Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Резюме

Этот протокол описывает эффективная методология для извлечения и количественной оценки кофеина в клеточных суспензий л. C. arabica и экспериментальный процесс оценки Ферментативная активность кофеин синтазы с уровнем экспрессии ген, который кодирует этого фермента.

Аннотация

Кофеин (1,3,7-trimethylxanthine) является Пуриновые алкалоиды в популярных напитков, как кофе и чай. Это вторичные метаболиты рассматривается как химической обороны, потому что она обладает антимикробной активностью и считается природных инсектицидов. Кофеин может также производить отрицательный аллелопатические эффектов, которые предотвратить рост окружающих растений. Кроме того люди во всем мире потребляют кофеин для его болеутоляющим и стимулирующее воздействие. Из-за интереса в области технологического применения кофеина выросла исследований биосинтетических пути этого соединения. Эти исследования были главным образом сосредоточены на понимание биохимических и молекулярных механизмов, которые регулируют биосинтеза кофеина. В vitro тканевой культуры стала полезной системы для изучения этой биосинтетических путь. Этой статье будут описаны пошаговые протокол для количественного определения кофеина и для измерения уровней Транскрипт гена (CCS1) кодирования кофеин синтазы (CS) в клеточных суспензий C. arabica л, а также ее деятельности.

Введение

Кофеин является вторичные метаболиты, biosynthesized растениями рода Coffea¹. Этот алкалоид принадлежит к семейству метилксантина и рассматривается как химический завод обороны, потому что он может выступать против неблагоприятных последствий патогенов и травоядных животных^2,3. Кроме того этот метаболит отвечает за стимулирование свойств кофейный напиток, который обычно потребляются во всем мире^4,5. Благодаря своим свойствам несколько исследовательских групп заинтересованы в изучении биосинтетических путь и катаболизма кофеин^6,7. В настоящее время завод в пробирке клеток/тканей культур служат в качестве альтернативы для оценки накопления кофеин под различными биотическими и абиотическими стратегии^8,9.

Кофеин биосинтез включает гидролитическая выпуск 7-метилксантина от соответствующего рибозы нуклеозидов, после чего приказал N-methylations в позициях 3 и 1. Конкретный S- аденозил-метионина (SAM)-зависимых N-метилтрансфераза (NMT) катализирует метилирования в позиции 7, тогда как теобромин синтаза (ТС) и CS участвуют в 3 - и 1-methylations, соответственно, производства теобромин и Кофеин. Изучение генов, кодирующих собственный NMTs позволяет понять механизм, который регулирует кофеин производства^10,11. CS, который имеет N -метилтрансфераза активность, катализирует два последних шага биосинтетических путь кофеин¹¹. В кофе сеянцев было показано, что излучения могут увеличить активность CS, что приводит к увеличению биосинтеза кофеин. Недавно мы показали, что поддержание суспензий клеток C. arabica л под легкие облучения является оптимальное состояние для оценки воздействия, которые производят абиотического стресса факторов, влияющих на биосинтетические путь кофеин⁸. Информация, полученная в рамках этих исследований могут иметь приложений в метаболических систем и техники биологии для максимального изучение кофеин биосинтетических путь в таких системах в пробирке .

Учитывая преимущества получения подходящую модель для изучения биосинтеза кофеин, мы оптимизировали условий извлечения кофеина на клеточных суспензий C. arabica л Также удалось разработать полезные протокол для изучения ферментативную активность, а также методологических шаги для оценки уровня транскриптов гена кофе кофеин синтетазы кодирования этого фермента 1 (CCS1). Здесь мы приводим протокол для извлечения и количественно кофеина в C. arabica клеточных суспензий тонкослойной хроматографии и денситометрии (TLC-денситометрия).

протокол

1. кофеин добыча в клеточных суспензий C. arabica л

1. Используйте суспензий клеток C. arabica ⁹. Поддерживать суспензий, раз в две недели субкультур в фотосинтетическую и Скуг средах при рН 4,3 с постоянной тряски при 25 ° C под непрерывный свет (8,3 Вт/м²) 100 об/мин.
2. Урожай клетки под вакуумной фильтрации с использованием 11 мкм поры фильтра бумаги и воронку Buchner.
3. Зарегистрировать свежие вес собранных клеток, используя шкалу, оберните их в алюминиевой фольги, заморозить их в жидком азоте и держать их на-80 ° C до анализа.
4. Lyophilize замороженные клеточным материалом для 72 ч.
5. Регистрация веса лиофилизированные клетки для того чтобы оценить урожайность сухого веса.
6. Храните порошкового материала в многоразовые полиэтиленовые мешки (9 x 7,5 см). Размачиваем материал для мелкого порошка и в магазине в эксикатор до использования.
7. Измерения 0,5 г сухого вещества сотовой на шкале аналитической и добавить его в стеклянную колбу (25 мл).
   1. Добавить 10 мл ацетона в лиофилизированном клетки и смешать в миксере вихрь 30 s для гомогенизации. Затем уплотнение колбу с алюминиевой фольгой.
   2. Смесь при 100 об/мин, с использованием ротатор при комнатной температуре (25 ° C) для 5 h.
8. Передать все материалы 15 мл Конические трубки и центрифуги на 13 000 x g 10 мин передачи жидкости фазы новой трубки и уменьшить его сухость в вытяжной шкаф при комнатной температуре.
9. Ресуспензируйте образца с 25 мкл ацетона.

2. условия для оценки кофеин, тонкий слой хроматографии (ТСХ)-денситометрия

1. Применить к стационарной фазы 1 мкл концентрированного экстракта ранее ресуспензированы кофеин.
   Примечание: Силикагель пластины (F254) используются в качестве неподвижной фазой. Перед применением образцы, пластины были разработаны с 10 мл хлороформа метанол [9:1 v/v] в камере хроматографии (14 см x 12 см х 9,5 см), и пластины были сушат при комнатной температуре. Характеристики пластину хроматографии, где применяются образцы показаны на рисунке 1. Палата была пропитана растворителя за 30 мин до начала разработки пластину. TLC пластин должен обрабатывать, использовать перчатки, чтобы избежать загрязнения.
2. Разработка TLC в зале хроматографии с 10 мл подвижная фаза циклогексан-ацетона [40:50 v/v].
   Примечание: Эта смесь позволяет разделение кофеина на удержание фактор (РФ) 0.34.
   1. Снять пластину TLC из камеры и дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
3. Визуализировать кофеин полос в короткие волны ультрафиолетового излучения (УФ, 254 Нм). Используйте компактный УФ-лампа. Кроме того для этого шага, использовать очки с УФ-защитой.
4. Количественную оценку уровней кофеин, денситометрия в 273 Нм. Прибор управляется с хроматографии программного обеспечения.

3. рибонуклеиновой кислоты (РНК) изоляции

1. Возьмите клеточных суспензий из шага 1.1 и фильтрат вакуум с фильтровальной бумаги (размер пор 11 мкм).
2. Собирать клеточного материала из фильтровальной бумаги, весят, 0,5 г клеточного материала на аналитический баланс и упаковать его в алюминиевую фольгу. Заморозить образца с жидкостью N₂.
3. Размачиваем образец клеток в фарфоровой ступке с жидким азотом и добавьте 1 mL реагента изоляции РНК до гомогенизированный.
   Примечание: Стерилизуйте минометы фарфора в муфельной печи при температуре 300 ° C, для изоляции реагента 6 ч. РНК содержит фенол, Изотиоцианаты гуанидина и другие компоненты.
   1. Передачи 500 мкл пример в стерильных microcentrifuge трубку (1,5 мл). Добавьте 300 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1) и 300 мкл уравновешенной фенола (рН 8,0).
4. Смешать с вихревой смеситель образец и затем центрифуги на 20000 x g 15 мин при 4 ° C.
5. Перевести 300 мкл этапа верхней пробки microcentrifuge. Добавьте 200 мкл изопропанола. Инкубировать трубки для 1 ч при-20 ° C.
6. Центрифуга трубки на 12000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, а затем декантируют жидкой фазы.
   1. Добавьте 1 mL этанола (70%), в форме гранул в трубе. Центрифуга на 12000 x g 10 мин и сцеживаться. Повторите этот шаг два раза.
7. Сухие образца для 1,5 ч при комнатной температуре (25 ° C). Ресуспензируйте экстракт РНК с 25 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды.
   Примечание: Для извлечения РНК, используйте воду, получавших DEPC 0,1% v/v.

4. инкубации Стенограмма РНК с дезоксирибонуклеаза (DNase)

1. В стерильные microcentrifuge трубку добавьте экстракт 2 мкг всего РНК. Добавьте 1 мкл 10 x буфер реакции (100 мм трис-HCl, 25 MgCl₂, 1 мм CaCl₂). Добавьте 1 мкл 1 DNase U/мкл.
   1. Принесите реакция на окончательный объем 10 мкл DEPC-лечение водой. Mix образца и центрифуги кратко на 2000 x g за 1 мин.
2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C за 30 мин.
3. Остановить реакции с добавлением 1 мкл 50 мм динатриевой тетранатрия дигидрат (Na₂ЭДТА) и инкубации образца при 65 ° C для 10 мин.
4. Анализ целостности РНК электрофорезом геля агарозы.
   1. Подготовить стандартный гель агарозы 1% и выведение его с 1 мкл 3 x вставочный решение пятен нуклеиновой кислоты.
   2. Применить 500 нг РНК агарозы гель и запустить геля.
   3. Визуализируйте целостность РНК с помощью геля фото документации системы.
   4. Использования РНК в качестве шаблона для синтеза cDNA, обратной транскриптазы.

5. Дополнительные дезоксирибонуклеиновой кислоты синтеза cDNA (кДНК)

1. Добавьте 2,5 мкг всего РНК пробки microcentrifuge. Добавить 1 мкл праймера oligo-deoxythymine (dT) и заполнить трубу к 13 мкл окончательный объем свободной от нуклеиназы водой. Перемешайте образец и затем центрифуга 2000 x g за 1 мин.
2. Проинкубируйте образцы на 65 ° C за 5 мин и затем на 4 ° C на 2 мин.
3. Добавьте 4 мкл 5 x реакции буфер, используемый для обратной транскриптазы, 2 мкл deoxynucleotide трифосфаты (дНТФ) смеси (10 мм каждого dNTP) и 1 мкл обратной транскриптазы (200 U/мкл). Осторожно перемешать и центрифуги на 2000 x g за 1 мин.
4. Инкубируйте образца на 45 ° C 50 мин, а затем при 70 ° C на 10 мин.
5. Количественного определения концентрации cDNA, используя Спектрофотометр UV.
6. Используйте cDNA как шаблон для полимеразной цепной реакции (ПЦР).
   Примечание: В буфер реакции был использован в качестве 10 x (шаг 4.1.1) и 5 x раз сосредоточены (шаг 5.3), соответственно.

6. в реальном времени количественного PCR (ПЦР) для того чтобы усилить гена CCS1

1. Добавьте 7,5 мкл Taq ДНК полимеразы 2 x (0,1 ед/мл) и 0,1 мкм 5-карбоксильную X-родамин (ROX) пробки microcentrifuge ПЦР.
   Примечание: Горячий старт полимеразы дна Taq 2 x был использован в качестве решения 2 x концентрации.
   1. Добавьте 5 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
   2. Добавьте 0,75 мкл 10 мкм прямого и обратного праймера для того чтобы усилить гена CCS1 (AB086414) (вперед: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' и обратное: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Использовать Праймеры для тубулин, как уборка гена в отдельном реакции (вперед: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' и обратное: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Добавить 600 нг cDNA шаблона.
2. Выполните реакции амплификации при 50 ° C за 2 мин и 95 ° C за 5 минут инкубации реакции в системе реального времени PCR для 40 циклов 95 ° c за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 30 s.
3. Инкубировать образца при температуре 50 ° C за 30 s и 20 ° C для 10 s.
4. Анализировать данные с помощью ПЦР программного обеспечения.
5. Вычислить относительное выражение 2-^ΔΔCT метод описан Livak и Schmittgen (2001)¹².
   Примечание: Анализ реакции управления, которая содержит все компоненты, за исключением ДНК шаблон (без шаблона элемента управления, NTC) для удаления загрязненных реагентов или амплификации грунт димеры.

7. Общий экстракт белков клеточных суспензий C. arabica л

1. Фильтрации суспензий клеток под вакуумом с бумагой средне поры фильтра.
2. Весят 1 g клеточного материала и упаковать его в алюминиевую фольгу.
   1. Заморозить образца с жидким азотом. Размачиваем образец в стерилизованные фарфоровой ступке для получения мелкодисперсного порошка.
3. Передать образец стекла флакона и добавить 2,5 мл извлечения буфера (400 мм трис (гидроксиметил) aminomethane гидрохлорид (Tris-HCl), при рН 8,0, содержащие β-меркаптоэтанол 10 мм, 5 мм Na₂ЭДТА и Аскорбат натрия 0,5% (w/v).
   1. Перемешайте образец в вихревой смеситель на 2 мин.
      Примечание: Важно, что образец хранится на льду во избежание денатурации белков.
4. Центрифугуйте образцы на 20000 x g 20 мин при температуре 4 ° C и передачи 500 мкл аликвоты в криогенных флаконов (2 мл). Хранить образцы-72 ° c до использования.
5. Измерить концентрацию белка образца в 562 Нм в спектрофотометр с помощью bicinchoninic кислоты пробирного с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

8. ферментативный Assay для синтазы кофеин

1. Приготовить смесь реакции в microcentrifuge тубы 200 мкм Сэм, 4.07 КБК метил [³H]-Сэм, 200 мкм теобромин, 200 мкм MgCl₂и 5 мкм кофеин. Повышайте громкость до 200 мкл с 100 мм трис-HCl при рН 8,0.
2. Держите пробки microcentrifuge на льду и добавить тома растворимых фракций, содержащих 7-9 мг белка. Затем смешать вихря и Инкубируйте 30 мин при 30 ° C в термостатический термостат. Для выпечки несколько образцов Инкубируйте каждый образец в двух экземплярах в 1 мин периоды дать достаточно времени, чтобы остановить реакции для всех образцов в точное время период 30 мин.
   1. Добавьте 1 мл хлороформа для остановки реакции и затем встряхнуть образца с вихревой смеситель. Встряхните образца с помощью вихревой смеситель для 3 мин для удаления радиоактивных кофеин в растворителе.
3. Центрифугуйте образцы на 11000 x g 5 минут и тщательно восстановить объем 900 мкл. Затем перенесите образцы на сцинтилляционный флаконов.
4. Испарится метилхлороформа завершить сухости в капот при комнатной температуре в 25 ° C. Добавить 5 мл жидкости сцинтилляционные флакона и перемешать образца.
5. Анализируйте радиоактивности, включены в кофеин в сцинтилляционный счетчик.

Результаты

Кофеин экстракты, полученные через этот процесс, представленные здесь были проанализированы TLC-денситометрия, подвергая образцы для пластины хроматографии по схеме показано на рисунке 1. Для количественной оценки уровни кофеина в клеточных экстракто?...

Обсуждение

Мы представляем оптимальные условия для оценки содержания кофеина, уровней активности и Стенограмма CS в в vitro растений культуры ткани, такие как клеточных суспензий C. arabica. Предыдущие доклады подтвердили, что поддержание клетки под легкие облучения и в присутствии теобромин в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210