות בהיפוקמפוס מתנהגים באופן עכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההקלטה של פוטנציאל שדה מקומי עם רב shank סיליקון ליניארי רגשים. המרה של האותות באמצעות ניתוח צפיפות המקור הנוכחי מאפשר השחזור של הפעילות החשמלית המקומית בהיפוקמפוס העכבר. בטכניקה זו, תנודות המוח מוגבל יכול להילמד במעבר בחופשיות עכברים.

Abstract

הפוטנציאל שדה מקומי (LFP) מתגלה מתנועות יון מעבר ממברנות עצביות. מאז המתח שהוקלט על ידי אלקטרודות LFP משקף את השדה החשמלי מסוכם של כמויות גדולות של רקמת המוח, חילוץ מידע אודות פעילות מקומית הוא מאתגר. עם זאת, למדתי מתוכנת עצביים, דורש הבחנה אמין בין אירועים מקומיים באמת כמנצח נפח אותות שמקורם באזורים מרוחקים המוח. הניתוח הנוכחי של צפיפות (CSD) מקור מציע פתרון בעיה זו על-ידי מתן מידע על כיורים הנוכחי ועל מקורות באזור האלקטרודות. באזורים במוח עם למינריות cytoarchitecture כגון ההיפוקמפוס, CSD חד-ממדי ניתן להשיג על ידי הערכת המרחבי הנגזרת השנייה של LFP. כאן, אנו מתארים שיטה LFPs multilaminar הרשומה באמצעות סיליקון ליניארי הגששים מושתל לתוך ההיפוקמפוס הגבי. עקבות CSD מחושבים לאורך שאנקס בודדים של המכשיר. פרוטוקול זה ובכך מתאר הליך כדי לפתור תנודות מוגבל ברשת עצביים בהיפוקמפוס לנוע בחופשיות עכברים.

Introduction

תנודות ב- LFP מעורבים באופן ביקורתי מידע עיבוד על ידי מעגלים עצביים. הם מכסים מגוון רחב של תדרים, ועד גלים איטיים (~ 1 Hz) ריפל במהירות תנודות (~ 200 Hz)¹. תדירות ברורים להקות הקשורים עם תפקודים קוגניטיביים, כולל זיכרון, עיבוד רגשי של ניווט^2,3,4,5,6,7. הזרימה הנוכחית מעבר ממברנות עצביים מהווה את החלק הגדול ביותר של האות LFP⁸. קטיונים הזנת התא (למשל באמצעות הפעלה של הסינפסות סינאפסות glutamatergic) מייצגים כיור הנוכחי פעיל (כמו תשלום משאיר המדיום חוץ-תאית). לעומת זאת, זרימה נטו של מטען חיובי למדיום חוץ-תאית, למשל על-ידי הפעלה של GABAergic הסינפסות מעכבות, מתארת מקור הנוכחי פעיל במיקום זה. ב הדיפולים עצביים, כיורים הנוכחי ניתן לזווג עם מקורות סביל ולהפך עקב קיזוז הזרמים המשפיעים על קרום תשלום באתרים מרוחקים.

השדה החשמלי שנוצר על-ידי תהליכים עצביים מרחוק יכול גם לגרום מתח ניכר deflections על אלקטרודה הקלטה, עשויות ובכך באופן כוזב להיחשב כאירוע מקומי. הולכה נפח זה מהווה אתגר רציני הפרשנות של אותות LFP. ניתוח CSD מספק מידע אודות כיורים הנוכחי מקומיים ומקורות שבבסיס LFP אותות ולכן כוללת אמצעים כדי להפחית את ההשפעה של אמצעי האחסון הולכה⁸. במבנים למינציה כמו ההיפוקמפוס, ניתן לקבל אותות CSD חד-ממדי הנגזרת המרחבית השנייה של LFP להקליט מ קו מקביל אלקטרודות המסודרים בניצב מטוסים למינריות⁹. כניסתו של הגששים סיליקון ליניארי זמינים מסחרית אפשרה לחוקרים לנצל את השיטה CSD לצורך המחקר של תנודה המקומי פעילות ההיפוקמפוס. לדוגמה, זה הוכח כי תנודות גמא ברורים להגיח באופן ספציפי שכבה באזור CA1¹⁰. יתר על כן, ניתוח CSD זיהה עצמאית נקודות חמות של פעילות גמא בשכבה התא העיקרי של הפיתול משוננת¹¹. חשוב לציין, ממצאים אלה היו רק לכאורה CSD המקומי, אבל לא LFP אותות. ניתוח CSD ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לקבל תובנה בפעולות microcircuit של ההיפוקמפוס.

ב פרוטוקול זה, אנו מספקים מדריך מקיף כדי לקבל אותות CSD חד-ממדי עם סיליקון הגששים. שיטות אלה יאפשר למשתמשים לחקור אירועים תנודה מקומי בהיפוקמפוס של עכברים להתנהג.

Protocol

כל השיטות המערבות בעלי חיים החיים אושרו על-ידי פרייבורג Regierungspräsidium לפי חוק רווחת בעלי חיים גרמנית.

1. תכשירים

1. לתכנן ולבנות כלי הכניסה המתאים transiently נושאת את החללית הסיליקון ואת המחבר אלקטרודה במהלך תהליך ההשתלה. לקבלת כלי מותאם אישית הכניסה בנוי דוגמה, ראה איור 1 .
2. בזהירות לשחרר את הסיליקון החללית ואת אלקטרודה מחבר מאריזתו באמצעות מלקחיים שקצהו קרמיקה.
3. הרם את לוח מחבר, בצורה מאובטחת לתקן אותו עם מלחציים תנין המצורפת עמדה.
4. שימוש של סטריאוסקופ, יישר את המכשיר בעזרת הכלי הכניסה עם מלקחיים שקצהו קרמיקה. למרוח שכבה ~ 2 מ מ של פרפין שעווה מומסת עם cauterizer להדביק את החללית ההכנסה לכלי. הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה.
5. לתקן את מחבר אלקטרודה מוט של הכלי ההכנסה באמצעות דבק רגיל. שימו לב כי בהתאם ליצרן, חוטים הקרקע שאולי צריך להיות מולחמים את לוח מחבר אלקטרודה לפני ההשתלה. הסר את הבידוד של שני קטעים קצרים של חוטי נחושת בידודי לכה באמצעות פח-הלחמה להחיל עם מלחם (400 מעלות צלזיוס). הלחמה החוטים הקרקע כדי החריצים המתאימים בלוח מחבר אלקטרודה.
6. הסר את הבידוד של שני חלקים נוספים של חוטי נחושת. לעטוף כל חוט נחושת חשוף שלוש פעמים סביב בורג פלדה אל חלד (בקוטר 1 מ"מ, 2 מ מ אורך). החל שטף מתאים הלחמה פלדה, הלחמה חוט הנחושת לחלק התחתון של הכיפה בורג. לוודא כי בתחתית חצי מהשרידים חריטה ללא פח-הלחמה.
7. השתמש multimeter רגיל כדי לבדוק קשר חשמלי בין חוט בורג.
8. לחטא את שאנקס של החללית סיליקון, את הברגים הקרקע על ידי טבילה 70% אתנול (10 s).
9. להכין כיסוי מגן השתל בדיקה על ידי חיתוך ראש פלסטיק פסטר פיפטה לשניים.

2. ניתוח ההשתלה

1. לחטא כלי כירורגי (מספריים, מלקחיים שקצהו פיין, מלחציים כירורגי) עם מעקר חרוז חם. למחוק את כל המשטחים עם 70% אתנול.
2. לגרום הרדמה עם איזופלוריין 3% חמצן וכשאשר L ~ 1/min.
   1. לשימוש תחזוקה, 1-1.5% איזופלוריין. שימו לב כי ריכוז איזופלוריין הדרוש להשגת עמידות כירורגי יכול להשתנות חיה חיה.
   2. סובלנות כירורגי יציב מושגת כאשר החיה מצליח להגיב צובט את הבוהן. את קצב הנשימה של העכבר ולהתאים את ריכוז איזופלוריין במידת הצורך.
   3. להחיל משחה לעיניים של החיה כדי למנוע ייבוש.
3. לטעון את העכבר בתוך מסגרת stereotaxic בהוספת סורגים האוזן בעדינות לתוך תעלת האוזן. לאחר בראש של העכבר מתייצב בסורגים האוזן, הצב חתיכה הפה מעל החוטם למסירה איזופלוריין מתמשך. הצב את העכבר על מגבת או כרית מעל כרית החימום ולהזריק. הבופרנורפין subcutaneously (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף) כדי להבטיח נגד כאבים לאחר הניתוח.
4. לגלח את הראש מכונת הגילוח סטנדרטי, לחטא את העור עם 70% אתנול. באמצעות מספריים כירורגיים, בחתך לתוך העור לאורך הקו האמצעי של הגולגולת ופתח את העור בעזרת תופסנים כירורגי.
5. יישור ראש החיה בעזרת כלי היישור stereotaxic כדי bregma ברמה של למדא. צריך להיות פחות מ- 50 מיקרומטר בהיסט גובה בין bregma למדא. יתר על כן, רמת הראש לאורך הציר mediolateral על ידי מדידת העומק של bregma-הגולגולת על פני השטח-מוגדרים מרחקים ימינה ושמאלה (למשל, 1 מ מ שמאל ואת הזכות של bregma). כיוון ההטיה של הראש במידת הצורך.
6. לנקות את הראש עם 3% חמצן, לנגב היבש עם מגבונים סטריליים כותנה.
7. לקבוע את המיקום של הניתוח ביחס bregma שימוש הולם אטלס stereotaxic¹².
8. באמצעות ראש המקדחה 0.9 מ מ, תרגיל שני חורי הברגים העצם על המוח הקטן למיקום הברגים הקרקע והפניה. בנוסף, 1-3 חורים עגינת הברגים הם רצוי לייצב את השתל. המיקום של ברגי עיגון יהיה תלוי המיקום של הניתוח. עבור ההשתלה בהיפוקמפוס אל הצב בורגי עיגון מעל קליפת חזיתית הקודקוד ואת חולשת contralateral. הכנס את הברגים העצם באמצעות מברג מתאים. הקפידו לא לחדור לתוך המוח.
9. לבצע את הניתוח על ידי דילול לאט את הגולגולת עם התרגיל באזור מלבני מהצד השרשה. לעתים קרובות להרטיב את העצם עם מאגר פוספט סטיריליים (PB). הגולגולת ורקמת הנותרים יכולים להיות בעדינות פירסינג והוציאו בעזרת מחט ההזרקה (27 גרם) בסדר גמור וזוג פינצטה.
10. בזהירות פירס קרום הדורה עם מחט דקה של הזרקה (27 גרם). טופס קרס קטנה על-ידי כיפוף קצה המחט עם זוג מספריים ומשוך את דורא להסרת. החל PB כדי למנוע את פני השטח של המוח ממנו להתייבש.
11. הר הכלי ההכנסה אלקטרודה על בעל stereotaxic, אפס את המכשיר על bregma, וזוזי החללית לקואורדינטות stereotaxic הניתוח אט-אט לחדור את פני השטח של המוח. ודא שהמוטות בדיקה לא מתכופף. הימנע להשתיל דרך כלי הדם.
12. הורידו לאט את המכשיר עד מיקרומטר ~ 200 מעל העומק הרצוי. מכסים את הגולגולת ואת שאנקס של המכשיר סיליקון עם וזלין סטיריליים להגנה. החל מלט שיניים כדי לתקן את הבסיס של המכשיר כדי הבורג עגינת בגולגולת.
13. מיד לאחר יישום מלט, לאט הניעו את החללית אל העומק היעד. קידום של מיקרומטר אחרונה 200 ~ לאחר היישום של הצמנט מפחית לרוחב תנועת החללית ומבטיחה נזק מינימלי לרקמות באזור המטרה. שימו לב כי הזמן ריפוי של הבטון המשמש יכול להשפיע על שלב זה של הפרוטוקול. עם במהירות ריפוי מלט, להשמיט את שלב זה, ישירות שתל החללית לעומק היעד כדי למנוע נזק החללית סיליקון.
14. לאחר ריפאה הבטון, שחרר את החללית של הכלי הכניסה על ידי המסת השעווה עם cauterizer.
15. לשחרר את לוח מחבר מהמכשיר ההכנסה והצב אותו למקום מתאים על הגולגולת באמצעות מלחציים תנין מחוברת ידית ההכנסה. במקרה של בדיקה ההשתלה בהיפוקמפוס אל המקום את לוח מחבר על בדופן העצם contralateral. לתקן את לוח מחבר לגולגולת באמצעות מלט שיניים.
16. הלחמה את החוטים הקרקע והפניה של הלוח מחבר לרדיו המצורפת את שני הברגים על המוח הקטן.
17. לקצץ את מכסה מגן בגובה הנכון ומניחים אותו מעל החללית סיליקון. לתקן את מכסה לוח מחבר ואת הגולגולת באמצעות מלט שיניים, הימנעות העור סביב הגולגולת חשוף. תפירת העור סביב אתר ההשתלה בדרך כלל לא נדרש.

3. ההחלמה לאחר הניתוח

1. החל הטיפול המתאים להרגעה לפחות 2 ימים (למשל זריקות תת עורית של הבופרנורפין כל 6 שעות במהלך היום, במי השתייה בן לילה בשילוב עם carprofen (4-5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) subcutaneously כל 24 שעות). יחיד-דיור מומלץ כדי למנוע נזק השתל.
2. אפשר לפחות שבוע להתאוששות. התייעץ עם הנחיות רווחת בעלי חיים מקומיים.

4. קירור והקפאה

1. LFPs שיא לנוע בחופשיות עכברים באמצעות מערכת רכישת נתונים מתאימים מחוברים דרך קומוטטור. לרכוש LFPs, השתמש תדר דגימה של 1-5 קילו-הרץ. שיעור דגימה גבוה יותר (20-30 kHz) נדרשים אם יחידה אחת הפרשות שיירשמו יחד עם LFP.
2. לאחסן קבצי raw הקלטה של והערוצים לניתוח במצב לא מקוון.

5. היסטולוגיה

1. לאחר השלמת ההקלטה, עמוק עזים ומתנגד החיה (למשל 2 g/kg הגוף משקל urethane מוזרק intraperitoneally). לאשר המדינה הרדמה על ידי חוסר תגובה שאורך צובט.
2. Perfuse transcardially את העכבר עם קרח באגירה פוספט תמיסת מלח (~ 1 דקות) ואחריו 4% paraformaldehyde (~ 10 דקות) באמצעות שיטות זלוף intracardial תקן¹³. לפני זלוף, lesioning electrolytic האתרים הקלטה אולי על ידי שבוצעה (למשל על-ידי החלת 10-20 V של מתח מתמיד עד 1 s). לחלופין, צבעי פלורסנט חלה על העצות shank לפני ההשתלה יכול לשמש כדי לעקוב אחר זיהוי. בדיקות בשיטות שונות לצורך זיהוי עמדות אלקטרודה כדי להשיג תוצאות אופטימליות עם סוגים שונים של סיליקון הגששים מומלץ.
3. לחתוך חלקים במוח (~ 100 מיקרומטר) ו מכתים את הפרוסות עם 4'-6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, µg 1/mL) ואחריו שלושה צעדים כביסה ב PB (כל 10 דקות בטמפרטורת החדר).
4. במקום הסעיפים על שקופית מיקרוסקופ, להחיל טיפה של הטמעת בינונית ולכסות המקטע עם מכסה. תן את ההטבעה לילה יבש בינוני בטמפרטורת החדר.
5. באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, לזהות את המיקום של האתרים הקלטה.
6. ניסיון שחזור של המכשיר סיליקון להמשך השימוש, להחזיק את המכשיר עם מלחציים תנין ולשחרר את המכשיר מ לחתור בהתכה בקפידה את הבטון שיניים במלחם (400 מעלות צלזיוס). הקפידו לא נוגעים של שנקס בדיקה במהלך הליך זה!
7. לשטוף את המכשיר במים מזוקקים חם (~ 80 מעלות, 15 דקות) ואחריו פתרון אנזימטי (1% Tergazyme במים מזוקקים, 30 דקות בטמפרטורת החדר) וצעד נוסף כביסה במים מזוקקים (15 דקות). שימו לב כי שיעור ההצלחה של בדיקה התאוששות נמוך.

6. CSD ניתוח

1. באמצעות סביבת ניתוח מתאים (למשל פיתון), המרת הנתונים LFP של shank בודדים כדי CSD על ידי קירוב הנגזרת המרחבית השנייה לאורך הדוקרן כמו
   
   איפה LFP_{n, t} הוא האות LFP על האלקטרודה^th nבזמן t וδz המרווח בין אלקטרודה. שים לב כי עקב n-1 פעולות n+1, CSD של האלקטרודות הראשון והאחרון של הדוקרן ניתן לאמוד, אשר צריכה להילקח תחת שיקול במהלך בדיקה השמה. ליישם את הנוסחה קירוב באמצעות קטע קצר של קוד מחשב את האות CSD עבור כל אלקטרודה תוך איטראציה לאורך זמן (ראה קובץ קוד משלים).
2. השתמש את האות CSD שהושג עבור ניתוח נוסף (למשל, לומדת תדר מסוים להקות של תנודות המוח על-ידי החלת הלהקה לעבור מסננים).

תוצאות

איור 1 מדגימה את הכלי ההכנסה שימוש עבור ההשתלה של הגששים סיליקון. הקלטות סיליקון כרוני מושתל רגשים פילוח האזור CA1, השכבה תא גרגר של הכישור משוננת מוצגים באיור2. הקלטנו LFPs מ שאנקס בדיקה במהלך תנועה חופשית ב homecage. כדי למזער את ההשפעה של אמצעי ה...

Discussion

הגדלת עדויות מציינים כי תנודות המוח במעגלים עצביים בהיפוקמפוס להתרחש דיסקרטית תחומים מרחבי^10,11,16. CSD ניתוח מפחיתה באופן דרסטי את השפעת אמצעי הולכה, תנאי חיוני לצורך המחקר של אירועים מקומיים תנודה. עם וידאו זה, אנו מספקים מדריך כדי להשתיל ס?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crocodile clamp with stand	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Silicon probe	Cambridge Neurotech	P-series 32
Stereoscope	Olympus	SZ51
Varnish-insulated copper wire	Bürklin Elektronik	89 F 232
Ground screws	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
Flux	Stannol	114018
Ceramic-tipped forceps	Fine Science Tools	11210-60
Paraffine Wax	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00
Soldering iron	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimeter	Uni-T	UT61C
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Pasteur pipettes	Carl Roth	EA65.1
Heat sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 1900
Stereotaxic electrode holder	David Kopf	Model 1900
Isoflurane	Abbvie	B506
Oxygen concentrator	Respironix	1020007
Buprenorphine	Indivior UK Limited
Electrical shaver	Tondeo	Eco-XS
Heating pad	Thermolux	463265/-67
Surgical clamps	Fine Science Tools	18050-28
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009
Sterile cotton wipes	Carl Roth	EH12.1
Drill	Proxxon	Micromot 230/E
21G injection needle	B. Braun	4657527
Phosphate buffer/phosphate buffered saline
Stereotaxic atlas	Elsevier	9.78012E+12
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11
Surgical forceps	Fine Science Tools	11272-40
27G injection needles	B. Braun	4657705
Vaseline
Dental cement	Sun Medical	SuperBond T&M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Recording amplifier	Intan Technologies	C3323
USB acquisition board	Intan Technologies	C3004
Recording cables	Intan Technologies	C3216
Electrical commutator	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW
Acquisition software	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	allows platform-independent data acquisition
Computer for data acquisition
Analysis environment	Python (www.python.org)		allows platform-independent data analysis
Urethane	Sigma-Aldrich
Vibratome	Leica	VT1000
Microscope slides	Carl Roth	H868.1
Cover slips	Carl Roth	H878.2
Embedding medium	Sigma-Aldrich	81381-50G
Distilled water	Millipore	Milli Q	Table-top machine for the production of distilled water
Tergazyme	Alconox	Tergazyme