Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für die Extraktion und Quantifizierung des Koffeins in Zellsuspensionen von C. Arabica L. und einer experimentellen Verfahren für die Bewertung der enzymatischen Aktivität von Koffein-Synthase mit dem Ausdruck Das Gen, das dieses Enzym kodiert.

Zusammenfassung

Koffein (1,3,7-Trimethylxanthine) ist ein Purin-Alkaloid in beliebte Getränke wie Kaffee und Tee vorhanden. Diese sekundären Metaboliten gilt als eine chemische Verteidigung, denn es antimikrobielle Wirkung hat und ein natürliches Insektizid als gilt. Koffein kann auch negative Allelopathische Effekte produzieren, die das Wachstum der umliegenden Pflanzen zu verhindern. Darüber hinaus verbrauchen die Menschen auf der ganzen Welt Koffein für seine schmerzlindernde und stimulierende Wirkung. Aufgrund des Interesses in der technologischen Anwendungen von Koffein ist Forschung auf der biosynthetische Bahn dieser Verbindung gewachsen. Diese Studien konzentrierten sich in erster Linie auf das Verständnis der biochemischen und molekularen Mechanismen, die die Biosynthese von Koffein zu regulieren. In-vitro- Gewebekultur ist ein nützliches System für das Studium dieser biosynthetische Bahn geworden. In diesem Artikel wird Schritt für Schritt-Protokoll für die Quantifizierung von Koffein und Messung der Transkription des Gens (CCS1) Codierung Koffein-Synthase (CS) in Zellsuspensionen von C. Arabica L. sowie seine Tätigkeit beschreiben.

Einleitung

Koffein ist eine sekundäre Metaboliten, die Biosynthesized von Pflanzen der Gattung Coffea¹ist. Dieses Alkaloid gehört zur Familie methylxanthin und gilt als eine Chemiefabrik Verteidigung, weil es gegen die schädlichen Wirkungen von Krankheitserregern und Pflanzenfresser^2,3handeln kann. Dieser Metabolit ist darüber hinaus verantwortlich für die stimulierenden Eigenschaften von Kaffee trinken, die häufig konsumierte weltweit^4,5. Aufgrund seiner Eigenschaften interessieren mehrere Forschergruppen Studium die biosynthetische Bahn und Katabolismus von Koffein^6,7. Derzeit betreuen Pflanzenkulturen in-vitro- Zelle/Gewebe als Alternative für die Bewertung der Koffein-Ansammlung unter verschiedenen biotischen und abiotischen Strategien^8,9.

Koffein-Biosynthese beinhaltet die hydrolytische Freisetzung von 7-methylxanthin aus der entsprechenden Ribose Nukleosid, gefolgt von einem bestellten N-Methylations an den Positionen 3 und 1. Eine spezielle S- Adenosyl-Methionin (SAM)-abhängige N-Methyltransferase (NMT) katalysiert die Methylierung bei Position 7, während Theobromin Synthase (TS) und CS engagieren sich in der 3 - und 1-Methylations, bzw. Herstellung von Theobromin und Koffein. Die Studie von Genen Codierung unterschiedliche NMTs ermöglichte Verständnis der Mechanismen, die Koffein Produktion^10,11regelt. CS, die N -Methyltransferase-Aktivität besitzt, katalysiert die letzten beiden Schritte die biosynthetische Weg Koffein¹¹. Kaffeebaum Sämlinge hat sich gezeigt, dass Lichtstrahlung CS Aktivität erhöhen kann, führt zu einer Zunahme der Koffein-Biosynthese. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der Zellsuspensionen von C. Arabica L. unter Lichteinstrahlung die optimale Voraussetzung ist für die Bewertung der Auswirkungen, die abiotischen Stressfaktoren beeinflussen die biosynthetische Bahn Koffein⁸zu produzieren. Die Informationen in diesen Studien haben Anwendungen in metabolic Engineering und Systembiologie für die Studie des biosynthetischen Koffein-Signalwegs in solchen in-vitro- Systemen zu maximieren.

Angesichts der Vorteile ein geeignetes Modell für die Untersuchung von Koffein Biosynthese zu erhalten, haben wir die Extraktionsbedingungen für Koffein auf Zellsuspensionen von C. Arabica L. optimiert Es war auch möglich, ein nützliches Protokoll für das Studium der enzymatische Aktivität sowie methodische Schritte zur Bewertung des gen Abschriften der Coffea -Koffein-Synthase 1 (CCS1) Kodierung dieses Enzym zu entwickeln. Hier berichten wir über ein Protokoll zum Extrahieren und Koffein in C. Arabica Zellsuspensionen von Dünnschichtchromatographie und Densitometrie (TLC-Densitometrie) zu quantifizieren.

Protokoll

1. Koffein Extraktion in Zellsuspensionen von C. Arabica L.

1. Verwenden Sie C. Arabica Zelle Suspensionen⁹. Pflegen Sie die Suspensionen von zweiwöchentlich Subkulturen in Murashige und Skoog Medium bei pH 4,3 mit konstant 100 u/min schütteln bei 25 ° C unter Dauerlicht (8,3 W/m²).
2. Ernten Sie die Zellen unter Vakuumfiltration mit 11 µm Pore Filterpapier und einen Büchner-Trichter.
3. Registrieren das Frischgewicht der gesammelten Zellen mit Hilfe einer Skala, in Alufolie wickeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff aufbewahren bei-80 ° C bis zur Analyse.
4. Lyophilize das gefrorene Zellmaterial für 72 h.
5. Registrieren Sie das Gewicht der gefriergetrockneten Zellen um das Trockengewicht Ertrag abschätzen zu können.
6. Speichern Sie das pulverisierte Material in wiederverwendbare Polyethylen-Beutel (9 x 7,5 cm). Das Material zu einem feinen Pulver und Shop in einem Exsikkator bis zum Gebrauch einweichen.
7. 0,5 g zellulären Trockenmasse auf der analytischen Ebene zu messen und zu einem Glaskolben (25 mL) hinzufügen.
   1. Die gefriergetrockneten Zellen 10 mL Aceton hinzu und mischen Sie in einem Vortex-Mixer für 30 s für Homogenisierung. Anschließend, versiegeln Sie die Küvette mit Alu-Folie.
   2. Mischen Sie bei 100 u/min mit einem Rotator bei Raumtemperatur (25 ° C) für 5 h.
8. Übertragen Sie sämtliches Material auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 13.000 X g für 10 min. Transfer Flüssigkeit phase zu einem neuen Schlauch und darauf reduzieren Trockenheit bei Raumtemperatur in der Dunstabzugshaube.
9. Die Probe mit 25 µL Aceton aufzuwirbeln.

2. Voraussetzungen für die Beurteilung des Koffeins durch dünne Schicht Chromatographie (TLC)-Densitometrie

1. Gelten Sie 1 µL der zuvor resuspendierte Koffein-Extrakt für die stationäre Phase.
   Hinweis: Silica-Gel-Platten (F254) sind als die stationäre Phase verwendet. Vor der Anwendung der Muster, die Platten wurden mit 10 mL Chloroform-Methanol [9:1 V/V] in einer Chromatographie-Kammer entwickelt (14 x 12 cm x 9,5 cm), und die Platten wurden bei Raumtemperatur getrocknet. Die Merkmale der chromatographischen Platte wo die Proben angewendet werden sind in Abbildung 1dargestellt. Die Kammer wurde für 30 min mit Lösungsmittel gesättigt, vor der Entwicklung der Plattenrandes. TLC-Platten sollten behandelt werden mit Handschuhen um Verunreinigungen zu vermeiden.
2. Die TLC in der Chromatographie-Kammer mit 10 mL der mobilen Phase Cyclohexan-Aceton [40:50 V/V] zu entwickeln.
   Hinweis: Diese Mischung ermöglicht die Trennung von Koffein auf ein Zurückbehaltungsrecht-Faktor (Rf) von 0,34.
   1. Entfernen Sie die TLC Platte aus der Kammer und vollständig bei Raumtemperatur trocknen lassen.
3. Koffein-Bands im kurzwelligen UV-Licht zu visualisieren (UV, 254 nm). Verwenden Sie eine kompakte UV Lampe. Darüber hinaus für diesen Schritt verwenden Brille mit UV-Schutz.
4. Quantifizieren von Koffein durch Densitometrie bei 273 nm. Das Instrument wird mit Chromatographie-Software gesteuert.

(3) Ribonukleinsäure (RNA) Isolierung

1. Nehmen Sie die Zellsuspensionen von Schritt 1.1 und Vakuum Filtrat mit Filterpapier (11 µm Porengröße).
2. Das Zellmaterial aus dem Filterpapier zu sammeln, 0,5 g von Zellmaterial auf einer Analysenwaage wiegen und in Alufolie packen. Einfrieren der Probe mit Flüssigkeit N₂.
3. Die Zellprobe in einem Porzellan-Mörser mit flüssigem Stickstoff mazeriert und 1 mL RNA Isolierung Reagenz bis homogenisiert.
   Hinweis: Sterilisieren Sie die Porzellan-Mörser im Muffelofen bei 300 ° C, 6 h. RNA Isolierung Reagenz Phenol, Guanidin-Herstellung und andere Komponenten enthält.
   1. 500 µL der Probe zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch (1,5 mL) zu übertragen. Fügen Sie 300 µL Chloroform Isoamyl Alkohol (24:1) und 300 μL äquilibriert Phenol (pH 8,0).
4. Mischen Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer und Zentrifugieren Sie es bei 20.000 X g für 15 min bei 4 ° C.
5. Übertragen Sie 300 μL der oberen Phase zu einem Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 200 μl Isopropanol. Inkubieren Sie das Rohr für 1 h bei-20 ° c
6. Das Rohr auf 12.000 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und dann Dekantieren der flüssigen Phase.
   1. Fügen Sie 1 mL Ethanol (70 %) ein Pellet in das Rohr zu bilden. 12.000 x g für 10 min zentrifugieren und Dekantieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
7. Trocknen Sie die Probe für 1,5 h bei Raumtemperatur (25 ° C). Aufschwemmen den RNA-Extrakt mit 25 μL der Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltem Wasser.
   Hinweis: Für die RNA-Extraktion verwenden Sie Wasser mit 0,1 % DEPC V/V behandelt.

(4) Inkubation von RNA-Transkript mit Deoxyribonuclease (DNase)

1. Fügen Sie zu einem sterilen Microcentrifuge Schlauch 2 µg Gesamt-RNA extrahieren. Fügen Sie 1 μl 10 X Reaktion Puffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂). Fügen Sie 1 μl 1 U/µL DNase.
   1. Die Reaktion auf ein Endvolumen von 10 μl mit DEPC-behandeltem Wasser zu bringen. Verrühren Sie Probe und Zentrifuge kurz bei 2.000 X g für 1 min.
2. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C für 30 min.
3. Die Reaktion mit der Zugabe von 1 μl 50 mM binatrium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrat (Na₂EDTA) zu stoppen und die Probe bei 65 ° C für 10 min inkubieren.
4. Analysieren Sie die Integrität der RNA durch Agarose-Gelelektrophorese.
   1. Bereiten Sie eine standard 1 % Agarosegel und Färben Sie es mit 1 µL 3 x verschuppen Nukleinsäure-Fleck Lösung.
   2. Anwenden von 500 ng RNA, die Agarose gel und führen Sie das Gel.
   3. Visualisieren Sie die Integrität der RNA mit einem Gel-Foto-Dokumentationssystem.
   4. Verwenden Sie RNA als Vorlage für die cDNA-Synthese durch Reverse Transkriptase.

5. ergänzende Desoxyribonukleinsäure (DNA) Synthese

1. Fügen Sie 2,5 μg von Gesamt-RNS zu einem Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie 1 μL der Oligo-Deoxythymine (dT) Grundierung und füllen Sie den Schlauch zu einem 13 μL Endvolumen mit Nuklease-freies Wasser. Mischen Sie die Probe und dann Zentrifugieren Sie ein 2.000 X g für 1 min.
2. Inkubieren Sie die Probe bei 65 ° C für 5 min und dann bei 4 ° C für 2 min.
3. Fügen Sie 4 μl 5 x Reaktion Puffer für die Reverse Transkriptase, 2 μL Deoxynucleotide Triphosphate (dNTPs) Mix (10 mM jedes dNTP) und 1 μl Reverse Transkriptase (200 U/µL) verwendet. Vorsichtig mischen und bei 2.000 X g für 1 min zentrifugieren.
4. Inkubieren Sie die Probe bei 45 ° C 50 min. und dann bei 70 ° C für 10 min.
5. Die cDNA-Konzentration mit einer UV-Spektralphotometer zu quantifizieren.
6. Verwenden Sie die cDNA als Vorlage für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
   Hinweis: Die Reaktion Puffer diente als 10 x (Schritt 4.1.1) und 5 X mal konzentriert (Schritt 5.3), beziehungsweise.

(6) Real-Time Quantitative PCR (qPCR) gen CCS1 zu verstärken

1. Eine PCR Microcentrifuge Schlauch 7,5 μl Taq DNA Polymerase 2 x (0,1 U/mL) und 0,1 μM von 5-Carboxy-X-Rhodamin (ROX) hinzufügen.
   Hinweis: Die hot-Start Taq DNA-Polymerase 2 X diente als Lösung 2 x konzentriert.
   1. Fügen Sie 5 μL der Nuklease-freies Wasser.
   2. Hinzufügen von 0,75 μL 10 μM vorwärts- und Grundierung, das gen CCS1 (AB086414) zu verstärken (nach vorn: 5'-CCTGTATCCTGCGATGAACA-3' und reverse: 5'-AACACTATCATAGAAGCCTTTG-3 "). Primer für Tubulin als Housekeeping Gene in einer separaten Reaktion verwenden (nach vorn: 5'-GTGCCCAACTGGGTTCAA-3' und reverse: 5'-CCTTCCTCCATACCTTCACC-3 ")⁹.
   3. Fügen Sie 600 ng cDNA-Vorlage.
2. Durchführen die Verstärkung Reaktion bei 50 ° C für 2 min und 95 ° C für 5 min. die Reaktion in Echtzeit-PCR-System für 40 Zyklen von 95 ° C für 30 inkubieren s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s.
3. Inkubation die Probe bei 50 ° C für 30 s und 20 ° C für 10 s.
4. Analysieren Sie die Daten mit der PCR-Software.
5. Berechnung des relativen Ausdrucks durch die 2-^ΔΔCT -Methode von Livak und Schmittgen (2001)¹²beschrieben.
   Hinweis: Analysieren Sie eine Kontrollreaktion, die alle Komponenten außer der DNA-Vorlage (keine Vorlage Kontrolle, NTC) enthält zu verwerfen kontaminierten Reagenzien oder Verstärkung Grundierung-Dimere.

7. total Proteinextrakt Zellsuspensionen von C. Arabica L.

1. Filter-Zellsuspensionen unter Vakuum mit einem Medium-Pore-Filterpapier.
2. Gewicht von 1 g von Zellmaterial und packen Sie es in Alufolie.
   1. Einfrieren der Probe mit flüssigem Stickstoff. Einweichen der Probe in einem sterilisierten Porzellan-Mörser zu ein feines Pulver zu erhalten.
3. Übertragen Sie die Probe auf eine Glasflasche und 2,5 mL Extraktionspuffer (400 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochlorid (Tris-HCl) bei pH 8.0, mit β-Mercaptoethanol 10 mM, 5 mM Na₂EDTA und 0,5 % (w/V) Natrium Ascorbat.
   1. Mischen Sie die Probe in einem Vortex-Mischer für 2 min.
      Hinweis: Es ist wichtig, dass die Probe auf dem Eis, Protein-Denaturierung zu verhindern gehalten wird.
4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20.000 X g für 20 min bei 4 ° C und übertragen Sie 500 µL-Aliquots in kryogenen Fläschchen (2 mL). Proben bei-72 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
5. Messen Sie die Proteinkonzentration der Probe bei 562 nm in einem Spektralphotometer mit Bicinchoninic Säure Assay mit Rinderserumalbumin als Standard.

8. enzymatische Assays für Koffein-Synthase

1. Bereiten Sie eine Reaktionsmischung in einem Microcentrifuge Schlauch mit 200 µM SAM, 4,07 kBq von Methyl [³H]-SAM, 200 µM Theobromin, 200 µM MgCl₂und 5 µM Koffein. Erhöhen Sie die Lautstärke auf 200 µL mit 100 mM Tris-HCl bei einem pH-Wert von 8,0.
2. Halten Sie den Microcentrifuge Schlauch auf Eis und fügen Sie ein Volumen von die löslichen Fraktion mit 7 bis 9 mg Protein. Dann durch Vortex mischen und 30 min. bei 30 ° C in einem thermostatischen Bad/Zirkulator inkubieren. Inkubieren Sie für einen Stapel von mehreren Proben jede Probe in zweifacher Ausfertigung in 1 min Perioden, genug Zeit, um die Reaktionen für alle Proben in einen genauen Zeitraum von 30 min Halt zu geben.
   1. Fügen Sie 1 mL Chloroform, die Reaktion zu stoppen und dann schütteln Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer. Schütteln Sie die Probe mit einem Vortex-Mixer für 3 min, um das radioaktive Koffein in das Lösungsmittel zu entfernen.
3. Zentrifugieren Sie Proben bei 11.000 X g für 5 min und erholen Sie einem Volumen von 900 µL sorgfältig zu. Übertragen Sie anschließend die Proben auf Funkeln Fläschchen.
4. Verdunsten Sie das Chloroform zur Vervollständigung der Trockenheit in der Haube bei Raumtemperatur bei 25 ° C. Die Ampulle 5 mL Funkeln Flüssigkeit hinzufügen und Mischen der Probenmaterials.
5. Analysieren Sie die Radioaktivität in das Koffein in einem Szintillationszähler integriert.

Ergebnisse

Koffein-Extrakte erhalten über das hier vorgestellte Verfahren analysiert wurden von TLC-Densitometrie durch die Proben um Chromatographie nach dem Schema in Abbildung 1gezeigte Platte zu unterwerfen. Verwendet, um die Ebenen von Koffein in zellextrakte, eine Kurve mit verschiedenen Konzentrationen von kommerziellen Standard zu quantifizieren, denn diese Verbindung war (Abbildung 2A). Das Muster der Absorption für Koffein wurde...

Diskussion

Wir stellen Ihnen hier die optimalen Bedingungen für die Bewertung der Koffein Inhalt, CS Aktivität und Transkript Ebenen in ein in-vitro- Pflanzen Gewebekultur, z. B. Zellsuspensionen von C. Arabica. Frühere Berichten haben bestätigt, dass die Zellen unter Lichteinstrahlung und in Anwesenheit von Theobromin in das Kulturmedium geeignete Parameter für die Erhöhung von Koffein, die es ermöglichen, die Koffein-Trennverfahren bewerten umgekehrt-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HP...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Murashige & Skoog Basal salt mixture	PhytoTechnology Laboratories	M524	Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1)
Caffeine	SIGMA	C0750-5G	STANDARD-5g
Theobromine	SIGMA	T4500	20 g
CAMAG TLC Scanner-4	CAMAG	27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager software	CAMAG	1.4.10	Software
Isoamyl alcohol (24:1)	SIGMA	C-0549	500 mL
Cyclohexane	JALMEX	C4375-13	1 L
Acetone	J.T. BAKER	900643	4 L
Methanol	J.T. BAKER	9093-03	4 L
Chloroform	JALMEX	C-4425-15	3.5 L
TLC silica gel 60 F254	Merck	1.05554.0001	TLC plate
β-mercaptoethanol	M6250	SIGMA	100 mL
(+)-sodium L- ascorbate	A4034	SIGMA	100 g
Trizma base	SIGMA	T6066	1 Kg
Hydrochloric acid 36.5-38%	J.T. Baker	9535-05	2.5 L
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo scientific	232227	Kit
Methyl [3H]-S-adenosyl methionine	Perkin Elmer	NET155	Specific activity of 15 Ci/mmol
Liquid scintillation vials	SIGMA	Z253081
Thermostatic bath/circulator	Cole Parmer	60714
Micro centrifugue tube	Eppendorf		Tube of 1.5 mL
Cryogenic vials	Heathrow Scientific	HS23202A	2 mL
Centrifuge 5804	Eppendorf	5804 000925
Vortex	Thermolyne	LR 5947
Porcelain mortar	Fisherbrand	FB961B
Filter paper	Whatman	Z274844	Porosity medium
Picofuge	Stratagene	400550	2000 x g
Analytical balance	AND	HR-120	Model HR-120
Scintillation counter	Beckman Coulter	6500
Gel photodocumentation system	Bio-Rad	Chemic XRS	Model Chemic XRS
Compact UV lamp	UVP	95002112	UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner funnel	SIGMA	2419907	Type 37600 mixer
TRIzol reagent	Thermo scientific	15596-018	200 mL
ReverdAid Reverse transcriptase	Thermo scientific	#EP0441	10000 U
Oligo (dT)18 primer	Thermo scientific	#S0131	100 µM
DNase I, RNase-free	Thermo scientific	#EN0525	1000 U
Magnesium chloride	Thermo scientific	EN0525	1.25 mL
Ethylenediaminetetraacetic acid	Thermo scientific	EN0525	1 mL
dNTP mix	Thermo scientific	R0191	R0191
SYBR Green qPCR Master Mix (2X)	Thermo scientific	K0251	For 200 reactions of 25 µL
PikoReal	Thermo scientific	2.2	Software
Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure	USB	J75829	100 mL
Isopropyl alcohol	Karal	2040	1 L
Ethyl alcohol	SIGMA	64175	1 L
Diethyl pyrocarbonate	SIGMA	D5758	100 mL
Lab Rotator	LW Scientific	Mod. LW210