Dağınık şekilde kayıt sınırlı salınım oluşur içinde fareler davranmak

Özet

Bu iletişim kuralı yerel alan potansiyelleri ile çoklu şaftlı doğrusal silikon sondalar kayıt açıklar. Geçerli kaynak yoğunluk analiz kullanarak sinyalleri dönüşüm yerel elektrik etkinlik yeniden inşası farenin hipokampus sağlar. Bu teknik ile dağınık şekilde kısıtlı beyin salınımlarını serbestçe fare hareket okudu olabilir.

Özet

Yerel alan potansiyel (LFP) den iyon hareketleri sinirsel membranlar arasında çıkar. Beyin dokusu büyük miktarda toplam elektrik alanı LFP elektrotlar tarafından kaydedilen gerilim yansıtır beri yerel etkinlik hakkında bilgi ayıklama meydan okuyor. Nöronal Mikri şemalar okuyan, ancak, gerçekten yerel etkinlikler ve uzak beyin alanlarında kaynaklanan cilt yürütülen sinyalleri arasında güvenilir bir ayrım gerektirir. Geçerli kaynak yoğunluğu (CSD) analiz geçerli lavabolar ve elektrotlar civarında kaynakları hakkında bilgi sağlayarak bu sorunu için bir çözüm sunuyor. Beyin alanlarda laminer cytoarchitecture hipokampus gibi tek boyutlu CSD LFP ikinci kayma türevi hesaplanıyor tarafından elde edilebilir. Burada, dorsal hipokampus implante doğrusal silikon sondalar kullanarak kayıt multilaminar LFPs için bir yöntemi açıklanmaktadır. CSD izlemeler sonda bireysel shanks hesaplanır. Bu iletişim kuralı böylece serbestçe fare hareket dağınık şekilde sınırlı nöronal ağ salınım oluşur içinde çözmek için bir yordam açıklanır.

Giriş

LFP salınımlarını kritik bilgi işlem tarafından nöronal devreler katılmaktadırlar. Bunlar frekanslar, yavaş dalgalar (~ 1 Hz) hızlı dalgalanma salınımları (~ 200 Hz)¹' e kadar geniş bir yelpazede kapsar. Farklı frekans bantlarında bellek, duygusal işleme ve gezinti^2,3,4,5,6,7gibi bilişsel fonksiyonları ile ilişkilidir. Nöronal membranların genelinde geçerli akış LFP sinyal⁸en büyük bölümünü oluşturmaktadır. (Şarj hücre dışı ortama bırakır gibi) hücre (Örneğin glutamatergic eksitatör sinapslarda aktivasyonu üzerinden) girerek Özellikler etkin bir geçerli alıcıyı temsil eder. Buna ek olarak, örneğin tarafından GABAergic inhibitör sinapslarda, aktivasyonu hücre dışı ortama olarak pozitif net akışı etkin bir geçerli kaynak bu konumda gösteriyor. Nöronal dipoller içinde geçerli lavabolar ve tersi pasif kaynakları ile membran şarj uzak sitelerdeki etkileyen akımlar dengelemesi nedeniyle eşleştirilmiş.

Uzaktan nöral işlemler tarafından üretilen elektrik alanı da önemli voltaj deplasmanlar kayıt elektrot üzerinde neden olabilir ve böylece yanlışlıkla yerel bir olay olarak kabul olabilir. Bu ses iletim LFP sinyalleri yorumlanması için ciddi bir meydan okuma teşkil etmektedir. CSD analiz sinyalleri ve bu nedenle cilt ve tel⁸etkisini azaltmak için bir araç oluşur yerel geçerli lavabo ve LFP temel kaynakları hakkında bilgi sağlar. Lamine yapılarda oluşur gibi tek boyutlu CSD sinyalleri tarafından düzenlenmiş eşit uzaklıkta Elektrotlar dikey laminer uçak⁹' a kaydedilen LFP ikinci kayma türevi alınabilir. Piyasada bulunan doğrusal silikon sondalar gelişiyle araştırmacılar eğitim hipokampüs faaliyete yerel salınım CSD yöntem kullanmak için izin verdi. Örneğin, farklı gama salınımlarını CA1 alan¹⁰katman özgü şekilde ortaya kanıtlanmıştır. Ayrıca, CSD analiz dentat gyrus¹¹asıl hücre tabakası faaliyete gama bağımsız sıcak noktalar tespit etti. Önemlisi, bu bulgular sadece yerel CSD ama değil LFP sinyalleri belirgin değildi. CSD analiz böylece hipokampüs microcircuit operasyonlarında anlayış kazanmak için güçlü bir araç sağlar.

Bu protokol için silikon sondalar ile tek boyutlu CSD sinyalleri almak için kapsamlı bir rehber sağlar. Bu yöntemler davranıyor fareler hipokampus yerelleştirilmiş salınım olayları araştırmak kullanıcıların olanak tanır.

Protokol

Tüm yöntemleri yaşayan hayvanları içeren Regierungspräsidium Freiburg Alman hayvan refah Yasası uyarınca tarafından onaylanmıştır.

1. hazırlıkları

1. Tasarım ve silikon sonda ve elektrot bağlayıcı implantasyon işlemi sırasında geçici taşıyan bir uygun ekleme aracı inşa. İçin bir örnek özel yapılı ekleme aracı bkz: Şekil 1 .
2. Dikkatlice ambalajından seramik uçlu forseps kullanarak silikon sonda ve elektrot konektöründen serbest bırakın.
3. Bağlayıcı kartını çıkarın ve güvenli bir şekilde bir stand için bağlı bir timsah kelepçe ile düzeltmek.
4. Bir stereoscope kullanarak, sondayı ekleme aracı ile seramik uçlu forseps ile hizalayın. Sonda ekleme aracı için tutkal bir cauterizer ile erimiş parafin bir ~ 2 mm tabaka uygulayın. Bu işlem sırasında sonda shanks dokunmak ilgilen.
5. Standart yapışkan bant kullanarak ekleme aracı mili elektrot konektöre düzeltmek. Not üreticiye bağlı olarak, zemin teller implantasyon öncesinde elektrot bağlayıcı kuruluna lehimli gerekebilir. Yalıtım bakır tel vernik izolasyonlu Kalay lehim lehimleme demir (400 ° C) ile uygulanan kullanarak iki kısa parçaları kaldırın. Elektrot bağlayıcı kurulu uygun yuvaları için zemin teller lehim.
6. İki ek parça bakır tel izolasyon kaldırın. Üç kez etrafında bir paslanmaz çelik vida (1 mm çapında, 2 mm uzunluk) her çıplak bakır tel sarın. Akı çelik Lehimleme için uygun uygulamak ve vidalı kapak altına bakır tel lehim. Emin olun alt yarısı vida dişi kalıntılarının Kalay lehim ücretsiz.
7. Standart bir multimetre tel ve vida arasında elektriksel temas denetlemek için kullanın.
8. % 70 etanol daldırma tarafından silikon sonda ve zemin vida shanks dezenfekte (10 s).
9. Bir koruyucu kapak sonda implant için bir plastik Pasteur pipet Başkanı ikiye keserek hazırlayın.

2. implantasyonu ameliyatı

1. Cerrahi aletler (makas, ince uçlu forseps, cerrahi kelepçeler) sıcak boncuk ısıtıcı ile sterilize. Yüzeylerin % 70 etanol ile silin.
2. Anestezi % 3 isoflurane ~ 1 L/dak teslim oksijen ile neden.
   1. Bakım için 1-%1.5 isoflurane kullanın. İsoflurane konsantrasyon cerrahi tolerans ulaşmak için gereken Not hayvan hayvan değişebilir.
   2. Hayvan parmak pinching için yanıt vermek başarısız olduğunda istikrarlı cerrahi toleransı elde edilir. Fare solunum hızı izlemek ve isoflurane konsantrasyonu ayarlayın.
   3. Hayvanın gözleri kurumasını önlemek için merhem uygulamak.
3. Stereotaksik bir çerçeve içinde fare yavaşça belgili tanımlık kulak kanal kulak çubukları ekleyerek bağlayın. Fare Başkanı kulak çubuklarıyla stabil bir kez, bir ağız parçası sürekli isoflurane teslimat için burun üzerine getirin. Fare havlu veya yastık ısıtma yastığını yerleştirin ve buprenorfin subkutan enjekte (ameliyat sonrası analjezi sağlamak için 0,05 - 0,1 mg/kg vücut ağırlığı).
4. Standart bir tıraş makinesi ile kafasını tıraş ve cilt % 70 etanol ile dezenfekte. Cerrahi makas kullanarak, kafatasının orta çizgi boyunca deri içine bir kesi yapmak ve deri cerrahi kelepçeler kullanarak açın.
5. Hayvan kafasını düzey bregma ve lambda stereotaksik hizalama araç yardımı ile hizalamak. 50'den az µm arasında bregma ve lambda yükseklik uzaklığı olmalıdır. Ayrıca, tanımlanan düzeye, başından bregma kafatası, gelen Derinlik ölçme tarafından medyolateral eksen boyunca yüzeye mesafeler sol ve sağ (Örneğin, 1 mm sol ve sağ tarafında bregma). Baş eğim ayarlayın.
6. %3 hidrojen peroksit ile baş temiz ve steril pamuk mendil ile Kuru silin.
7. Kranyotomi bir uygun stereotaksik atlas¹²kullanarak bregma göre konumunu belirler.
8. Bir 0.9 mm matkap kafası kullanarak, iki vida kemik zemin ve başvuru vida yerleştirmek için beyincik üzerinde delik. Ayrıca, 1-3 delik ankraj cıvataları için altlık disk implant dengelemek için arzu edilir. Bağlantı vidaları konumunu kranyotomi konumuna bağlıdır. Hipokampüs içine implantasyon için üzerinde kontralateral parietal ve Ipsilateral frontal korteks bağlantı vidaları yerleştirin. Uygun bir tornavida kullanarak kemik vidaları yerleştirin. Beynine nüfuz değil için dikkat ediniz.
9. Kranyotomi implantasyon yan etrafında dikdörtgen bir alanda matkap ile yavaş yavaş kafatası incelmesi gerçekleştirin. Sık sık kemik sterilize edilmiş fosfat tampon (PB) ile nemlendirin. Kalan inceltilmiş kafatası yavaşça deldi ve ince (27 G) enjeksiyon iğne ve bir çift cımbız yardımıyla kaldırıldı.
10. Dikkatle dura mater bir ince (27 G) enjeksiyon iğneyle delip. İğne ucu cımbız bir çift ile bükme tarafından küçük bir kanca oluşturur ve beyin zarı çıkarılması için çekin. PB beyin yüzey kurumasını önlemek için geçerlidir.
11. Stereotaksik bir tutucu elektrot ekleme aracı montaj, bregma tarihinde sonda sıfır ve sonda stereotaksik koordinatları kranyotomi üzerinde taşımak. Yavaş yavaş beyin yüzeye nüfuz. Sonda milleri değil viraj emin olun. Kan damarları Reproduction kaçının.
12. Yavaşça sonda ~ 200 µm yukarıda istenen derinlik kadar indirin. Kranyotomi ve shanks sterilize vazelin ile silikon inceleyebilirsek koruma için kapağı. Diş çimento demir vida için sonda Bankası kafatasında düzeltmek için geçerlidir.
13. Şu çimento uygulamadan sonra yavaş yavaş hedef derinlik de sonda taşımak. Sonra uygulama çimento sonda yanal hareketi azaltır ve minimal doku hasarı hedef alan sağlar son ~ 200 µm ilerleyen. Not kullanılan çimento kür zaman bu adımı Protokolü'nün etkileyebilir. Hızlı bir şekilde kür çimento, bu adımı atlayın ve doğrudan zarar görmemesi için silikon sonda için hedef derinlik için sonda implant.
14. Çimento tedavi vardır sonra balmumu ile bir cauterizer erime ekleme aracı sonda bırakın.
15. Ekleme aygıt bağlayıcı Kurulu yayın ve ekleme işleyiciye bağlı bir timsah kelepçe kullanarak kafatası üzerinde uygun bir yerde konumlandırın. Hipokampüs içine sonda implantasyon durumunda kontralateral paryetal kemik üzerinde bağlayıcı kartını yerleştirin. Diş çimento kullanarak kafatası bağlayıcı kuruluna düzeltmek.
16. İki vidayı beyincik üzerinde bağlı kablo bağlayıcı gemide zemin ve başvuru teller lehim.
17. Doğru yüksekliği için koruyucu kapak trim ve silikon sonda yerleştirin. Bağlayıcı kartına ve diş çimento, maruz kafatası çevresindeki deri kaçınarak kullanarak Kafatası kapağını düzeltmek. İmplantasyon site çevresindeki deri dikiş genellikle gerekli değildir.

3. ameliyat sonrası kurtarma

1. En az 2 gün (Örneğin subkutan enjeksiyonlari buprenorfin her 6 h gündüz sırasında ve içme suyu gecede carprofen (4-5 mg/kg vücut ağırlığı) ile kombine subkutan her 24 h) için uygun analjezik tedavi uygulanır. Tek-konut için implant zarar önlemek için önerilir.
2. Kurtarma için en az bir hafta izin. İle yerel hayvan refah genel kurallara bakın.

4. veri toplama

1. Kayıt LFPs bir komütatör bağlı bir uygun veri toplama sistemi kullanarak fareler serbestçe hareket. LFPs elde etmek için 1-5 kHz örnekleme sıklığı kullanmak. Tek-unit deşarj LFP ile birlikte kaydedilecek daha yüksek örneklendirme oranı (20-30 kHz) gereklidir.
2. Çevrimdışı analiz için tek tek kanalları ham kayıt dosyaları depolar.

5. Histoloji

1. Kayıt tamamlandıktan sonra derin hayvan (intraperitoneally enjekteÖrneğin 2 g/kg vücut ağırlığı üretan) anestezi. Anestezik devlet pinching tırnağa yanıt eksikliği onaylayın.
2. Fare transcardially standart intracardial perfüzyon yöntemleri¹³kullanarak % 4 paraformaldehyde tarafından (~ 10 dk) ardından buz gibi fosfat tamponlu tuz (~ 1 dk) ile sıvı. Perfüzyon önce kayıt sitelerin elektrolitik lesioning tarafından gerçekleştirilen (10-20 V sabit voltaj 1 için uygulayarakÖrneğin s). Alternatif olarak, implantasyon kimlik izlemek için kullanılmadan önce floresan boyalar için şaftlı ipuçları uygulanan. Silikon sondalar farklı tipleri ile en iyi sonuçları elde etmek için elektrot pozisyonları tanımlaması için çeşitli yöntemler test tavsiye edilir.
3. Beyin bölümleri (~ 100 µm) kesme ve dilimleri 4'-6-diamidino-2-PB (her 10 dakika oda sıcaklığında) üç yıkama adımda takip phenylindole (DAPI, 1 µg/mL) ile leke.
4. Bölümleri bir mikroskop slaytta yer, orta katıştırma bir damla uygulamak ve bir kapak notu bölümle kapak. Oda sıcaklığında gömme orta kuru gecede izin.
5. Bir epifluorescence veya confocal mikroskop lazer tarama kullanarak kayıt siteleri konumunu belirleyin.
6. Daha fazla kullanım için silikon sonda düzeltmeye çalış için sonda bir timsah kelepçe ile tutun ve dikkatli bir havya (400 ° C) ile diş çimento erime sonda gelen kürek bırakın. Bu işlem sırasında sonda shanks dokunmak kendine iyi bak!
7. Enzimatik solüsyona tarafından takip sonda (~ 80 ° C, 15 dk) sıcak distile suda yıkayın (%1 Tergazyme distile su, oda sıcaklığında 30 dakika) ve başka bir çamaşır adım distile su (15 dk). Sonda kurtarma başarı oranını düşük olduğuna dikkat edin.

6. CSD Analizi

1. Bir uygun analiz ortamı (Örneğin Python), ikinci kayma türevi bıçak boyunca yaklaşıldığıdır tarafından bireysel bir şaft CSD için dönüştürme LFP verileri kullanarak
   
   Burada LFP_{n, t} zaman t n^th elektrot LFP İşaretimle, Δz arası elektrot aralığı. N-1 ve n+ 1 işlemleri nedeniyle, bıçağı ilk ve son elektrotlar CSD, sonda yerleştirme sırasında dikkate alınacak olan tahmin edilebilir değil olduğunu unutmayın. Zaman içinde (bakınız ek kod dosyası) yineleme sırasında elektroda CSD işaretimi hesaplar kod kısa bir parçasını kullanarak yaklaşım formül uygulamak.
2. Elde edilen CSD sinyal daha fazla analiz (bant geçiren filtre uygulayarak belirli frekans bantlarında beyin titreşimler, eğitimÖrneğin, ) kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1 ekleme aracı silikon sondalar implantasyon için kullanılan göstermektedir. Kayıtları kronik implante silikon sondalar CA1 alan hedefleme ve dentat gyrus granül hücre tabakası Şekil 2' de gösterilmiştir. LFPs sonda shanks--dan homecage içinde serbest dolaşımı sırasında kaydettik. Cilt ve tel etkisini en aza indirmek için elde edilen sinyalleri sonda (Şekil 2BD

Tartışmalar

Artan kanıtlar beyin salınım içinde hipokampal nöronal devreler ayrık mekansal etki^10,11,16' meydana gösterir. CSD analiz cilt ve tel, yerel salınım olaylar çalışma için çok önemli bir önkoşul etkisi önemli ölçüde azaltır. Bu video ile biz silikon sondalar CSD veri analizi için farenin hipokampus içine yerleştirilmesi için bir kılavuz sağlar. CA1 ve dentat gyrus yerelleştirilmiş gama salınım keski...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Crocodile clamp with stand	Reichelt Elektronik	HALTER ZD-10D
Silicon probe	Cambridge Neurotech	P-series 32
Stereoscope	Olympus	SZ51
Varnish-insulated copper wire	Bürklin Elektronik	89 F 232
Ground screws	Screws & More GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
Flux	Stannol	114018
Ceramic-tipped forceps	Fine Science Tools	11210-60
Paraffine Wax	Sigma-Aldrich	327204
Cauterizer	Fine Science Tools	18010-00
Soldering iron	Kurtz Ersa	OIC1300
Multimeter	Uni-T	UT61C
Ethanol	Carl Roth	9065.1
Pasteur pipettes	Carl Roth	EA65.1
Heat sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Stereotaxic frame	David Kopf	Model 1900
Stereotaxic electrode holder	David Kopf	Model 1900
Isoflurane	Abbvie	B506
Oxygen concentrator	Respironix	1020007
Buprenorphine	Indivior UK Limited
Electrical shaver	Tondeo	Eco-XS
Heating pad	Thermolux	463265/-67
Surgical clamps	Fine Science Tools	18050-28
Hydrogen peroxide	Sigma-Aldrich	H1009
Sterile cotton wipes	Carl Roth	EH12.1
Drill	Proxxon	Micromot 230/E
21G injection needle	B. Braun	4657527
Phosphate buffer/phosphate buffered saline
Stereotaxic atlas	Elsevier	9.78012E+12
Surgical scissors	Fine Science Tools	14094-11
Surgical forceps	Fine Science Tools	11272-40
27G injection needles	B. Braun	4657705
Vaseline
Dental cement	Sun Medical	SuperBond T&M
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50mg/ml
Recording amplifier	Intan Technologies	C3323
USB acquisition board	Intan Technologies	C3004
Recording cables	Intan Technologies	C3216
Electrical commutator	Doric lenses	HRJ-OE_FC_12_HARW
Acquisition software	OpenEphys (www.open-ephys.org)	GUI	allows platform-independent data acquisition
Computer for data acquisition
Analysis environment	Python (www.python.org)		allows platform-independent data analysis
Urethane	Sigma-Aldrich
Vibratome	Leica	VT1000
Microscope slides	Carl Roth	H868.1
Cover slips	Carl Roth	H878.2
Embedding medium	Sigma-Aldrich	81381-50G
Distilled water	Millipore	Milli Q	Table-top machine for the production of distilled water
Tergazyme	Alconox	Tergazyme