Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia eficiente para a extração e quantificação de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. e um processo experimental para avaliar a atividade enzimática da cafeína sintase com o nível de expressão de o gene que codifica esta enzima.

Resumo

(1,3,7-trimethylxanthine) a cafeína é um alcaloide de Purina, presente em bebidas populares como café e chá. Este metabolito secundário é considerado como uma defesa química, porque tem atividade antimicrobiana e é considerado um inseticida natural. Cafeína também pode produzir efeitos alelopático negativos que impedem o crescimento das plantas circunvizinhas. Além disso, as pessoas ao redor do mundo consomem cafeína para seus efeitos analgésicos e estimulante. Devido ao interesse nas aplicações tecnológicas da cafeína, pesquisa sobre o caminho biossintético deste composto tem crescido. Estes estudos centraram-se principalmente na compreensão dos mecanismos bioquímicos e moleculares que regulam a biossíntese de cafeína. Cultura de tecidos in vitro tornou-se um sistema útil para estudar este caminho biossintético. Este artigo irá descrever um protocolo passo a passo para a quantificação de cafeína e para medir os níveis de transcrição do gene (CCS1) codificação cafeína sintase (CS) em suspensões celulares de c. arabica L., bem como a sua actividade.

Introdução

A cafeína é um metabólito secundário que é biossintetizados por plantas do gênero Coffea¹. Este alcaloide pertence à família de methylxanthine e é considerado como uma defesa da planta química, porque ele pode agir contra os efeitos nocivos de patógenos e herbívoros de^2,3. Além disso, este metabólito é responsável para as propriedades estimulantes da bebida café, que é comumente consumida em todo o mundo^4,5. Devido a suas propriedades, diversos grupos de pesquisa estão interessados em estudar o caminho biossintético e catabolismo de cafeína^6,7. Atualmente, a planta em vitro culturas de célula/tecido servem como uma alternativa para avaliar acúmulo de cafeína sob várias estratégias bióticos e abióticos^8,9.

Biossíntese de cafeína envolve a liberação hidrolítica de 7-methylxanthine do correspondente nucleosídeo ribose seguido por ordenada de N-methylations nas posições 3 e 1. Um específico S- adenosilmetionina (SAM)-N-metiltransferase dependente (NMT) catalisa a metilação na posição 7, Considerando que a teobromina sintase (TS) e CS estão envolvidos na 3 - e 1-methylations, respectivamente, produzindo teobromina e cafeína. O estudo dos genes que codificam NMTs distintas permitiu compreender o mecanismo que regula a produção de cafeína^10,11. CS, que tem N -metiltransferase atividade, catalisa as duas últimas etapas da via biossintética de cafeína¹¹. Em mudas de árvores de café, ficou demonstrado que a radiação luminosa pode aumentar atividade CS, o que resulta em um aumento na biossíntese de cafeína. Recentemente, nós mostramos que a manutenção das suspensões celulares de c. arabica L. sob irradiação de luz é a condição ideal para avaliar os efeitos que produzem fatores de estresse abiótico que impactam o caminho biossintético de cafeína⁸. As informações obtidas nesses estudos podem ter aplicações em biologia de sistemas e engenharia metabólica para maximizar o estudo da via biossintética de cafeína em tais sistemas em vitro .

Dadas as vantagens de se obter um modelo adequado para o estudo da biossíntese de cafeína, nós aperfeiçoamos as condições de extração de cafeína em suspensões celulares de c. arabica L. Também foi possível desenvolver um protocolo útil para estudar a atividade enzimática, bem como os passos metodológicos para avaliação do nível de transcritos do gene de Coffea cafeína sintase 1 (CCS1) codificação desta enzima. Neste documento, nós relatamos um protocolo para extrair e quantificar a cafeína em suspensões celulares de c. arabica por cromatografia em camada delgada e densitometria (TLC-densitometria).

Protocolo

1. cafeína extração em suspensões celulares de c. arabica L.

1. Use o c. arabica célula suspensões⁹. Manter as suspensões por subculturas quinzenais em meio de Murashige e Skoog em pH 4.3 com constante 100 rpm agitando a 25 ° C, sob luz contínua (8,3 W/m²).
2. Colha as células sob vácuo filtração utilizando papel de filtro 11 µm poro e um funil de Buchner.
3. Registrar o peso fresco das células coletadas usando uma escala, embrulhe em papel alumínio, congelá-los em nitrogênio líquido e mantê-los a-80 ° C até análise.
4. Lyophilize o material celular congelado por 72 h.
5. Registar-se o peso das células liofilizados para estimar o rendimento de peso seco.
6. Armazene o material em pó em sacos de polietileno reutilizáveis (9 x 7,5 cm). Macerar o material a um pó fino e armazenar num exsicador até o uso.
7. Medem de 0,5 g de matéria seca de celular na balança analítica e adicioná-lo para um balão de vidro (25 mL).
   1. Adicionar 10 mL de acetona para as células liofilizadas e misturar em um misturador de vórtice para 30 s para homogeneização. Em seguida, feche o balão com folha de alumínio.
   2. Misture a 100 rpm usando um rotador à temperatura ambiente (25 ° C) por 5 h.
8. Transferir todo o material para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar 13.000 x g por 10 min. transferência o líquido para um novo tubo de fase e reduzir a ele seca à temperatura ambiente na coifa.
9. Resuspenda a amostra com 25 µ l de acetona.

2. condições para a avaliação de cafeína por fina camada de cromatografia (TLC)-densitometria

1. Aplica 1 µ l do extrato de cafeína ressuspensão anteriormente à fase estacionária.
   Nota: placas de sílica gel (F254) são usadas como fase estacionária. Antes de aplicar as amostras, as placas foram desenvolvidas com 10 mL de clorofórmio-metanol [9:1 v/v] em uma câmara de cromatografia (14 x 12 cm x 9,5 cm), e as placas foram secas à temperatura ambiente. As características da placa de cromatografia em fase gasosa, onde as amostras são aplicadas são mostradas na Figura 1. A câmara estava saturada por 30 min com solvente antes de desenvolver a placa. Placas do TLC devem lidar com a utilização de luvas para evitar contaminação.
2. Desenvolva o TLC na câmara de cromatografia com 10 mL de ciclo-hexano-acetona da fase móvel [40:50 v/v].
   Nota: Esta mistura permite a separação de cafeína em um fator de retenção (Rf) de 0,34.
   1. Remover a placa de TLC da câmara e deixe secar completamente em temperatura ambiente.
3. Visualizar bandas de cafeína em luz ultravioleta de curto comprimento de onda (UV, 254 nm). Use uma lâmpada compacta de UV. Além disso, para esta etapa, uso óculos com proteção UV.
4. Quantificar os níveis de cafeína por densitometria em 273 nm. O instrumento é controlado com software de cromatografia.

3. ácido ribonucleico (RNA) isolamento

1. Leve as suspensões celulares da etapa 1.1 e vácuo filtrado com filtro de papel (tamanho de poro de 11 µm).
2. Coletar o material celular do papel de filtro, pesar 0,5 g de material celular em uma balança analítica e embalá-lo em papel de alumínio. Congele a amostra com líquido N₂.
3. Macerar a amostra de células em um almofariz de porcelana com nitrogênio líquido e adicione 1 mL do reagente de isolamento de RNA até homogeneizado.
   Nota: Esterilize os morteiros de porcelana em um forno de mufla a 300 ° C para reagente de isolamento de 6 h. RNA contém fenol, isotiocianato de guanidina e outros componentes.
   1. Transferi 500 µ l da amostra para um tubo estéril microcentrifuga (1,5 mL). Adicione 300 µ l de álcool de clorofórmio-isoamílico (24:1) e 300 μL de fenol equilibrado (pH 8.0).
4. Misturar a amostra com um misturador do vortex e centrifugá-la a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
5. Transfira 300 μL da fase superior para um tubo de microcentrifugadora. Adicione 200 μL de isopropanol. Incubar o tubo para 1 h a-20 ° C.
6. Centrifugar o tubo a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e em seguida, decante a fase líquida.
   1. Adicione 1 mL de etanol (70%) para formar um pellet no tubo. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min e decantar. Repita duas vezes.
7. Seca a amostra por 1,5 h em temperatura ambiente (25 ° C). Ressuspender o extrato de RNA com 25 μL de dietilo pyrocarbonate (DEPC)-água tratada.
   Nota: Para a extração de RNA, utilize água tratada com DEPC de 0,1% v/v.

4. incubação de transcrição de RNA com desoxirribonuclease (DNase)

1. Em um tubo estéril microcentrifuga, adicione o extrato de 2 µ g de RNA total. Adicione 1 μL de tampão de reação 10 x (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1mm CaCl₂). Adicione 1 μL de 1 U / µ l de DNase.
   1. Trazer a reação a um volume final de 10 μL com água tratada DEPC. Misture a amostra e centrifugar brevemente 2.000 x g por 1 min.
2. Incube a amostra a 37 ° C por 30 min.
3. Parar a reação com a adição de 1 μL de 50mm dissódico dihidratado de tetrassódio (ND₂EDTA) e incubar a amostra a 65 ° C por 10 min.
4. Analise a integridade do RNA por eletroforese em gel de agarose.
   1. Preparar um gel de agarose 1% padrão e manchá-la com 1 µ l de 3x intercalante solução de mancha de ácido nucleico.
   2. Aplicar 500 ng do RNA para o agarose gel e funcione o gel.
   3. Visualize a integridade do RNA usando um sistema de documentação de foto do gel.
   4. Uso do RNA como modelo para a síntese do cDNA por transcriptase reversa.

5. Ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) síntese

1. Adicione 2,5 μg de RNA total para um tubo de microcentrifugadora. Adicionar 1 μL de primer oligo-deoxythymine (dT) e encha o tubo até um volume final de 13 μL com água livre de nuclease. Misturar a amostra e centrifugar um de 2.000 x g por 1 min.
2. Incube a amostra a 65 ° C por 5 min e, em seguida, a 4 ° C por 2 min.
3. Adicione 4 μL de 5 x reação buffer usado para transcriptase reversa, 2 μL de mistura de trifosfatos (dNTPs) deoxynucleotide (10 mM de cada dNTP) e 1 μL de transcriptase reversa (200 U / µ l). Misture delicadamente e centrifugar a 2.000 x g por 1 min.
4. Incube a amostra a 45 ° C, durante 50 min e depois a 70 ° C por 10 min.
5. Quantificar a concentração de cDNA usando um espectrofotômetro UV.
6. Uso o cDNA como modelo para a reação em cadeia do polymerase (PCR).
   Nota: O amortecedor da reação foi usado como 10 x (etapa 4.1.1) e 5 x vezes concentraram (etapa 5.3), respectivamente.

6. real-time PCR quantitativo (qPCR) para amplificar o Gene CCS1

1. Adicione 7,5 μL Taq DNA polimerase 2 x (0.1 U/mL) e 0,1 μm de 5-carboxy-X-rodamina (ROX) para um tubo de microcentrifugadora PCR.
   Nota: O começo quente Taq DNA polimerase 2 x foi usado como uma solução de 2 x concentrado.
   1. Adicione 5 μL de água livre de nuclease.
   2. Adicione 0,75 μL de 10 μM para diante e reverso da primeira demão para amplificar o gene CCS1 (AB086414) (para a frente: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' e inversa: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Use primers para tubulina como o gene domésticas em uma reação separado (para a frente: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' e inversa: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Adicione 600 ng de cDNA modelo.
2. Realizar a reação de amplificação a 50 ° C por 2 min e 95 ° C por 5 min. incubam a reação no sistema de PCR em tempo real para 40 ciclos de 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s.
3. Incubar a amostra a 50 ° C por 30 s e 20 ° C, durante 10 s.
4. Analise os dados com o software PCR.
5. Calcular a expressão relativa pelo 2-^ΔΔCT método descrito por Livak e Schmittgen (2001)¹².
   Nota: Analise uma reação de controle que contém todos os componentes, exceto o modelo de DNA (sem controle de modelo, NTC) para descartar contaminado reagentes ou amplificação da primeira demão-dímeros.

7. total extrato de proteína de suspensões celulares de c. arabica L.

1. Suspensões celulares sob vácuo com um papel de filtro médio-poro do filtro.
2. Pesar 1 g de material celular e embalá-lo em papel de alumínio.
   1. Congele a amostra com nitrogênio líquido. Macerar a amostra em um almofariz de porcelana esterilizado para obter um pó fino.
3. Transferir a amostra para um frasco de vidro e adicionar 2,5 mL de solução tampão (400 mM tris (hidroximetil) aminometano cloridrato (Tris-HCl), em pH 8,0, contendo 10 mM β-Mercaptoetanol, 5mm Na₂EDTA e ascorbato de sódio 0,5% (p/v).
   1. Misture a amostra em um misturador de vórtice por 2 min.
      Nota: É importante que a amostra é mantida no gelo para evitar a desnaturação de proteínas.
4. Centrifugar a amostra a 20.000 x g por 20 min a 4 ° C e transferir 500 alíquotas µ l em frascos criogênicos (2 mL). Armazenar as amostras em-72 ° C até o uso.
5. Medir a concentração de proteína da amostra em 562 nm num espectrofotómetro usando ácido ensaio bicinchoninic com albumina de soro bovino como padrão.

8. ensaio enzimático para cafeína sintase

1. Prepare uma mistura de reação em um tubo de microcentrifugadora contendo 200 µM SAM, kBq 4,07 de metilo [³H]-SAM, teobromina µM 200, 200 µM MgCl₂e cafeína 5 µM. Aumente o volume a 200 µ l com 100 mM Tris-HCl a um pH de 8,0.
2. Mantenha o tubo microcentrifuga no gelo e adicionar um volume de fração solúvel, contendo 7-9 mg de proteína. Em seguida, misture por vórtex e incubar durante 30 min a 30 ° C em um banho termostático/circulador. Para um lote de várias amostras, incube cada amostra em duplicado em períodos de 1 min para dar tempo suficiente para parar as reações para todas as amostras em um período de tempo exato de 30 min.
   1. Adicione 1 mL de clorofórmio para parar a reação e, em seguida, agitar a amostra com um misturador do vortex. Agite a amostra usando um misturador do vortex para 3 min para remover a cafeína radioativa no solvente.
3. Centrifugar as amostras a 11.000 x g por 5 min e cuidadosamente recuperar um volume de 900 µ l. Em seguida, transferi as amostras para frascos de cintilação.
4. Evaporar o clorofórmio para completar a secura do capuz em temperatura a 25 ° C. Adicionar 5 mL de líquido de cintilação para o frasco e misturar a amostra.
5. Analise a radioatividade incorporada a cafeína em um contador de cintilação.

Resultados

Extratos de cafeína, obtidos através do processo aqui apresentado foram analisados por TLC-densitometria sujeitando as amostras para a placa de cromatografia de acordo com o esquema mostrado na Figura 1. Para quantificar os níveis de cafeína em extratos de células, uma curva com diferentes concentrações de padrão comercial para este composto foi usado (Figura 2A). O padrão de absorvância para cafeína foi analisado no e...

Discussão

Apresentamos aqui as condições ideais para avaliar a conteúdo de cafeína, os níveis de atividade e transcrição de CS em um em vitro planta cultura de tecidos, tais como suspensões celulares de c. arabica. Relatórios anteriores confirmaram que mantém as células sob irradiação de luz e na presença de teobromina em meio de cultura são parâmetros adequados para aumentar o nível de cafeína, tornando possível a avaliação dos métodos de separação de cafeína usando a cromatografia líqu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210