מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה יעיל עבור חילוץ ו כימות של קפאין ב השעיות תא של ערביקה ג ל' ואת תהליך ניסיוני להערכת הפעילות האנזימטית מתרחשת של קפאין סינתאז עם רמת ביטוי הגן המקודד אנזים זה.

Abstract

קפאין (1,3,7-trimethylxanthine) הוא אלקלואיד פורין נוכח משקאות פופולריים כמו קפה ותה. מטבוליט המשני הזה נחשב הגנה כימית בגלל זה יש פעילות מיקרוביאלית, והוא נחשב של חרקים טבעי. קפאין יכול לייצר גם השפעות שליליות allelopathic למנוע את התפתחותם של צמחים שמסביב. בנוסף, אנשים ברחבי העולם צורכים קפאין על השפעותיו להרגעה, מופחתים. בשל עניין היישומים הטכנולוגיים של קפאין, מחקר על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של מתחם זה גדל. מחקרים אלה התמקדו בעיקר הבנת המנגנונים הביוכימי והמולקולרי המסדירים ביוסינטזה של קפאין. במבחנה תרביות רקמה הפכה מערכת שימושי ללמוד מסלול זה biosynthetic הוחלף נגזר. מאמר זה יתאר פרוטוקול צעד אחר צעד עבור כימות של קפאין, מדידת הרמות את התעתיק של הגן (CCS1) אשר קידוד קפאין סינתאז (CS) ב השעיות תא של ערביקה ג ל, כמו גם את פעילותה.

Introduction

קפאין הוא מטבוליט משני זה biosynthesized על-ידי צמחים הסוג קפה¹. אלקלואיד הזה שייך למשפחת methylxanthine, נחשב כהגנה מפעל כימי כי הוא יכול להתנהג מול ההשפעות השליליות של גורמי מחלה, אוכלי עשב^2,3. בנוסף, מטבוליט זו אחראית על מאפייני מגרה לשתות קפה, אשר הוא נצרך בדרך כלל עולמית^4,5. בשל תכונותיו, מספר קבוצות מחקר מעוניינות ללמוד את מסלול biosynthetic הוחלף נגזר ולבצע קטבוליזם של קפאין^6,7. כיום, המפעל במבחנה תרבויות תא/רקמות לשמש אלטרנטיבה להערכת קפאין הצטברות תחת אסטרטגיות והאביוטיים ביוטיים שונים^8,9.

קפאין ביוסינטזה מערבת את שחרור hydrolytic של 7-methylxanthine nucleoside ריבוז המתאים ואחריו מסודרות N-methylations-עמדות 3 ו- 1. ספציפית S- adenosyl מתיונין (SAM)-N התלויים-(nmt ב) methyltransferase מזרז מתילציה במיקום 7, ואילו תאוברומין סינתאז (TS) במדעי המחשב הם מעורבים ב 3 - ו 1-methylations, בהתאמה, בהפקת תאוברומין ו קפאין. המחקר של גנים קידוד NMTs ברורים אפשרה להבנת המנגנון המווסת קפאין ייצור^10,11. הפקולטה למדעי המחשב, אשר יש N -פעילות methyltransferase, מזרז את שני השלבים האחרונים של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין¹¹. בשתילי עץ הקפה, הוכח כי קרינה אור יכול להגביר פעילות בפקולטה למדעי המחשב, כשהתוצאה היא עלייה ביוסינטזה קפאין. לאחרונה, הראינו כי שמירה על התא השעיות של ערביקה ג ל' תחת אור הקרנה היא התנאי האופטימלית להערכת ההשפעות המייצרים והאביוטיים גורמים להשפיע על מסלול biosynthetic הוחלף נגזר של קפאין⁸. המידע הנקלט במחקרים אלה ייתכן יישומים בביולוגיה מערכות והנדסה מטבולית עבור למקסם את המחקר של הנתיב biosynthetic הוחלף נגזר קפאין במערכות כאלה במבחנה .

לאור היתרונות של קבלת מודל מתאים לצורך המחקר של קפאין ביוסינטזה, אנחנו ממוטב תנאי מיצוי קפאין על התא המתלים של ערביקה ג ל' היה זה גם אפשר לפתח פרוטוקול שימושי ללמוד את פעילות אנזימטי וכן את השלבים מתודולוגי להערכת רמת גן תעתיקים של קפה קפאין סינתאז 1 (CCS1) קידוד אנזים זה. במסמך זה, אנו מדווחים על פרוטוקול כדי לחלץ ולכמת קפאין ב השעיות תא ערביקה ג על ידי שכבת דק ו- densitometry (TLC-densitometry).

Protocol

1. קפאין החילוץ ב השעיות תא של ערביקה ג ל'

1. השתמש ערביקה ג תא המתלים⁹. לשמר את המתלים על-ידי התרבויות דו-שבועיים בינוני Murashige ו- Skoog ב- pH 4.3 עם 100 סל"ד קבוע רועד 25 ° c תחת תאורה רציפה (8.3 W/m²).
2. לקצור את התאים תחת ואקום סינון באמצעות נייר סינון נקבובית מיקרומטר 11 ומשפך בוכנר.
3. לרשום את המשקל טריים של התאים שנאספו באמצעות סרגל, עטפי אותם בנייר אלומיניום, להקפיא אותם בחנקן נוזלי ולשמור אותם ב-80 מעלות צלזיוס עד הניתוח.
4. Lyophilize את החומר הסלולר קפוא עבור 72 h.
5. לרשום את המשקל של התאים lyophilized כדי לאמוד את התשואה משקל יבש.
6. לאחסן את החומר אבקת שקיות פוליאתילן לשימוש חוזר (9 ס"מ על 7.5 ס"מ). Macerate את החומר אבקה, בחנות desiccator עד השימוש.
7. למדוד 0.5 גרם של חומר יבש הסלולר בסולם אנליטי ולהוסיף אותו בקבוקון זכוכית (25 מ ל).
   1. להוסיף 10 מ של אצטון על התאים lyophilized ולערבב במיקסר מערבולת ב-30 s עבור המגון. לאחר מכן, חותם את הבקבוקון ברדיד אלומיניום.
   2. מערבבים-100 סל"ד באמצעות מסובב בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 5 שעות.
8. העברת כל החומר צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 13,000 x g עבור 10 דקות העברת הנוזל שלב לרכבת התחתית החדשה ולהפחית את זה יובש בטמפרטורת החדר בשכונה fume.
9. Resuspend הדגימה עם 25 µL של אצטון.

2. התנאים ההערכה של קפאין על ידי דק שכבה כרומטוגרפיה (TLC)-Densitometry

1. 1 µL של התמצית קפאין בעבר resuspended חלות על השלב נייח.
   הערה: סיליקה ג'ל צלחות (F254) משמשים שלב נייח. לפני החלת הדגימות, הלוחות פותחו עם 10 מ"ל של כלורופורם-מתנול [9:1 v/v] בתוך תא כרומטוגרפיה (14 ס מ x 12 ס"מ x 9.5 ס מ), הצלחות היו מיובשים בטמפרטורת החדר. המאפיינים של צלחת כרומטוגרפי שבו מוחלות הדגימות מוצגים באיור1. החדר היה רווי למשך 30 דקות עם הממס לפני לפתח את הצלחת. צלחות TLC צריך לטפל באמצעות כפפות כדי למנוע זיהום.
2. לפתח את TLC בתא גזים עם 10 מ"ל של שלב ניידים ציקלוהקסאן-אצטון [40:50 וי/v].
   הערה: תערובת זו מאפשר ההפרדה של קפאין-גורם השמירה (Rf) של 0.34.
   1. הסר את לוחית TLC מן החדר ולתת לו להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.
3. דמיינו קפאין להקות באור אולטרה סגול באורך גל קצר (UV, 254 ננומטר). השתמש מנורת UV קומפקטי. בנוסף, בשלב זה, השתמש משקפי עם הגנת UV.
4. לכמת רמות הקפאין על ידי densitometry ב 273 ננומטר. הכלי נשלט עם בדיקות תוכנה.

3. חומצה ריבונוקלאית (RNA) בידוד

1. קח את המתלים תא מ שלב 1.1 ופילטרט של ואקום עם נייר סינון (11 µm גודל הנקבוביות).
2. לאסוף את החומר הסלולר נייר הסינון, שוקל לצאת 0.5 גר' חומר הסלולר על איזון האנליטי, תכניסו אותו רדיד אלומיניום. להקפיא את הדגימה עם נוזל N₂.
3. Macerate את דגימת תאים במרגמה פורצלן עם חנקן נוזלי ולהוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד RNA ובודקים.
   הערה: לעקר את הפגזים פורצלן תנור לעמעם ב 300 ° C עבור 6-אייץ RNA בידוד ריאגנט מכיל פנול, guanidine isothiocyanate ורכיבים אחרים.
   1. העברת µL 500 מדגם צינור microcentrifuge סטרילי (1.5 מ ל). הוסף µL 300 באלכוהול כלורופורם-isoamyl (24:1) ו- 300 μL של equilibrated פנול (pH 8.0).
4. לערבב את הדגימה עם מערבל מערבולת, אז centrifuge זה ב x 20,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C.
5. העברת μL 300 השלב העליון צינור microcentrifuge. להוסיף 200 μL של אלכוהול איזופרופיל. דגירה הצינור עבור h 1 ב-20 ° C.
6. Centrifuge את הצינור ב x 12,000 g 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן decant את שלב נוזלי.
   1. להוסיף 1 מ"ל אתנול (70%) כדי ליצור גלולה בצינור. צנטריפוגה ב x 12,000 g למשך 10 דקות, decant. חזור על שלב זה פעמיים.
7. יבש את הדגימה עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר (25 ° C). Resuspend את תמצית ה-RNA עם 25 μL של diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים מטופלים.
   הערה: על החילוץ RNA, להשתמש במים שטופלו 0.1% DEPC וי/v....

4. דגירה של RNA תעתיק עם Deoxyribonuclease (DNase)

1. לתוך צינור microcentrifuge סטרילי, להוסיף 2 µg של RNA הכולל לחלץ. להוסיף 1 μL x 10 תגובה מאגר (100 מ"מ טריס-HCl, 25 מ מ MgCl₂, 1 מ"מ CaCl₂). להוסיף 1 μL של DNase U/µL 1.
   1. להביא התגובה נפח סופי של μL 10 במים שטופלו DEPC. מערבבים את הדגימה ואת צנטריפוגה בקצרה ב 2,000 x g עבור 1 דקות.
2. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. עוצרים את התגובה עם התוספת של 1 μL של 50 מ מ ניתרן ethylenediaminetetraacetate וגופרית והרכבו (נה₂EDTA), דגירה המדגם-65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
4. לנתח את התקינות של RNA ידי agarose בג'ל.
   1. הכנת ג'ל agarose 1% סטנדרטיים, את הכתם עם µL 1 של 3 x intercalating חומצת גרעין הכתם פתרון.
   2. להחיל 500 ננוגרם של RNA כדי agarose ג'ל ולהפעיל את הג'ל.
   3. דמיינו בשלמות הרנ א באמצעות מערכת תיעוד צילום ג'ל.
   4. השתמש RNA כתבנית עבור סינתזה cDNA מאת רוורס טרנסקריפטאז.

5. משלימים חומצה Deoxyribonucleic (cDNA) סינתזה

1. להוסיף 2.5 μg של RNA סה כ צינור microcentrifuge. להוסיף 1 μL של פריימר oligo-deoxythymine (dT) ולמלא את הצינור לאמצעי הסופי 13 μL במים נטולי נוקלאז. לערבב את הדגימה, ואז centrifuge 2,000 x g עבור 1 דקות.
2. דגירה המדגם 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
3. להוסיף 4 μL של 5 x תגובת מאגר להשתמש רוורס טרנסקריפטאז, 2 μL של deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) מיקס (10 מ מ כל dNTP) של μL 1 של רוורס טרנסקריפטאז (200 U µL). לערבב בעדינות, צנטריפוגה ב 2,000 x g עבור 1 דקות.
4. דגירה המדגם 45 º C למשך 50 דקות ולאחר מכן 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
5. לכמת את הריכוז cDNA באמצעות ספקטרופוטומטרים UV.
6. השתמש את cDNA כתבנית עבור תגובת שרשרת פולימראזית (PCR).
   הערה: המאגר התגובה שימש 10 x (שלב 4.1.1) 5 x פעמים מרוכזת (שלב 5.3), בהתאמה.

6. בזמן אמת PCR כמותי (qPCR) כדי להגביר את ג'ין CCS1

1. להוסיף 7.5 μL של Taq DNA פולימראז 2 x (0.1 U/mL) ו- 0.1 μM של 5-carboxy-X-rhodamine (רוקס) צינור microcentrifuge ה-PCR.
   הערה: התחלה לוהטת Taq DNA פולימראז 2 x שימש פתרון 2 x מרוכז.
   1. להוסיף 5 μL של נוקלאז ללא מים.
   2. להוסיף 0.75 μL כל של 10 μM ואחורה פריימר כדי להגביר את הגן CCS1 (AB086414) (לפנים: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' ו הפוכה: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). לשימוש תחל טובולין כמו הגן משק בית בתגובה נפרדת (לפנים: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' ו הפוכה: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. להוסיף 600 ng cDNA תבנית.
2. לבצע את התגובה הגברה ב 50 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות ו- 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק דגירה התגובה במערכת ה-PCR בזמן אמת עבור 40 מחזורי 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס ל 30 s.
3. דגירה המדגם ב 50 מעלות צלזיוס במשך 30 s ו- 20 ° C עבור 10 s.
4. לנתח את הנתונים בתוכנת ה-PCR.
5. לחשב את הביטוי יחסי על-ידי ה-2-^ΔΔCT בשיטה המתוארת באמצעות Livak ו- Schmittgen (2001)¹².
   הערה: לנתח תגובה שליטה המכילה את כל הרכיבים למעט תבנית ה-DNA (אין תבנית שליטה, NTC) ריאגנטים להשליך מזוהמים או הגברה פריימר-הדימרים.

7. כמות חלבון תמצית של תא השעיות של ערביקה ג ל'

1. לסנן תא המתלים תחת ואקום עם נייר סינון בינוני-הנקבובית.
2. שוקל 1 g של חומר הסלולר ותארוז את זה בנייר אלומיניום.
   1. להקפיא את הדגימה עם חנקן נוזלי. Macerate הדגימה במרגמה פורצלן סטיריליים לקבל אבקה.
3. להעביר את הדגימה בקבוקון זכוכית ולהוסיף 2.5 מ ל חילוץ מאגר (400 מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane הידרוכלוריד (טריס-HCl), ב- pH 8.0, המכיל 10 מ מ β-mercaptoethanol, 5 מ מ נה₂EDTA ו- 0.5% (w/v) סודיום אסקורבט.
   1. מערבבים את הדגימה במיקסר מערבולת למשך 2 דקות.
      הערה: חשוב כי הדגימה נשמרת בקירור כדי למנוע דנטורציה של חלבונים.
4. Centrifuge הדגימה ב x 20,000 g למשך 20 דקות ב 4 ° C, להעביר 500 µL aliquots לתוך מבחנות הקפאה (2 מ"ל). לאחסן דגימות ב-72 מעלות צלזיוס עד השימוש.
5. למדוד את ריכוז חלבון המדגם-562 nm בספקטרופוטומטר שימוש assay חומצה bicinchoninic עם אלבומין שור התקנית.

8. Assay אנזימטי של קפאין סינתאז

1. להכין תערובת התגובה צינור microcentrifuge המכילה 200 מיקרומטר סאם, kBq 4.07 של מתיל [³H]-סאם, 200 מיקרומטר תאוברומין, 200 מיקרומטר MgCl₂ו- 5 מיקרומטר קפאין. להגביר את עוצמת הקול כדי µL 200 עם 100 מ מ טריס-HCl ב- pH של 8.0.
2. לשמור את הצינור microcentrifuge על קרח ולהוסיף אמצעי אחסון של השבר מסיסים המכיל 7-9 מ"ג של חלבון. לאחר מכן, לערבב על ידי מערבולת, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 30 מעלות צלזיוס ברים, מערכות אינסטלציה אמבטיה/סירקולטור. עבור אצווה של מספר דגימות, דגירה כל דגימה של כפילויות בתקופות 1 דקות לתת מספיק זמן כדי להפסיק את התגובות עבור כל הדגימות תקופת הזמן המדויק של 30 דקות.
   1. להוסיף 1 מ"ל של כלורופורם להפסיק את התגובה, אז תלחצו את הדגימה עם מערבל מערבולת. לנער את הדגימה באמצעות מערבל מערבולת למשך 3 דקות כדי להסיר את הקפאין רדיואקטיבי הממס.
3. צנטריפוגה דגימות ב 11,000 x g למשך 5 דקות, בזהירות לשחזר אמצעי אחסון של 900 µL. לאחר מכן, העבר את הדגימות נצנוץ בקבוקונים.
4. להתאדות ההרדמה כדי להשלים יובש בשכונה בטמפרטורת החדר 25 º C. הוסף 5 מ של נוזל נצנוץ למבחנה ומערבבים את הדגימה.
5. לנתח רדיואקטיביות שולבו את הקפאין ב מונה נצנוץ.

תוצאות

תמציות קפאין שהושג דרך התהליך המוצג כאן נותחו על ידי TLC-densitometry במינים את הדוגמאות כדי צלחת כרומטוגרפיה על פי התכנית המוצגת באיור1. כדי לכמת את הרמות של קפאין תמציות תא, עקומה עם ריכוזים שונים של תקן מסחרי מתחם זה היה בשימוש (איור 2 א). הדפוס ש?...

Discussion

אנו מציגים כאן את תנאים אופטימליים עבור הערכת את הקפאין תוכן, פעילות CS ורמות תעתיק במבחנה לשתול תרביות רקמה, כגון תא השעיות של ערביקה ג. בדו"חות קודמים אישרו כי שמירה על תאים תחת אור הקרנה ובפני תאוברומין במדיום תרבות הם פרמטרים מתאימים להגדיל את רמת של קפאין, כך שניתן להעריך את שי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210