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要約

このプロトコルは、抽出と成木L の細胞懸濁液中のカフェインの定量のための効率的な方法論と表現レベルのカフェイン合成酵素の酵素活性を評価するための実験的プロセスについて説明します。この酵素を符号化する遺伝子。

要約

カフェイン (1,3,7-トリメチルキサンチン) はコーヒーやお茶など人気のある飲み物でプリン アルカロイドです。この二次代謝産物は、抗菌作用があり、自然な殺虫剤であるので化学防衛とみなされます。カフェインは、周囲の植物の成長を防ぐ負のアレロパシー効果を生成できます。さらに、世界中の人々 はその鎮痛剤と促進の効果のためのカフェインを消費します。ためにカフェインの技術のアプリケーションの関心は、この化合物の生合成経路の研究は成長しています。これらの研究は、カフェインの生合成を調節する生化学的および分子メカニズムの理解に主に焦点を当てています。体外培養は、この生合成経路を研究するための便利なシステムになっています。この記事は、その活動と同様、l. c. のアラビカ種の細胞懸濁液にカフェインの定量化のためのカフェイン合成酵素 (CS) をエンコード (CCS1) 遺伝子の転写レベルを測定手順プロトコルを説明します。

概要

カフェインは、コーヒーノキ1属の植物によって生合成される二次代謝産物です。このアルカロイドはメチルキサンチンのファミリーに属するし、は病原体と植食者の2,3の悪影響に対して振舞うことだから化学プラント防衛とみなされます。さらに、この代謝物は、コーヒーを飲む、一般的に消費されて世界4,5である刺激的な特性を担います。その特性のためいくつかの研究グループは、生合成経路とカフェイン6、7の異化作用の勉強に興味があります。現在、植物培養細胞・組織培養は、様々 な生物的・非生物的戦略8,9カフェイン蓄積の評価のための代替として機能します。

カフェイン合成には順序N続く対応するリボース ヌクレオシドから 7 メチルキサンチンの加水分解のリリースが含まれます-3 と 1 の位置でメチル化。特定Ss-アデノシルメチオニン (SAM)-依存 N-メチルトランスフェラーゼ (NMT) に対し位置 7、メチル化を触媒するテオブロミン合成酵素 (TS) CS が関与しているの 3-、1-メチル化、それぞれ、テオブロミンを生産し、カフェイン。明確な NMTs をコードする遺伝子の研究は、カフェイン生産10,11を調節するメカニズムを理解することを許可しています。N-メチルトランスフェラーゼ活性である CS カフェイン11の生合成経路の最後の 2 つのステップを触媒します。コーヒーの木の苗の光放射がカフェイン生合成の増加で起因する CS 活動を増やすことができますが示されています。最近では、光照射下で、成木L. 細胞懸濁液の保守がカフェイン8の生合成経路に影響を与える非生物的ストレス要因を作り出す効果を評価するための最適な条件であることを示した。これらの研究で得られた情報は、このような培養システムでカフェインの生合成経路の研究を最大化するため代謝工学とシステム生物学のアプリケーションにあります。

アラビカの c. l. の細胞懸濁液にカフェインの抽出条件を最適化カフェイン生合成の研究のための適切なモデルを得ることの利点を考えると、また、コーヒーノキカフェイン合成酵素 1 (CCS1) この酵素の遺伝子転写のレベルを評価するための方法論的手順と同様に、酵素活性を研究するための有用なプロトコルを開発することが可能だった。症例を抽出し、薄層クロマトグラフィー (TLC デンシトメトリー) デンシトメトリーによって成木細胞懸濁液にカフェインを定量化するためのプロトコル。

プロトコル

1. カフェインアラビカの c. l. の細胞懸濁液の抽出

  1. C. アラビカ細胞懸濁液9を使用します。連続光 (8.3 W/m2) の下で 25 の ° C で揺れ定数 100 rpm と ph 4.3 培地、培培地で隔週のサブカルチャが懸濁液を維持します。
  2. 11 μ m 孔フィルター紙とブフナーを使って吸引ろ過の下のセルを収穫します。
  3. スケールを使用してください集められたセルの新鮮重を登録、アルミ箔でそれらをラップ、液体窒素で凍結、分析まで-80 ° C で保存しています。
  4. 72 h の冷凍細胞物質を凍結乾燥します。
  5. 乾物収量を推定するために凍結乾燥させたセルの重量を登録します。
  6. 粉末状の材料を再利用可能なポリエチレン袋 (9 cm x 7.5 cm) に格納します。使用するまで微粉末および乾燥器でストアに材料を漬け込みます。
  7. 分析スケール細胞乾物の 0.5 g を測定し、ガラスのフラスコ (25 mL) を追加します。
    1. 凍結乾燥細胞にアセトン 10 mL を追加し、30 の渦のミキサーで混合均質化の s。アルミ箔でフラスコを封印します。
    2. 室温 (25 ° C) で、回転子を用いた 5 h 100 rpm でミックスします。
  8. 15 mL コニカル チューブおよび 13,000 × gで遠心する 10 分転送液体新しい管へのフェーズし、それを減らすためにすべての材料を転送ヒューム フードに室温で乾燥します。
  9. アセトンの 25 μ L のサンプルを再懸濁します。

2. 薄いによってカフェインの評価条件層クロマトグラフィー (TLC)-デンシトメトリー

  1. 以前再懸濁のカフェイン抽出物の 1 μ L を固定相に適用します。
    注: シリカゲル プレート (F254) は、固定相として使用されます。サンプルを適用する前にプレート 10 ml のクロロホルム - メタノール [9:1 v/v] クロマトグラフィー チャンバー内で開発された (14 cm × 12 cm × 9.5 cm)、プレートは室温で乾燥されました。サンプルが適用されるクロマトグラフィーによる板の特性は、図 1のとおりです。商工会議所は、プレートを開発する前に溶剤で 30 分間飽和だった。TLC プレートは、汚染を避けるために手袋を使用して処理しなければなりません。
  2. 移動相のシクロヘキサン アセトン [40: 50 v/v] 10 mL でクロマトグラフィー室で TLC を開発します。
    注: この混合物は 0.34 の保持因子 (Rf) でカフェインの分離をことができます。
    1. 商工会議所から TLC プレートを削除し、それが室温で完全に乾かします。
  3. 短波長紫外線のカフェイン バンドを視覚化 (紫外線 254 nm)。コンパクトな UV ランプを使用します。さらに、この手順の使用は紫外線保護とゴーグルします。
  4. 273 のデンシトメトリーによるカフェインのレベルを定量化する nm。楽器は、クロマトグラフィー ソフトウェアで制御されます。

3. リボ核酸 (RNA) の分離

  1. 手順 1.1 とろ紙 (11 μ m 孔サイズ) 真空濾液から細胞懸濁液を取る。
  2. フィルター ペーパーから携帯電話の資料の収集、分析用天秤の細胞材料の 0.5 g を量り、アルミ箔のパックします。リキッド N2サンプルを凍結します。
  3. 液体窒素で磁器モルタルの細胞サンプルを漬け込むし、均質になるまで RNA 分離試薬 1 mL を加えます。
    注: は、6 h RNA 分離試薬には、フェノール、グアニジン イソチオ シアン酸およびその他のコンポーネントが含まれています、300 ° C でまっフル炉で磁器モルタルを滅菌します。
    1. 滅菌遠心チューブ (1.5 mL) を 500 μ L のサンプルを転送します。釣合いフェノール (pH 8.0) の 300 μ L 300 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1) を追加します。
  4. ボルテックス ミキサーでサンプルを混合し、4 ° C で 15 分間 20,000 × gで遠心分離
  5. 上部の段階の 300 μ L を微量遠心チューブに転送します。200 μ L のイソプロパノールを追加します。-20 ° C で 1 時間の管を孵化させなさい
  6. 4 ° C で 10 分間、12,000 × gでチューブを遠心し、液相をデカントします。
    1. チューブではペレットを形成し (70%)、エタノール 1 mL を追加します。12,000 × g 10 分間遠心分離機し、デカントします。この手順を 2 回繰り返します。
  7. 室温 (25 ° C) で 1.5 h のサンプルを乾燥させます。ピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 25 μ L の RNA 抽出を再停止しなさい-処理水。
    注: RNA の抽出、0.1% DEPC v/v で処理水を使用します。

4. デオキシリボヌクレアーゼ (DNase) と RNA 転写産物のインキュベーション

  1. 滅菌遠心管に 2 μ g の総 RNA の抽出を追加します。10 x 反作用バッファー (100 mM トリス-HCl、MgCl2、25 mM 1 mM CaCl2) の 1 μ L を追加します。1 U/μ L DNase の 1 μ L を追加します。
    1. DEPC 処理水の 10 μ L の最終巻に反応をもたらします。ミックス サンプルと 2,000 x gで簡単に 1 分間遠心します。
  2. 30 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
  3. 50 mM エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム水和物 (ナ2EDTA) の 1 μ L 添加による反応を停止し、10 分の 65 ° C でサンプルをインキュベートします。
  4. Agarose のゲルの電気泳動によって RNA の整合性を分析します。
    1. 標準的な 1% の agarose のゲルの準備し、核酸染色ソリューション間をインターカ レート × 3 の 1 μ L で染色します。
    2. 500 を適用 agarose する ng の RNA のゲル、ゲルを実行します。
    3. RNA のゲルの写真ドキュメンテーション システムを使用しての整合性を視覚化します。
    4. 逆転写酵素により cDNA 合成のテンプレートとして RNA を使用。

5. 相補的デオキシリボ核酸 (cDNA) 合成

  1. 微量遠心チューブに総 RNA の 2.5 μ g を追加します。Deoxythymine-オリゴ (dT) プライマーの 1 μ L を追加し、ヌクレアーゼ フリー水 13 μ L 最終巻に管を埋めます。サンプルを混合し、遠心分離機の 1 分の 2,000 x g 。
  2. 65 ° c 5 分放置、2 分のための 4 ° C のサンプルをインキュベートします。
  3. 逆転写酵素 (200 U/μ L) の 1 μ L、2 μ L deoxynucleotide 三リン酸塩 (dNTPs) ミックス (各 dNTP の 10 mM) の逆転写酵素反応バッファー x 5 の 4 μ L を追加します。穏やかに混合し、1 分 2,000 × gで遠心分離機します。
  4. 45 ° C、50 分で、その後 10 分の 70 の ° C のサンプルをインキュベートします。
  5. 紫外線分光光度計を用いた cDNA の濃度を定量化します。
  6. ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の cDNA のテンプレートとして使用します。
    注: 反応バッファー 10 として使用された (ステップ 4.1.1) x 5 倍濃縮 (ステップ 5.3) それぞれと。

6. リアルタイムの量的な PCR (qPCR) 遺伝子CCS1を増幅するには

  1. PCR 微量遠心チューブに 5-カルボキシメチル-X-ローダミン (ロックス) の Taq DNA ポリメラーゼ (0.1 U/mL) × 2 と 0.1 μ M の 7.5 μ L を追加します。
    注: ホット スタート Taq DNA ポリメラーゼ 2 x は 2 倍濃縮のソリューションとして使用されました。
    1. ヌクレアーゼ フリー水の 5 μ L を追加します。
    2. CCS1 (AB086414) の遺伝子を増幅するため、10 μ M の前方および逆プライマーの 0.75 μ を追加 (前方: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' と逆: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3')。チューブリンのプライマーを使用して、別の反応で家は維持遺伝子として (前方: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' と逆: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')9。
    3. 600 を追加 cDNA テンプレートの ng。
  2. 2 分、95 ° C で 5 分間インキュベート反応のリアルタイム PCR システム 30 95 ° C の 40 のサイクルの増幅反応 50 ° c を実行する s、60 ° C、30 s および 30 のための 72 ° C s。
  3. 50 ° c のサンプルをインキュベート 30 s および 20 ° C、10 s。
  4. PCR ソフトウェアを使用してデータを分析します。
  5. 2 相対的な式を計算-Livak と Schmittgen (2001)12で表されるΔΔCTメソッド。
    注: は、汚染された廃棄試薬または増幅プライマー二量体に DNA テンプレート (テンプレート コントロールなし、NTC) を除くすべてのコンポーネントが含まれているコントロールの反応を分析します。

7 細胞懸濁液、成木l. の総蛋白質エキス

  1. 培地間隙のろ紙を真空下で細胞を懸濁液をフィルター処理します。
  2. 細胞材料の 1 グラムの重量を量るし、アルミ箔のパックします。
    1. 液体窒素でサンプルを凍結します。微粉末を入手するために滅菌磁器モルタルでサンプルを漬け込みます。
  3. ガラスの瓶にサンプルを転送し、追加 2.5 mL 抽出バッファー (400 mM トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン塩酸塩 (トリス-HCl)、ph 8.0、10 mM β-メルカプトエタノール、5 mM ナ2EDTA とアスコルビン酸ナトリウム 0.5% (w/v) を含みます。
    1. 2 分間ボルテックス ミキサーでサンプルをミックスします。
      注: サンプルはタンパク質の変性を防ぐために氷で保たれることが重要です。
  4. 4 ° C で 20 分 20,000 × gのサンプルを遠心し、セラム チューブ (2 mL) を 500 μ L の因数を転送します。使用するまで-72 ° c のサンプルを格納します。
  5. 562 でサンプルのタンパク質濃度の測定標準としてウシ血清アルブミンとビシンコニン酸アッセイを用いた分光光度計で nm。

カフェイン合成酵素酵素試金8。

  1. 200 μ M サム、メチル [3H] の 4.07 kBq を含む微量遠心チューブに反応混合物を準備-サム、200 μ M テオブロミン、200 μ M MgCl2、および 5 μ M カフェイン。100 mM トリス塩酸 pH 8.0 で 200 μ L にボリュームを上げます。
  2. 氷の上遠心チューブを維持し、可溶性蛋白質の 7-9 mg を含む量を追加します。渦でミックスし、サーモスタット付けバス/サーキュレータで 30 ° C で 30 分間インキュベートします。いくつかのサンプルのバッチ、正確な期間が 30 分ですべてのサンプルの反応を停止する十分な時間を与えるため 1 分期間の重複の各サンプルを孵化させなさい。
    1. 反応を停止し、渦のミキサーでサンプルを振るクロロホルム 1 mL を追加します。溶媒中で放射性のカフェインを削除する 3 分の渦のミキサーを使用してサンプルを振る。
  3. 11,000 x gで 5 分でサンプルを遠心し、慎重に 900 μ L のボリュームを回復します。その後、サンプルをシンチレーション バイアルに転送します。
  4. 室温 25 ° C でフードの乾燥を完了するクロロホルムを蒸発します。バイアルにシンチレーション液 5 mL を追加し、サンプルをミックスします。
  5. シンチレーション カウンターのカフェインに組み込まれて放射能を分析します。

結果

カフェイン抽出物紹介プロセスを介して取得は、図 1に示すスキームに従ってプレートクロマトグラフィにサンプルをかけることによって TLC デンシトメトリーによって分析されました。この化合物は商業標準の様々 な濃度の細胞抽出液のカフェイン、カーブのレベルを定量化するには、(図 2 a) を使用します。カフェイン?...

ディスカッション

カフェイン コンテンツを評価するための最適の条件をここで提案する、CS 活動とトラン スクリプト レベルの体外植物ティッシュ文化、成木の細胞懸濁液など。以前のレポートは、カフェイン成分分離手法を評価することが可能となって、カフェインのレベルを高めるための適切なパラメーターを維持する細胞と培養液中のテオブロミンの存在下で光照射下におけるには確認し?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

当研究室の仕事は、SMTHS に国立ナシオナル デ サイエンス y テクノロジー (CONACyT 219893) からの助成金によって賄われていた。この研究も、CONACyT、システマー ナシオナル ・ デ ・ Investigadores (4422) で RJPK (号 37938) に与えられる奨学金によって支えられました。著者は、この原稿の執筆の間に、そのインストールの使用のため CIATEJ をありがちましょう。特別な感謝は、この記事の撮影中に施設の分子生物学セクションとバレンティン メンドーサ ・ ロドリゲス、IFC、UNAM のすべての推薦の博士ビクター マヌエル ・ ゴンサレス ・ メンドーサまで延長されます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Murashige & Skoog Basal salt mixturePhytoTechnology LaboratoriesM524Packge Size: 50 L
Reagent (mg/L)
Ammonium Nitrate (1650)
Boric acid (6.2)
Calcium chloride, anhydrous (322.2)
Cobalt Chloride•H2O (0.025)
Cupric Sulfate•5H2O (0.025)
Na2EDTA•2H2O (37.26)
Ferrous Sulfate•7H2O (27.8)
Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7)
Manganese Sulfate•H2O (16.9)
Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25)
Potassium Iodide (0.83)
Potassium Nitrate (1900)
Potassium Phosphate, Monobasic (170)
Zinc Sulfate•7H2O (8.6)
Supplemented with
myo-inositol (100)
thiamine (10)
cysteine (25)
sucrose (30000)
2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3)
6-benzylamine purine (1)
CaffeineSIGMAC0750-5GSTANDARD-5g
TheobromineSIGMAT450020 g
CAMAG TLC Scanner-4CAMAG27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager softwareCAMAG1.4.10Software
Isoamyl alcohol (24:1)SIGMAC-0549500 mL
CyclohexaneJALMEXC4375-131 L
AcetoneJ.T. BAKER9006434 L
MethanolJ.T. BAKER9093-034 L
ChloroformJALMEXC-4425-153.5 L
TLC silica gel 60 F254Merck1.05554.0001TLC plate
β-mercaptoethanolM6250SIGMA100 mL
(+)-sodium L- ascorbateA4034SIGMA100 g
Trizma baseSIGMAT60661 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%J.T. Baker9535-052.5 L
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific232227Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methioninePerkin ElmerNET155Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vialsSIGMAZ253081
Thermostatic bath/circulatorCole Parmer60714
Micro centrifugue tubeEppendorfTube of 1.5 mL
Cryogenic vialsHeathrow ScientificHS23202A2 mL
Centrifuge 5804Eppendorf5804 000925
VortexThermolyneLR 5947
Porcelain mortarFisherbrandFB961B
Filter paperWhatmanZ274844Porosity medium
PicofugeStratagene4005502000 x g
Analytical balanceANDHR-120Model HR-120
Scintillation counterBeckman Coulter6500
Gel photodocumentation systemBio-RadChemic XRSModel Chemic XRS
Compact UV lampUVP95002112UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnelSIGMA2419907Type 37600 mixer
TRIzol reagentThermo scientific15596-018200 mL
ReverdAid Reverse transcriptaseThermo scientific#EP044110000 U
Oligo (dT)18 primerThermo scientific#S0131100 µM
DNase I, RNase-freeThermo scientific#EN05251000 U
Magnesium chlorideThermo scientificEN05251.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acidThermo scientificEN05251 mL
dNTP mixThermo scientificR0191R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)Thermo scientificK0251For 200 reactions of 25 µL
PikoRealThermo scientific2.2Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, UltrapureUSBJ75829100 mL
Isopropyl alcoholKaral20401 L
Ethyl alcoholSIGMA641751 L
Diethyl pyrocarbonateSIGMAD5758100 mL
Lab RotatorLW ScientificMod. LW210

参考文献

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