카페인 추출, 효소 활동 및 식물 세포 정지에서 카페인 Synthase의 유전자 발현

요약

이 프로토콜 추출 및 C. arabica L.의 셀 정지에 카페인의 정량화에 대 한 효율적인 방법론과 식 수준으로 카페인 synthase의 효소 활동을 평가 하기 위한 실험 과정에 설명 합니다. 이 효소를 인코딩하는 유전자.

초록

카페인 (1,3,7-trimethylxanthine)은 커피와 차 등 인기 있는 음료에는 퓨 린 알칼로이드 이다. 항균 성 활동은 자연 살충제로 간주 됩니다 때문에이 2 차 대사 산물 화학 방어로 간주 됩니다. 카페인 또한 주변 식물의 성장을 방지 하는 부정적인 allelopathic 효과 생성할 수 있습니다. 또한, 전 세계의 사람들이 그것의 진통 및 stimulatory 효과 대 한 카페인 소비. 때문에 카페인의 기술 응용 프로그램에 대 한 관심,이 화합물의 생 합성 통로 대 한 연구는 성장 했다. 이러한 연구는 카페인의 생 합성을 조절 하는 생 화 학적 및 분자 메커니즘을 이해에 주로 집중 했다. 조직 문화를 체 외에서 이 생 합성 통로 공부에 대 한 유용한 시스템 되고있다. 이 문서는 C. arabica L. 그것의 활동의 셀 정지에 카페인 synthase (CS) 인코딩 유전자 (CCS1)의 증명서 수준 측정에 대 한 카페인의 정량화에 대 한 단계별 프로토콜을 설명 합니다.

서문

카페인은 이다 biosynthesized Coffea¹속의 식물 이차 대사 산물. 이 알칼로이드 methylxanthine 가족에 속하는 그리고 그것 병원 체와 herbivores^2,3의 부작용에 대 한 역할을 할 수 있기 때문에 화학 공장으로 간주 됩니다. 또한,이 대사 산물은 일반적으로 소모한 전세계^4,5커피 음료의 자극 속성에 대 한 책임. 그것의 속성으로 인해 여러 연구 그룹 생 합성 통로 카페인^6,7의 놓을 공부에 관심이. 현재, 식물 체 외에서 세포/조직 문화 다양 한 생물과 비 생물 적인 전략^8,9에서 카페인 축적을 평가 하기 위한 대체 역할을 합니다.

카페인 생 합성 포함 다음 주문된 N해당 ribose nucleoside에서 7 methylxanthine의 가수분해 릴리스-3-1 위치에서 methylations. 특정 S-adenosyl 메티오닌 (SAM)-종속 N-methyltransferase (NMT) 반면 7, 위치에 메 틸 화를 catalyzes 브로민 synthase (TS) 및 CS 관련에 3-고 1-methylations, 각각, 테오 브로민 제제 생산 및 카페인입니다. 고유한 NMTs를 인코딩 하는 유전자의 연구는 카페인 생산^10,11을 조절 하는 메커니즘을 이해 수 있다. N-methyltransferase 활동이 CS 카페인¹¹의 생 합성 통로의 마지막 두 단계를 catalyzes. 커피 나무 묘 목에 그것 보였다 빛 방사선 카페인 생 합성 증가 귀착되는 CS 활동을 증가할 수 있다. 최근에, 우리는 가벼운 방사선 조사에서 C. arabica L.의 셀 정지의 유지 보수는 abiotic 스트레스 요인을 카페인⁸의 생 합성 통로 영향을 미치는 생산 효과 평가 하기 위한 최적의 조건을 보였다. 이러한 연구에서 얻은 정보 같은 생체 외에서 시스템에 카페인 생 합성 통로의 연구를 극대화 하기 위한 대사 공학 및 시스템 생물학에 응용 프로그램을 할 수 있습니다.

카페인 생 합성의 연구에 대 한 적합 한 모델의 장점을 감안할 때, 우리 C. arabica L. 셀 정지에 카페인 추출 조건 최적화 그것은 또한 유전자 사본 Coffea 카페인 synthase 1 (CCS1) 인코딩이 효소의 수준을 평가 하기 위한 방법론 단계 뿐만 아니라 효소 활동 공부에 대 한 유용한 프로토콜을 개발할 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 하 고 얇은 층 크로마토그래피와 densitometry (TLC densitometry) C. arabica 셀 정지에 카페인을 계량 프로토콜을 보고 합니다.

프로토콜

1. C. arabica L.의 셀 정지에서 카페인 추출

1. C. arabica 셀 정지⁹를 사용 합니다. 연속 광원 (8.3 W/m²) 25 ° C에서 흔들어 상수 100 rpm 격주 비주류 pH 4.3에서 Skoog와 村 重 매체에 의해 정지를 유지 합니다.
2. 11 µ m 기 공 필터 종이 부 흐 너 깔때기를 사용 하 여 진공 여과에서 세포를 수확.
3. 등록 규모를 사용 하 여 수집 된 셀의 신선한 무게, 알루미늄 호 일에 그들을 포장, 액체 질소에서 그들을 멈추게 하 고 분석까지-80 ° C에서 그들을 유지.
4. 72 h에 대 한 냉동된 세포 자료 lyophilize
5. 건조 중량 수율을 추정 하기 위해서는 동결 건조 된 셀의 무게를 등록 합니다.
6. 재사용 가능한 폴 리 에틸렌 봉투 (9 cm x 7.5 cm)에 가루 재료를 저장 합니다. 사용까지 정밀한 분말을 한 desiccator에 게 자료를 macerate.
7. 분석 규모 건조 세포 물질의 0.5 g을 측정 하 고 유리 플라스 크 (25 mL)에 그것을 추가.
   1. 동결 건조 된 셀에 아세톤 10 mL을 추가 하 고 30 대와 동 믹서에서 혼합 균질에 대 한 s. 다음, 플라스 크 알루미늄 호 일로 밀봉.
   2. 회전자를 사용 하 여 5 h를 실 온 (25 ° C)에서 100 rpm에서 혼합.
8. 15 mL 원뿔 튜브 및 13000 x g 에서 원심 분리기는 10 분 전송 액체 단계 새로운 튜브에 그것에 감소에 대 한 모든 자료를 전송 증기 두건에서 실 온에서 건조.
9. 아세톤의 25 µ L로 샘플 resuspend

2. 얇은 하 여 카페인의 평가 대 한 조건 층 크로마토그래피 (TLC)-Densitometry

1. 이전 resuspended 카페인 추출의 1 µ L 고정 단계에 적용 됩니다.
   참고: 실리 카 젤 번호판 (F254) 고정 위상으로 사용 됩니다. 적용 하기 전에 샘플, 번호판 크로마토그래피 챔버에 클로 프롬-메탄올 [9:1 v/v]의 10 mL와 함께 개발 되었다 (14 cm x 12 cm x 9.5 cm), 판 상 온에서 건조 되었다. 샘플 적용 됩니다 컬럼에 플레이트의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 챔버는 접시를 개발 하기 전에 용 매와 30 분 동안 포화 되었다. TLC 판 오염을 피하기 위하여 장갑을 사용 하 여 처리 해야 합니다.
2. 모바일 위상 cyclohexane 아세톤 [40:50 v/v]의 10 mL와 크로마토그래피 챔버에 TLC를 개발 합니다.
   참고:이 혼합 0.34의 보존 팩터 (Rf) 카페인의 분리 수 있습니다.
   1. 상공에서 TLC 판을 제거 하 고 실 온에서 완전히 건조 보자.
3. 짧은 파장의 자외선 빛에 카페인 밴드 시각화 (UV, 254 nm). 소형 UV 램프를 사용 합니다. 또한,이 단계 사용 하 여 UV 보호 고글.
4. 273에서 densitometry에 의해 카페인 레벨을 계량 nm. 악기는 크로마토그래피 소프트웨어 제어 됩니다.

3. Ribonucleic 산 (RNA) 절연

1. 1.1 단계와 필터 종이 (11 µ m 기 공 크기) 진공 여과 액에서 세포 정지를 가져가 라.
2. 필터 종이에서 셀룰러 자료를 수집 하 고 분석 균형에 세포질 물자의 0.5 g으로 무게 알루미늄 호 일에 그것을 포장. 액체 N₂샘플을 동결.
3. 액체 질소로 도자기 박격포에 셀 샘플을 macerate 하 고 RNA 격리 시 약까지 무 균의 1 mL를 추가 합니다.
   참고: 소독 300 ° C에 휩 싸이 다 용광로에서 도자기 박격포 6 h. RNA 격리 시 페 놀, guanidine isothiocyanate 및 다른 구성 요소를 포함.
   1. 살 균 microcentrifuge 튜브 (1.5 mL)에 500 µ L의 샘플을 전송 합니다. 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 300 µ L equilibrated 페 놀 (pH 8.0)의 300 μ를 추가 합니다.
4. 와 동 믹서와 샘플을 믹스 하 고 4 ° c.에 15 분 동안 20000 x g 에서 원심
5. Microcentrifuge 튜브를 상위 단계의 300 μ를 전송 합니다. 소 프로 파 놀의 200 μ를 추가 합니다. 1 h-20 ° c.에 대 한 튜브를 품 어
6. 12000 x g 4 ° C에서 10 분 동안에 관을 원심 그리고 액체 단계를 가만히 따르다.
   1. 튜브에 펠 릿을 형성 하기 위하여 에탄올 (70%)의 1 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 12000 x g 에서 centrifuge 그리고 가만히 따르다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
7. 건조 실 온 (25 ° C)에서 1.5 h에 대 한 샘플. Resuspend diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 25 μ와 RNA 추출 물-물 처리.
   참고: RNA 추출 물 0.1% DEPC v/v로 치료 사용 합니다.

4. Deoxyribonuclease (DNase)와 RNA 사본을의 외피

1. 살 균 microcentrifuge 관으로 총 RNA의 2 µ g 추출 추가 합니다. 10 x 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl 25 m m MgCl₂, 1mm CaCl₂)의 1 μ를 추가 합니다. 1 U / µ L DNase의 1 μ를 추가 합니다.
   1. DEPC 처리 물으로 10 μ의 최종 볼륨을 반응을. 믹스 샘플, 1 분 동안 짧게 2000 x g 에서 원심 분리기.
2. 30 분 동안 37 ° C에서 샘플을 품 어.
3. 50 m m disodium ethylenediaminetetraacetate이 수화물 (나₂EDTA)의 1 μ의 추가 함께 반응 중지 하 고 10 분 동안 65 ° C에서 샘플을 품 어.
4. Agarose 젤 전기 이동 법으로 RNA의 무결성을 분석 합니다.
   1. 표준 1 %agarose 젤 준비 하 고 핵 산 얼룩 솔루션 intercalating x 3의 1 µ L와 얼룩.
   2. 500 적용 RNA의 ng는 agarose에 젤 고 젤을 실행.
   3. 젤 사진 문서 시스템을 사용 하 여 RNA의 무결성을 시각화.
   4. 의해 역전사 cDNA 합성에 대 한 템플릿으로 RNA 사용 합니다.

5. 보완 Deoxyribonucleic Acid (cDNA) 합성

1. Microcentrifuge 튜브를 총 RNA의 2.5 μ g를 추가 합니다. 올리고-deoxythymine (dT) 뇌관의 1 μ 더하고 nuclease 무료 물 관 13 μ 최종 볼륨을 채워. 샘플을 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 원심.
2. 그리고 2 분 동안 4 ° C에서 65 ° C 5 분에서 샘플을 품 어.
3. 역전사 효소, deoxynucleotide 된 (dNTPs) 믹스 (각 dNTP의 10 m m)의 2 μ 및 역전사 (200 U / µ L)의 1 μ에 사용 되는 반응 버퍼 x 5의 4 μ를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 1 분 동안 2000 x g 에서 원심.
4. 그리고 10 분 동안 70 ° C에서 50 분 동안 45 ° C에서 샘플을 품 어.
5. CDNA 농도 UV 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량.
6. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 대 한 템플릿으로 cDNA를 사용 합니다.
   참고: 반응 버퍼 10으로 사용 되었다 (4.1.1 단계) x 5 x 번 집중 (5.3 단계), 각각.

6. 실시간 양이 많은 PCR (정량) CCS1 유전자 증폭

1. PCR microcentrifuge 튜브를 5-카-X-rhodamine (ROX)의 Taq DNA 중 합 효소 (0.1 U/mL) x 2, 0.1 μ M의 7.5 μ를 추가 합니다.
   참고:는 뜨거운 시작 Taq DNA 중 합 효소 2 x 2 x 집중 솔루션으로 사용 되었다.
   1. Nuclease 무료 물 5 μ를 추가 합니다.
   2. CCS1 (AB086414) 유전자를 증폭 하는 10 μ M 앞으로 역 뇌관의 각 0.75 μ 추가 (앞으로: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3'와 역: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Tubulin에 대 한 프라이 머를 사용 하 여 별도 반응에 집 유지 유전자로 (앞으로: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3'와 역: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. 600 추가 cDNA 템플릿의 ng.
2. 2 분 및 5 분 동안 95 ° C 하 30 95 ° C의 40 주기 위한 실시간 PCR 시스템에 반응 품 어 50 ° C에서 증폭 반응을 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 72 ° C 30에 대 한 s.
3. 50 ° C에서 샘플을 품 어 30 s 및 20 ° C 10에 대 한 s.
4. PCR 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다.
5. 2 상대 식 계산-^ΔΔCT 방법 설명 Livak 및 Schmittgen (2001)¹².
   참고: 오염 제거 시 약 또는 확대 뇌관 이합체 DNA 서식 파일 (서식 파일 통제, NTC) 제외한 모든 구성 요소를 포함 하는 컨트롤 반응 분석.

7. 총 단백질 추출 L. C. arabica 세포 현 탁 액의

1. 중간-기 공 필터 종이 진공 아래 셀 정지를 필터링 합니다.
2. 1 g 세포 물자의 무게 그리고 알루미늄 호 일에 그것을 포장.
   1. 액체 질소로 샘플을 동결. 정밀한 분말을 얻기 위해 소독된 도자기 박격포에 샘플 macerate
3. 유리 유리병에 샘플을 전송 하 고 2.5 mL의 추출 버퍼 (400 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane 염 산 염 (Tris HCl), pH 8.0, 10 m m β-mercaptoethanol, 5mm 나₂EDTA 및 0.5% (w/v) 나트륨 하는데에 추가.
   1. 2 분 동안 소용돌이 믹서에 샘플을 믹스.
      참고: 샘플은 단백질 변성을 방지 하기 위해 얼음에 보관 중요 하다.
4. 4 ° C에서 20 분 20000 x g 에서 샘플 원심 고 극저온 튜브 (2 mL)에 500 µ L aliquots를 전송. 사용까지-72 ° C에서 샘플을 저장 합니다.
5. 562에서 샘플의 단백질 농도 측정 표준으로 소 혈 청 알 부 민으로 bicinchoninic 산 분석 결과 사용 하 여 분 광 광도 계에 nm.

8. 효소 분석 결과 카페인 Synthase에 대 한

1. 200 µ M 샘, 메 틸 [³H]의 4.07 kBq 포함 microcentrifuge 튜브에 반응 혼합물 준비-샘, 200 µ M 브로민, 200 µ M MgCl₂및 5 µ M 카페인. PH 8.0에서 100 mM Tris HCl와 200 µ L 볼륨을 증가.
2. 얼음에 microcentrifuge 관을 유지 하 고 단백질의 밀리 그램 7-9를 포함 하는 수용 성 분수의 볼륨을 추가. 그런 다음, 소용돌이 의해 혼합 하 고 서 모스 탯 목욕/circulator에 30 ° C에서 30 분 동안 품 어. 여러 샘플의 일괄 처리에 대 한 충분 한 시간 30 분의 정확한 기간에 모든 샘플에 대 한 반응을 중지을 주고 1 분 기간에 중복에서 각 샘플을 품 어.
   1. 반응을 중지 하 고 소용돌이 믹서와 샘플을 흔들 다음 클로 프롬의 1 mL를 추가 합니다. 용 매에 방사성 카페인을 제거 하려면 3 분 소용돌이 믹서를 사용 하 여 샘플을 흔들어.
3. 샘플 5 분 11000 x g 에서 원심 하 고 신중 하 게 900 µ L의 볼륨을 복구 합니다. 그런 다음, 섬광 튜브 샘플 전송.
4. 상 온 25 ° c.에 후드에 건조를 완료 하는 데 클로 프롬을 증발 유리병에 섬광 액체의 5 mL을 추가 하 고 샘플을 혼합.
5. 섬광 카운터에 카페인에 통합 하는 방사능을 분석 합니다.

결과

여기에 제시 된 과정을 통해 얻은 카페인 추출 쓰는 그림 1에 표시 된 스키마에 따라 착 색 인쇄기 격판덮개를 샘플 하 여 TLC densitometry에 의해 분석 되었다. 이 화합물은 상업 표준의 다양 한 농도와 세포 추출 물에는 카페인, 곡선의 수준을 계량 (그림 2A)를 사용 합니다. 카페인에 대 한 흡 광도의 패턴 가시 광선 스펙트럼 (UV-VI) ...

토론

우리가 현재 여기 카페인 콘텐츠를 평가 하기 위한 최적의 조건, CS 활동 및 수준에서 생체 외에서 식물 조직 배양, C. arabica의 셀 정지 등. 이전 보고서 유지 셀 빛 조사 하 고 문화 매체에 테오 브로민 제제의 존재는 카페인, 카페인 분리 방법을 평가 수의 수준을 높이기 위한 적합 한 매개 변수 확인 반전 단계 고성능 액체 착 색 인쇄기 (HPLC RP)를 사용 하 여. 현재, 셀 정지 생 합성 카페...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210