המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

Summary

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

Abstract

Lentiviruses הם וקטורים יעיל למסירה גן בתרבית של תאים. בעקבות התמרה חושית, הגנום lentiviral stably הוא שולב כרומוזום המארח, מועברת אל רומא. לפיכך, הם וקטורים אידיאלי עבור יצירה של שורות תאים יציב, ויוו משלוח של אינדיקטורים, התמרה חושית של תא בודד מופרית ביצים כדי ליצור חיות מהונדס. עם זאת, העכבר מופרית ביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן lentiviral. Lentiviruses גדולים מדי כדי לחדור את סונה, מועברים בדרך כלל על ידי microinjection של נגיפים לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים. הדרישה לבעיותיהם מיומנים וציוד מיוחדים יש למזער את השימוש lentiviruses למסירה גן העוברים העכבר. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור permeabilizing את הביצים העכבר מופרית על ידי לנקב את zona עם לייזר. לייזר-ניקוב לא לגרום כל נזק עוברי ומאפשר lentiviruses לקבל גישה לתאים עובריים למסירה גן. Transduced עוברי ניתן להתפתח הבלסטוציסט במבחנה, אם שהושתלו בעכברים pseudopregnant, להתפתח הטרנסגניים הגורים. הלייזר בשימוש פרוטוקול זה הוא יעיל, קל לשימוש. הגנים מועברים על ידי lentiviruses stably לשלב תאים עובריים בעכבר, germline שעוברת ביחסי. זה שיטה חלופית עבור יצירה של העכברים הטרנסגניים הדורשת אין המיקרומניפולציה ו- microinjection של הביצים.

Introduction

בשיטה זו מספק הוראות מפורטות עבור permeabilizing את pellucida zona של העכבר מופרית ביצים כדי להפוך תאים עובריים לנגיש עבור המסירה הגן על-ידי lentiviruses. Lentiviruses תוכננו על ידי הטבע למסירה גן יעיל בתרבית של תאים. הם להדביק תאים החלוקה הלא-חלוקת ולשלב את הגנום lentiviral שלהם מארח כרומוזומים¹. טווח התאים מארח lentiviral ברצון מורחבת מאת pseudotyping את lentivirus רקומביננטי עם גליקופרוטאין וירוס vesicular stomatitis (VSV-G), בשל tropism רחב של חלבון VSV-G². בעקבות התמרה חושית, גנים lentiviral stably משולב, הביע כחלק בכרומוזומים המארח שלהם יצירת כלי אידיאלי ליצירת חיות מהונדס. אם תימסר לתאים עובריים בשלב מוקדם, הגנום lentiviral משוכפלת, שבאה לידי ביטוי בכל המנגנון. התמרה חושית lentiviral הוביל הייצור של עכברים, עכברושים, עוף, שליו, חזיר^3,4,5,6,,⁷ , בין מינים אחרים של transgenics. השיטה טיפוסי של המסירה הגן lentiviral, עם זאת, דורשת טכנאים מיומנים וציוד מיוחדים כדי להתגבר על המכשול zona pellucida המכיל את העוברים בשלב מוקדם. המטרה הכוללת של שיטה זו הוא לתאר כיצד permeabilize את zona באמצעות לייזר כדי להקל על המסירה הגן lentiviral.

ביצים יונקים מוקפים את pellucida zona אשר מתקשה בעקבות הפריה להגן על הביצים מפני polyspermy וכדי להגביל את האינטראקציות סביבתיים^8,9. Zona יוצרת מחסום שמונע lentiviruses מן התאים מתחלקים עד העוברים בוקעים כמו הבלסטוציסט. העכבר בתרבית מופרית ביצים הפתח לאחר 4 ימים, חייב להיות מושתלים לתוך עכברים pseudopregnant לפני הבקיעה להתפתחות הרגילה לתוך הגורים. לכן, עבור התמרה חושית, lentiviruses הן microinjected לפני הבקיעה מן zona לתוך החלל perivitelline, הרווח בין zona של תאים עובריים.

Pellucida zona יוסר לעיתים קרובות עבור הפריה במבחנה של ביצים אנושי כדי להגביר את קצב הפריה¹⁰. אולם, הסרת כימי של העכבר zona pellucida לרעה משפיעה על התפתחות העובר העכבר, מזיקה תאים עובריים^11,12. שיטות נוספות המסירה הגן ביצים העכבר מופרית להתגבר על המכשול zona pellucida על ידי microinjection ישירה של ה-DNA לתוך גרעין התא¹³. Pronuclear microinjection הוא אמצעי יעיל של אספקת גנים העוברים. עם זאת, מאז כל העובר מתקיים במקום בנפרד עבור microinjection, התרגול ניתן מפרך וצורכת זמן למשתמש המתחיל.

שיטות אחרות כגון אלקטרופורציה photoporation שימושיים ארעי, המסירה הגן לטווח קצר העכבר מופרית ביצים^14,15,16. שיטות אלה משמשים בהרחבה להעברת רכיבים CRISPR-Cas9 ו- recombinases. עם זאת, משלוח אלקטרופורציה ו- photoporation של גנים לא ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור transgenics. Spermatozoa הנאספות מן העכבר מנוקבת יותרת האשך יכול גם להיות transduced על ידי lentiviruses, שימוש עבור הפריה במבחנה להפקת חיות הטרנסגניים^{17,18,19, 20}.

ב פרוטוקול זה, המסירה הגן lentiviral העכבר עוברי בהנחייתם permeabilizing את zona באמצעות לייזר. הלייזר XYClone פותחה ככלי סיוע עבור במבחנה הדישון²¹ וטיפוח של תאי גזע עובריים²². זה מנגנון קטן פשוט להתקנת וניתן קל לשימוש. פעם להתקין מיקרוסקופ, הנתפש המרחב של עדשת המטרה בתוכנה הנלווית מאפשר מכוון הלייזר תוך התבוננות דרך של עיניות מיקרוסקופ (ראה פרוטוקול: סעיף 3). ברגע סונה הוא מחורר על ידי לייזר XYClone, lentiviruses יכול להיות מוחדרים התקשורת תרבות עבור ג'ין משלוח²³. ניתן להשתמש lentiviruses מרובים בו זמנית לספק מספר גנים של התאגדות כרומוזומלית.

פרוטוקול זה יתאר כיצד לבודד, תרבות העכבר מופרית ביצים, מדגים את השימוש בלייזר עבור ניקוב של pellucida zona, ממחישה את התמרה חושית של תאים עובריים בעכבר על-ידי lentiviruses.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים וטיפולים בשימוש פרוטוקול זה היו בהתאם להנחיות NIH/NIEHS טיפול בבעלי חיים, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה (ACUC) ב NIH/NIEHS, חיה פרוטוקול 2010-0004.

1. תכשירים

1. להכין/רכישה של recombinant lentiviruses הפצת שאינו נושא את הגן עניין. במחקר זה, lentivirus SBI511 ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק שטרגליים (copGFP; מקוצר GFP) של התארכות פקטור 1a יזם שימש עבור התמרה חושית. פרוטוקולים סטנדרטיים² שימשו כדי לייצר, כייל נוגדנים lentiviruses ב titers גבוה יותר 1e8 יחידות transducing mL (טו/mL).
   הערה: שימוש באזהרה, אקונומיקה כל חומר זה יצר קשר עם lentiviruses. עיין ההנחיות של המכון שלך שימוש בטוח וטיפול lentiviruses.
2. ההתקנה זוגות של העכבר הרצוי זן יום לפני הקטיף עוברי. בניסוי זה, שימשה C57BL/6J זן של עכברים. לא טופלו עכברים הנשי משמש השחלות ואוסף oviduct עם כל ההורמונים עבור superovulation.
3. 2 – 24 שעןת לפני הקטיף העכבר מופרית ביצים, להכין מספר בינוני ממוטב סימפלקס אשלגן²⁴ (KSOM) ירידה צלחות כדלקמן: להוסיף טיפה 50 μL KSOM בינוני עד לאמצע 35 מ מ שטופלו תרביות רקמה צלחת ומכסים עם 2 מיליליטר Dimethylpolysiloxane (DMPS5X), במקום 37 ^oC, 5% CO₂, 5% O₂ ו 90% N₂ כדי equilibrate.
   הערה: השתמש צלחות פלאסטיק חד פעמי סטרילי וזורקים בעקבות החשיפה lentiviruses.
4. להכין x 1, תמיסת hyaluronidase M2 בינוני מהפתרון מניות (100 x, 30 מ"ג/מ"ל, לאחסן ב-20 ° C). 100 x פתרון מניות הוכן במים.
5. h 24 שעות ביממה פוסט לייזר בסיוע התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים, להגדיר זוגות בין עיקור עכברים זכר ונקבה להכין עכברים הנשי pseudopregnant.

2. בידוד של העכבר מופרית ביצים

1. 16-24 h פוסט ההזדווגות, בחרו עכברים נקבה עם מעידה על הזדווגות מוצלחת מהנרתיק פקקים, בצורה הומאנית המתת חסד²⁵. העכברים השתמשו במחקר זה היו מורדמים מאת נקע בצוואר הרחם תחת עמוק CO₂ או איזופלוריין באינהלציה.
2. לבודד את השחלות, oviducts על פי פרוטוקולים סטנדרטיים²⁵.
3. העבר את השחלות ואת oviducts תבשיל 35 מ מ המכיל M2 מדיה.
4. עבור כל השחלה, דמעה ampulla לגזרים לשחרר את הביצים מוקף תאים קומולוס.
5. להעביר את הביצים, תלולית לתאים 35 מ מ מאכל המכיל hyaluronidase x 1 בינוני M2 דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3-5 דקות.
6. Pipet מופרית ביצים למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים קומולוס.
7. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכיל pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף hyaluronidase ומדיה M2.
8. העברת הביצים תבשיל 35 מ מ המכילות KSOM ואת pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף את המדיה M2 הנותרים ואת hyaluronidase.
9. העברת הביצים הלוחות טיפה KSOM מוכן מהשלב 1.3.
   הערה: העכבר מופרית ביצים KSOM חייב להישמר בתוך חממה תרביות רקמה של 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ ו 90% N₂ כדי equilibrate. הסרת לוחות החממה יותר מ 15 דקות לגרום לנזק עוברי.
10. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה לפני המעבר לשלב הבא.

3. ניקוב של העכבר מופרית ביצים עם לייזר XYClone

1. התקנה, לכייל XYClone לייזר על-פי ההמלצה של היצרן. . הרבה לייזרים אחרים, משמש בדרך כלל עבור הפריה במבחנה , XYClone לייזר ניקבה את הביצים.
   1. לצרף את החוט תיבת לייזר בקר המנגנון לייזר על המיקרוסקופ.
   2. לצרף את תיבת בקר לייזר למחשב שבו פועל התוכנה לייזר דרך יציאת USB. 3.1.3. הכנס את בקר לייזר, הפעילו את זה.
   3. מחפש דרך העיינית של המצלמה, לנקב מדגם הבדיקה (למשל מחיקה יבש סימונים על משטח זכוכית).
   4. להשתמש הנהג בורג קטן (כלול בערכה לייזר) כדי להתאים את ה-X ואת Y המיקום של הלייזר כדי להתאים את ה-LED אור נראה דרך העיינית של המצלמה מיקרוסקופ לכייל את הלייזר.
2. מניחים צלחת טיפה KSOM המכילים ביצים העכבר מופרית על הבמה מיקרוסקופ. אל תשמור את הצלחת מחוץ החממה יותר מ 15 דקות.
3. להסתכל דרך העינית מיקרוסקופ ולהבטיח כי zona pellucida של העובר נמצא המוקד והיא הלייזר נורית LED הוא גלוי.
4. הזז את הבמה מיקרוסקופ כדי למקד את zona עם LED האור/הלייזר.
5. שימוש בתוכנת מחשב מוגדר XYClone לייזר 250 μs.
6. להתאים את גודל אור LED לממדים הרצויים (הגדרת 5 בניסוי זה).
7. לנקב את zona של הביצית המופרית כל שלוש פעמים עם הלייזר. Zona יכול להיות או פירסינג או מדולל. באמצעות ההגדרות לעיל, הלייזר יהיה לייצר חור בקוטר של 10 μm (איור 2).
   הערה: כיוון הגופה קוטב שומר לייזר מן התא העוברי.
8. לאפשר הביצים להתאושש במשך 2 h בחממה תרביות רקמה לפני המעבר לשלב הבא.

4. התמרה חושית של העכבר מופרית ביצים בעקבות ניקוב לייזר XYClone

1. Pipet 2 μL של lentivirus מרוכז (גדול מ 1e8 TU/mL כייל נוגדנים) לתוך הירידה KSOM 50 μL. לא pipet למעלה ולמטה. הביצים בקלות לצרף הטיפ pipet. על סמך הניסיון שלנו, 1e5-5e5 יחידות transducing של lentivirus של אמצעי אחסון פחות מ 3 μL הוא אופטימלי המסירה הגן.
2. לאפשר הביצים להתפתח הבלסטוציסט ארבעה ימים בחממה. אין צורך לשנות את התקשורת.

5. ניתוחי העברת העכבר Transduced עוברי עכברים מדומים בהריון

1. השתמש עכברים pseudopregnant, 3.5 יום לאחר ההזדווגות, מוכן בשלב 1.5.
2. להשתמש בהתקן להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כדי להשתיל עוברי העכבר לתוך עכברים pseudopregnant.
   1. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי או ויבתר, הכנס עם ספקולום וגינלי להמחיש את צוואר הרחם.
   2. הכנס את המכשיר להעביר עובר שאינו כירורגי (NSET) כ 5 מ מ העוברים צוואר הרחם ואת הפיקדון באמצעי אחסון כ- 2 μL.
      הערה: התקן NSET סטרילי המשמש עבור כל העברה, יימחקו לאחר ההליך. כל ריאגנטים בשימוש המניפולציה של העוברים חייב להיות סטרילי.
3. להעביר 10 – 15 בריא הבלסטוציסט μL 2, ףקיהב KSOM כל העכברים pseudopregnant.
4. להמשיך לעקוב ולמדוד את העלייה במשקל בעכברים pseudopregnant בימים הבאים כדי לקבוע NSET הצליחה.
5. לשחזר הגורים מאת ומאפשר העכברים בהריון ללדת באופן טבעי או ביצוע של ניתוח קיסרי 17 ימים אחרי העובר להעביר²⁶. ניתוח קיסרי נחוץ לעיתים קרובות אם העוברים מעט מאוד נוכחים, הם גדלים גדול מדי עבור לידה טבעית.
6. לאסוף רקמות הגורים עבור genotyping לקבוע שיעור transgenesis²⁷.

תוצאות

פיתוח של ביצים מבודד/transduced העכבר מופרית ניתן לבדוק תחת מיקרוסקופ מדי יום (איור 1). העוברים בריאים להתפתח הבלסטוציסט תוך 3-4 ימים. ב פרוטוקול זה, 60-70% ללא טיפול עוברי להתפתח הבלסטוציסט²³. מתוך 114 מחורר בלייזר transduced עוברי 54 התפתחה הבלסטוציסט (שיעור ש...

Discussion

היכולת של lentiviruses שילוב לתוך הגנום המארח שלהם גורם להם וקטור אידיאלי עבור המסירה הגן יציב. וקטורים lentiviral יכול לשאת kilobase עד 8.5 זוג (kbp) של חומר גנטי שיכול להכיל תאים ספציפיים או inducible היזמים, סמני הבחירה או moieties פלורסנט. החומר הגנומי incorporated יכולים לשכפל כחלק הגנום המארח שלהם, להיות מוסדרות כדי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295