Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali

Riepilogo

Questo protocollo descrive una metodologia efficace per l'estrazione e la quantificazione di caffeina in sospensioni cellulari di L. c. arabica e un processo sperimentale per valutare l'attività enzimatica della sintasi di caffeina con il livello di espressione il gene che codifica per questo enzima.

Abstract

(1,3,7-trimetilxantina) la caffeina è un alcaloide della purina presente nelle popolari bevande quali caffè e tè. Questo metabolita secondario è considerato come una difesa chimica perché ha attività antimicrobica ed è considerato un insetticida naturale. La caffeina può anche produrre effetti negativi allelopatiche che impediscono la crescita di piante circostanti. Inoltre, persone in tutto il mondo consumano caffeina per i suoi effetti analgesici e stimolatori. A causa di interesse per le applicazioni tecnologiche di caffeina, ricerca sulla via biosintetica di questo composto è cresciuta. Questi studi si sono concentrati principalmente sulla comprensione dei meccanismi biochimici e molecolari che regolano la biosintesi di caffeina. Coltura in vitro del tessuto è diventato un sistema utile per lo studio di questa via biosintetica. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la quantificazione di caffeina e per misurare i livelli di trascrizione del gene (CCS1) codifica caffeina sintasi (CS) in sospensioni di cellule di c. arabica L., come pure la sua attività.

Introduzione

La caffeina è un metabolita secondario che è biosynthesized da piante del genere Coffea¹. Questo alcaloide appartiene alla famiglia delle metilxantine ed è considerato come una difesa di impianto chimico perché può agire contro gli effetti contrari di agenti patogeni ed erbivori^2,3. Inoltre, questo metabolita è responsabile per le proprietà stimolanti della bevanda caffè, che è comunemente consumato in tutto il mondo^4,5. Grazie alle sue proprietà, diversi gruppi di ricerca sono interessati a studiare la via biosintetica e catabolismo di caffeina^6,7. Attualmente, colture di vegetali in vitro cellule/tessuti servono come un'alternativa per la valutazione di accumulo di caffeina sotto varie strategie biotici e abiotici^8,9.

Biosintesi di caffeina coinvolge il rilascio idrolitico di 7-methylxanthine dai nucleosidici ribosio corrispondente seguito da ordinato N-iperomocisteinemici nelle posizioni 3 e 1. Una specifico S- adenosil metionina (SAM)-dipendente N-metiltransferasi (NMT) catalizza la metilazione in posizione 7, considerando che la teobromina sintetasi (TS) e CS sono coinvolti in 3 e 1 iperomocisteinemici rispettivamente, producendo teobromina e caffeina. Lo studio dei geni che codificano distinti NMTs ha permesso la comprensione del meccanismo che regola la caffeina produzione^10,11. CS, che ha attività di N -metiltransferasi, catalizza gli ultimi due passaggi della via biosintetica di caffeina¹¹. Nei semenzali di pianta del caffè, ha dimostrato che la radiazione luminosa può aumentare attività di CS, che si traduce in un aumento della biosintesi di caffeina. Recentemente, abbiamo dimostrato che il mantenimento delle sospensioni di cellule di c. arabica L. sotto irradiazione di luce è la condizione ottima per valutare gli effetti che producono fattori di stress abiotici che influenzano la via biosintetica di caffeina⁸. Le informazioni ottenute in questi studi possono avere applicazioni in biologia di ingegneria e sistemi metabolica per massimizzare lo studio della via biosintetica caffeina in tali sistemi in vitro .

Considerati i vantaggi di ottenere un modello adatto per lo studio della biosintesi di caffeina, abbiamo ottimizzato le condizioni di estrazione di caffeina su sospensioni di cellule di c. arabica L. È stato anche possibile sviluppare un protocollo utile per studiare l'attività enzimatica, nonché passaggi metodologici per valutare il livello delle trascrizioni del gene di Coffea caffeina sintasi 1 (CCS1) codifica per questo enzima. Qui, segnaliamo un protocollo per estrarre e quantificare la caffeina in sospensioni di cellule di c. arabica da cromatografia di strato sottile e densitometria (TLC-densitometria).

Protocollo

1. caffeina estrazione in sospensioni di cellule di c. arabica L.

1. Utilizzare c. arabica cella sospensioni⁹. Mantenere le sospensioni da sottoculture bisettimanale nel mezzo di Murashige e Skoog a pH 4,3 con 100rpm costante agitazione a 25 ° C sotto luce continua (8.3 W/m²).
2. Raccogliere le cellule sotto vuoto filtrazione utilizzando 11 µm poro carta da filtro e un imbuto di Buchner.
3. Registrare il peso fresco delle cellule raccolte utilizzando una scala, avvolgerli in carta stagnola, congelarli in azoto liquido e tenerli a-80 ° C fino all'analisi.
4. Lyophilize il materiale cellulare congelato per 72 h.
5. Registrare il peso delle cellule liofilizzate per valutare il rendimento di peso a secco.
6. Conservare il materiale in polvere in sacchetti di polietilene riutilizzabile (9 x 7,5 cm). Macerare il materiale ad una polvere fine e il negozio in un essiccatore fino all'utilizzo.
7. Misurare 0,5 g di sostanza secca cellulare sulla bilancia analitica e aggiungerlo a un fiasco di vetro (25 mL).
   1. Aggiungere 10 mL di acetone per le cellule liofilizzate e mescolate in un miscelatore vortex per 30 s per omogeneizzazione. Quindi, tappare il matraccio con foglio di alluminio.
   2. Mescolare a 100 rpm usando un rotatore a temperatura ambiente (25 ° C) per 5 h.
8. Trasferire tutto il materiale a una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 13.000 x g per 10 min trasferimento liquido fase ad un nuovo tubo e ridurre ad esso secchezza a temperatura ambiente nella cappa.
9. Risospendere il campione con 25 µ l di acetone.

2. condizioni per la valutazione di caffeina da sottile strato cromatografia (TLC)-densitometria

1. Applicare 1 µ l di Estratto di caffeina in precedenza sedimento per la fase stazionaria.
   Nota: lastre di gel di silice (F254) vengono utilizzati come la fase stazionaria. Prima di applicare i campioni, le piastre sono state sviluppate con 10 mL di cloroformio-metanolo [9:1 v/v] in una camera di cromatografia (14 x 12 cm x 9,5 cm), e le piastre sono state essiccate a temperatura ambiente. Le caratteristiche della lastra cromatografica dove sono applicati i campioni sono mostrate nella Figura 1. La camera era saturo per 30 min con solvente prima di sviluppare la piastra. Lastre TLC dovrebbero maneggiare usando guanti per evitare la contaminazione.
2. Sviluppare il TLC nella camera di cromatografia con 10 mL di fase mobile cicloesano-acetone [40:50 v/v].
   Nota: Questa miscela permette la separazione di caffeina ad un fattore di ritenzione (Rf) di 0,34.
   1. Rimuovere la piastra di TLC dalla camera e lasciarla asciugare completamente a temperatura ambiente.
3. Visualizzate le fasce di caffeina in breve lunghezza d'onda di luce ultravioletta (UV, 254 nm). Utilizzare una lampada UV compatta. Inoltre, per questo passaggio, uso gli occhiali con protezione UV.
4. Quantificare i livelli di caffeina da densitometria a 273 nm. Lo strumento è controllato con il software di cromatografia.

3. l'acido ribonucleico (RNA) isolamento

1. Prendere le sospensioni delle cellule dal passaggio 1.1 e filtrato sottovuoto con carta da filtro (porosità µm 11).
2. Raccogliere il materiale cellulare dalla carta da filtro, pesare 0,5 g di materiale cellulare su una bilancia analitica e confezione in carta stagnola. Congelare il campione con liquido N₂.
3. Macerare il campione di cellule in un mortaio di porcellana con azoto liquido e aggiungere 1 mL di reagente di isolamento del RNA finché non omogeneizzato.
   Nota: Sterilizzare i mortai di porcellana in un forno a muffola a 300 ° C per 6 h. RNA isolamento reagente contiene fenolo, guanidina isotiocianato e altri componenti.
   1. Trasferire 500 µ l di campione in una provetta sterile microcentrifuga (1,5 mL). Aggiungere 300 µ l di cloroformio-alcool isoamilico (24:1) e 300 μL di fenolo equilibrato (pH 8.0).
4. Mescolare il campione con un miscelatore vortex e centrifugare quindi esso a 20.000 x g per 15 min a 4 ° C.
5. Trasferire 300 μL della fase superiore ad un tubo del microcentrifuge. Aggiungere 200 μL di isopropanolo. Incubare la provetta per 1 h a-20 ° C.
6. Centrifugare la provetta a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C e quindi decantare la fase liquida.
   1. Aggiungere 1 mL di etanolo (70%) per formare una pallina nel tubo. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min e decantare. Ripetere questo passaggio due volte.
7. Essiccare il campione per 1,5 h a temperatura ambiente (25 ° C). Risospendere l'Estratto di RNA con 25 μL di pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata.
   Nota: Per l'estrazione di RNA, utilizzare acqua trattata con DEPC 0.1% v/v.

4. incubazione del trascritto di RNA con desossiribonucleasi (DNasi)

1. In una microcentrifuga sterile, aggiungere 2 µ g di RNA totale estratto. Aggiungere 1 μL di tampone di reazione x 10 (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1mm CaCl₂). Aggiungere 1 μL di 1 U / µ l dnasi.
   1. Portare la reazione ad un volume finale di 10 μL con acqua trattata con DEPC. Mescolare il campione e centrifugare brevemente a 2.000 x g per 1 min.
2. Incubare il campione a 37 ° C per 30 min.
3. Interrompere la reazione con l'aggiunta di 1 μL di 50mm disodico diidrato di acido etilendiamminotetraacetico (Na₂EDTA) e incubare il campione a 65 ° C per 10 min.
4. Analizzare l'integrità del RNA mediante elettroforesi su gel di agarosio.
   1. Preparare un gel di agarosio all'1% standard e macchia con 1 µ l di 3 x intercalanti acido nucleico macchia soluzione.
   2. Applicare 500 ng di RNA a agarose gel ed eseguire il gel.
   3. Visualizzare l'integrità del RNA utilizzando un sistema di documentazione foto di gel.
   4. Utilizzare RNA come il modello per la sintesi di cDNA dal transcriptase d'inversione.

5. complementare (cDNA) sintesi dell'acido deossiribonucleico

1. Aggiungere 2,5 µ g di RNA totale ad un tubo del microcentrifuge. Aggiungere 1 µ l di primer oligo-deoxythymine (dT) e riempire il tubo fino ad un volume finale di 13 μL con acqua priva di nucleasi. Mescolare il campione e poi Centrifugare a 2.000 x g per 1 min.
2. Incubare il campione a 65 ° C per 5 min e poi a 4 ° C per 2 min.
3. Aggiungere 4 μL di tampone di reazione utilizzata per trascrittasi inversa, 2 μL di miscela di deossinucleotidi trifosfati (dNTPs) (10 mM di ogni dNTP) e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U / µ l): 5x. Mescolare delicatamente e centrifugare a 2.000 x g per 1 min.
4. Incubare il campione a 45 ° C per 50 min e poi a 70 ° C per 10 min.
5. Quantificare la concentrazione di cDNA utilizzando uno spettrofotometro UV.
6. Utilizzare il cDNA come il modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).
   Nota: Il tampone di reazione è stato utilizzato come 10 x (punto 4.1.1) e 5 x volte concentrato (punto 5.3), rispettivamente.

6. Real-Time PCR quantitativa (qPCR) per amplificare il Gene CCS1

1. Aggiungere 7,5 μL di Taq DNA polimerasi 2 x (0,1 U/mL) e 0,1 μM di 5-carbossi-X-rodamina (ROX) ad un tubo del microcentrifuge PCR.
   Nota: L'avviamento a caldo la Taq DNA polimerasi 2 x è stato utilizzato come una soluzione 2 x concentrato.
   1. Aggiungere 5 μL di acqua priva di nucleasi.
   2. Aggiungere 0,75 µ l di primer forward e reverse μM in 10 per amplificare il gene CCS1 (AB086414) (avanti: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' e d'inversione: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3'). Utilizzare primer per tubulina come il gene house-keeping in una reazione separata (avanti: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' e d'inversione: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3')⁹.
   3. Aggiungere 600 ng di modello di cDNA.
2. Eseguire la reazione di amplificazione a 50 ° C per 2 min e 95 ° C per 5 min. Incubare la reazione del sistema in tempo reale di PCR per 40 cicli di 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s.
3. Incubare il campione a 50 ° C per 30 s e 20 ° C per 10 s.
4. Analizzare i dati con il software PCR.
5. Calcolare l'espressione relativa della 2-^ΔΔCT metodo descritto da Livak e Schmittgen (2001)¹².
   Nota: Analizzare una reazione di controllo che contiene tutti i componenti tranne il modello di DNA (nessun controllo di modello, NTC) a scartare contaminati reagenti o dimeri dell'iniettore di amplificazione.

7. totale estratto proteico delle sospensioni di cellule di c. arabica L.

1. Sospensioni cellulari filtro sotto vuoto con una carta da filtro medio-poro.
2. Pesare 1 g del materiale cellulare e confezione in carta stagnola.
   1. Congelare il campione con azoto liquido. Macerare il campione in un mortaio di porcellana sterilizzato per ottenere una polvere fine.
3. Trasferire il campione in una fiala di vetro e aggiungere 2,5 mL di tampone di estrazione (400 mM tris (idrossimetil) amminometano cloridrato (Tris-HCl), pH 8.0, contenente 10 mM β-mercaptoetanolo, 5mm Na₂EDTA e ascorbato di sodio 0,5% (p/v).
   1. Mescolare il campione in un miscelatore vortex per 2 min.
      Nota: È importante che il campione è tenuto su ghiaccio per prevenire la denaturazione delle proteine.
4. Centrifugare il campione a 20.000 x g per 20 min a 4 ° C e trasferire 500 aliquote µ l in criogenici fiale (2 mL). Conservare i campioni a-72 ° C fino all'utilizzo.
5. Misurare la concentrazione di proteine del campione a 562 nm in uno spettrofotometro utilizzando dosaggio acido bicinconinico con albumina di siero bovino come standard.

8. analisi enzimatica per la sintasi di caffeina

1. Preparare una miscela di reazione in un tubo del microcentrifuge contenente 200 µM SAM, 4,07 kBq di metile [³H]-SAM, teobromina µM 200, 200 µM MgCl₂e caffeina 5 µM. Aumentare il volume a 200 µ l con 100 mM Tris-HCl a pH 8.0.
2. Tenere il tubo del microcentrifuge sul ghiaccio e aggiungere un volume della frazione solubile contenente 7-9 mg di proteina. Quindi, mescolare Vortex e incubare per 30 min a 30 ° C in un bagno termostatico/circolatore. Per un lotto di campioni diversi, Incubare ciascun campione in duplicato nei periodi 1 min per dare tempo sufficiente per interrompere le reazioni per tutti i campioni in un periodo di tempo esatto di 30 min.
   1. Aggiungere 1 mL di cloroformio per fermare la reazione e poi agitare il campione con un Vortex. Agitare il campione utilizzando un miscelatore vortex per 3 min per rimuovere la caffeina radioattiva nel solvente.
3. Centrifugare i campioni a 11.000 x g per 5 min e attentamente ripristinare un volume di 900 µ l. Quindi, è possibile trasferire i campioni a scintillazione fiale.
4. Evaporare il cloroformio per completare secchezza nella cappa a temperatura ambiente a 25 ° C. Aggiungere 5 mL di liquido di scintillazione al flaconcino e mescolare il campione.
5. Analizzare la radioattività incorporata la caffeina in un contatore a scintillazione.

Risultati

Gli estratti di caffeina ottenuti tramite il processo qui presentato sono stati analizzati da TLC-densitometria sottoponendo i campioni per piastra cromatografia secondo lo schema illustrato nella Figura 1. Per quantificare i livelli di caffeina in estratti delle cellule, una curva con varie concentrazioni di standard commerciali per questo composto è stato utilizzato (Figura 2A). Il modello di assorbanza per la caffeina è stat...

Discussione

Vi presentiamo qui le condizioni ottimali per la valutazione del contenuto di caffeina, livelli di attività e trascrizione di CS in un in vitro pianta coltura tissutale, quali sospensioni di cellule di c. arabica. I rapporti precedenti hanno confermato che le celle mantenendo sotto irradiazione di luce e in presenza di teobromina nel terreno di coltura sono parametri adatti per aumentare il livello di caffeina, che permette di valutare i metodi di separazione di caffeina mediante cromatografia liquida ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210