マウスへのレーザ レンチ ウイルス遺伝子導入受精卵

要約

マウスの受精卵および初期胚は透明帯、遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。この資料では、ヘッジホッグ レンチウイルスベクターを持つ胚細胞、トランスジェニック マウスを作成するレーザーと帯を穿孔するためのプロトコルについて説明します。

要約

異哺乳動物細胞への遺伝子導入のための効率的なベクトルであります。次の伝達、レンチ ウイルスのゲノムは、安定ホスト染色体に組み込まれており、子孫に渡されます。したがって、彼らは安定したセルラインの作成、指標、生体内で配信、トランスジェニック動物を作成する単一細胞の受精卵の伝達の理想的なベクトルであります。しかし、マウス受精卵、早い段階の胚は透明帯、レンチ ウイルス遺伝子導入に対する障壁を形成する糖タンパク質マトリックスによって保護されています。レンチが大きすぎて帯を貫通する、通常囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースにウイルス粒子によって配信されます。熟練技術者や専門機器の要件がマウス胚への遺伝子導入のためのレンチの使用を最小限に抑えます。この資料では、レーザーで帯を穿孔によって構造のマウス受精卵のためのプロトコルについて説明します。レーザー穿孔胚に損害発生しませんができ異遺伝子デリバリーの萌芽期細胞へのアクセスを得るために。導入された胚は、胚盤胞、体外に開発し、偽妊娠マウスに注入した場合、トランスジェニック子犬に発展できます。このプロトコルで使用されるレーザーは、効果的で使いやすいです。安定のレンチによって配信される遺伝子マウス胚性細胞に組み込む、生殖著作。これはトランスジェニック マウスの作成を必要としないマイクロマニピュレーション、受精卵のための代替方法です。

概要

このメソッドは、レンチによる胚性細胞を遺伝子送達用アクセスできるように構造のマウス受精卵の透明帯の詳細な手順を提供します。レンチは、自然哺乳類細胞への効率的な遺伝子導入のために設計されています。彼らは分割と非分裂細胞に感染してそのホスト染色体¹にレンチ ウイルスのゲノムを統合します。レンチ ウイルスの宿主細胞の範囲は、容易に VSV G 蛋白質²の広範な親和性により水疱性口内炎ウイルス (VSV G)、糖タンパク質と遺伝子組換えレンチ ウイルス、pseudotyping によって拡大します。次の伝達、レンチ ウイルス遺伝子は統合、トランスジェニック動物を生成するための理想的なツールを作成する彼らのホストの染色体の一部として安定。初期段階の胚細胞に配信、レンチ ウイルスのゲノムを複製および全体の有機体で表されます。レンチ ウイルス伝達はマウス、ラット、鶏、ウズラの生産につながっているし、豚の^3,4,5,6,7遺伝子組み換えの他の種の間で。レンチ ウイルスの遺伝子配達の典型的な方法では、熟練した技術者や専門機器の初期段階の胚をカプセル化オスミウム障壁を克服するただし、必要があります。このメソッドの全体的な目標は、permeabilize ゾナ レンチ ウイルス遺伝子導入を容易にするためにレーザーを使用する方法について説明することです。

哺乳類の卵は、受精環境相互作用^8,9を制限して多精子侵入に対する受精卵を保護するために、次を固める透明帯によって囲まれています。帯は、胚が胚盤胞と孵化まで胚細胞からレンチを保つバリアを形成します。培養マウスは 4 日後、卵のハッチを受精卵し、孵化仔に正常な開発のための前に偽妊娠マウスに注入する必要があります。したがって、伝達、レンチは、囲卵腔、帯と胚の細胞間のスペースに、ソナから孵化する前に microinjected が。

透明帯はしばしば受精率¹⁰を増加する人間の卵子の体外受精のため削除されます。ただし、マウス透明帯の化学取り外しは悪影響マウス胚発生に影響を与えるし、胚細胞^11,12に有害であります。マウスの受精卵への遺伝子導入のための他の方法は、細胞核¹³に DNA の直接によって透明帯障壁を克服します。前核顕微注入は胚に遺伝子を提供する効率的な手段です。ただし、それぞれの胚は、マイクロインジェクションに対して個別に行われている、実践可能性があります骨の折れると初心者ユーザーのため時間がかかる。

エレクトロポレーションや photoporation などの他の方法は過渡の有用であり、短期の遺伝子導入マウス受精卵^14,,1516。これらのメソッドは、CRISPR Cas9 コンポーネントとリコンビナーゼを配信に使用される広範囲。しかし、遺伝子組み換えを作成する遺伝子のエレクトロポレーションと photoporation の配信を効率的に使用できません。パンクチャド マウス精巣上体から収集される精子はまた異によって導入、トランスジェニック動物^17,18,19、を生成する体外受精用²⁰。

このプロトコルではマウス胚にレンチ ウイルス遺伝子導入はイオン レーザーを用いたゾナによって促進されます。XYClone レーザーは体外受精²¹と²²胚性幹細胞の培養のための援助として開発されました。簡単なセットアップと使いやすい小型の装置です。顕微鏡にインストールされて、それは対物レンズの領域を占有し、付属のソフトにより、顕微鏡の接眼レンズをのぞきながらレーザーを目指して (プロトコルを見なさい: セクション 3)。帯は XYClone レーザによる穴あき、異できます遺伝子配信²³の文化メディアに導入します。複数のレンチは、染色体の混入のための複数の遺伝子を同時に提供するされる可能性があります。

このプロトコルを特定する方法を説明し、文化マウス受精卵、透明帯の穿孔のためのレーザーの使用を示しています、レンチによるマウス胚性細胞の情報伝達を示します。

プロトコル

すべての動物の手続きと治療このプロトコルで使われる NIH/NIEHS 動物のケアのガイドラインに遵守しているし、動物ケアと NIH/NIEHS プロトコル 2010年-0004 動物の使用委員会 (ACUC) によって承認されました。

1. 準備

1. 興味の遺伝子を運ぶ遺伝子組換えの停留のレンチを準備/購入。この研究では、レンチ SBI511 カイアシ類緑色蛍光蛋白を発現する (copGFP; GFP と略記) 伝達に使用された係数 1 a プロモーターから伸びを。²は作成に使用された標準プロトコルおよび 1e8 変換単位 (TU/mL) よりも高い抗体の力価レンチ。
   注: 注意を払い、レンチに接触されているすべての材料を漂白剤します。レンチの安全な使用と処理のための研究所のガイドラインを参照してください。
2. 胚を収穫前に一日必要なマウス系統の繁殖ペアをセットアップします。この実験では、マウス c57bl/6 j 菌株を使用しました。雌マウスの卵巣と卵管のコレクションに使用される排卵のためのホルモンと扱われなかった。
3. マウス受精卵を収穫する前 2-24 h は次のようにいくつかのカリウム単体最適化中²⁴ (KSOM) ドロップ プレートを準備: 2 ml の 35 mm 培養治療ディッシュとカバーの真ん中に KSOM 媒体の 50 μ L ドロップを追加ジメチルポリシロキサン (DMPS5X)、37 の^oC、5% CO₂5% O₂ 90% N₂で平衡に。
   注: は使い捨ての滅菌プレートを使用し、異に露出の後で破棄します。
4. 原液から M2 中のヒアルロニダーゼの 1 x ソリューションの準備 (100 x, 30 mg/mL、-20 ° C で保存)。100 x 貯蔵液は、水で調製しました。
5. 24 h 投稿レーザーア シスト伝達マウス受精卵、繁殖の偽妊娠雌マウスを準備する、精管の雌雄マウス間ペアを設定してください。

2. 分離マウスの受精卵

1. 16-24 h のポストは交尾、交尾の膣にプラグとメスのマウスを選択し、人道的安楽死²⁵。本研究で使用されるマウスは、深い CO₂またはイソフルレン吸入下頚部転位によって安楽死されました。
2. 卵巣と卵管の標準プロトコル²⁵によると分離します。
3. M2 メディアを含む 35 mm ディッシュに卵巣と卵管を転送します。
4. それぞれの卵巣の卵丘細胞に囲まれた受精卵を解放する離れて乳頭を引き裂きます。
5. 受精卵を転送して 3-5 分間室温でインキュベート 35 mm に卵丘細胞 M2 中 1 x ヒアルロニダーゼを含む料理します。
6. ピペットは受精卵丘細胞を解放するために、上下の卵です。
7. M2 メディアと上下にヒアルロニダーゼを洗浄するピペットを含む 35 mm ディッシュに受精卵を転送します。
8. KSOM ・ ピペット上・下で残りの M2 メディアとヒアルロニダーゼを洗浄を含む 35 mm ディッシュに受精卵を転送します。
9. 手順 1.3 から受精卵を準備 KSOM ドロップ プレートに転送します。
   注: KSOM のマウス受精卵は、37 ° C、5% CO₂5% O₂と平衡に 90% N₂で組織文化のインキュベーターで保たれなければなりません。15 分以上のためのインキュベーターからプレートを削除する被害のことを胚になります。
10. インキュベーターで 2 h の次のステップに移動する前に回復する受精卵を許可します。

3. 穿孔マウス受精卵 XYClone レーザー

1. セットアップし、製造元の推奨に従って XYClone レーザーを調整します。受精卵を穿孔する XYClone レーザー通常体外受精に使用される他のレーザーを置き換えることができます。
   1. 顕微鏡のレーザー装置にレーザー コント ローラー ボックスのワイヤを接続します。
   2. レーザー コント ローラー ボックスを USB ポート経由でレーザー ソフトウェアを実行しているコンピューターに接続します。3.1.3。 レーザー コント ローラーを接続し、それを切り替えます。
   3. 接眼レンズをのぞき、穿孔テスト サンプル (ガラス スライド上にドライ消去マーキングなど) です。
   4. (レーザー キットに含まれる) 小さなスクリュー ドライバーを使用して、X を調整して LED に合わせてレーザーの Y 位置顕微鏡の接眼レンズを通して見える光しレーザーを調整します。
2. 顕微鏡ステージ上のマウス受精卵を含む KSOM ドロップ プレートを配置します。15 分以上のためのインキュベーター外プレートを保持しません。
3. 顕微鏡の接眼レンズに目を通すと、胚の透明帯は、フォーカス、レーザー LED ライトが表示されます。
4. LED ライト/レーザーとソナを対象に顕微鏡のステージを移動します。
5. コンピュータ ソフトウェアを使用して 250 μ s に XYClone レーザーを設定しました。
6. (この実験で 5 を設定) 必要に応じて大きさを LED ライトのサイズを調整します。
7. レーザーで三度受精卵の透明帯に穴を開けます。帯かはピアスしたり薄くできます。上記の設定を使用して、レーザーは、10 μ m (図 2) の直径の穴が生成されます。
   注: 極体に近い目指して萌芽期細胞からレーザーを近づけない。
8. 受精卵培養インキュベーターで 2 h の次のステップに移動する前に回復するを許可します。

4. マウスの伝達受精卵の XYClone レーザー穿孔

1. ピペット 2 μ L の濃縮レンチ ウイルス (1e8 TU/mL 価以上) 50 μ L KSOM ドロップに。ないピペットを上下に行います。受精卵は、ピペット先端部に容易に接続します。我々 の経験に基づいて、1e5 5e5 レンチ ウイルス 3 μ L より小さいボリュームの変換単位は、遺伝子デリバリーに最適です。
2. 受精卵のインキュベーター内 4 日間の胚盤胞に成長するを許可します。メディアを変更する必要はありません。

5. 擬似妊娠マウスに導入されたマウス胚の非外科的転送

1. 1.5 準備した偽妊娠マウス、交尾後 3.5 日を使用します。
2. 非外科的胚転送 (小委員会) デバイスを使用して、マウス胚を偽妊娠マウスに注入します。
   1. 手術や解剖顕微鏡を使用すると、頸を視覚化する腟鏡を挿入します。
   2. 約 2 μ L のボリュームで子宮頸部と預金の胚に約 5 mm の非外科的胚転送 (小委員会) デバイスを挿入します。
      注: 滅菌小委員会デバイスは各転送に使用される、プロシージャの後破棄されます。胚の操作で使用されるすべての試薬は滅菌である必要があります。
3. 各偽妊娠マウスに KSOM の 2 μ L のボリュームで 10-15 健康な胚盤胞を転送します。
4. 引き続き注視し、小委員会が成功したかどうかを確認する次の日に偽妊娠マウスの体重を測定します。
5. 自然出産する妊娠マウスを許可または 17 日胚転送²⁶後帝王子犬を回復します。帝王切開は、非常にいくつかの胚が存在し、彼らは自然出産のため非常に大きくなる必要があります。
6. 遺伝子²⁷の率を決定する遺伝子型のための子犬から組織を収集します。

結果

分離導入マウス受精卵の開発は、(図 1) 毎日顕微鏡下で確認できます。健康な胚は 3-4 日以内の胚盤胞に発展します。このプロトコルでは、未処理の胚の 60-70% は胚盤胞²³に発展します。54 114 のレーザー穿孔導入された胚から胚盤胞 (率 47%) へと発展し、46 胚盤胞は、GFP を表明した (46/54 = 85%)²³。

ディスカッション

彼らのホストのゲノムに統合する、異能力は彼らに安定的に遺伝子配達のための理想的なベクトルをなります。レンチウイルスベクターは、セル固有または誘導性プロモーターや選択マーカー蛍光部分に対応することができます遺伝物質の最大 8.5 プラスミド ペア (kbp) を運ぶことができます。ゲノム剤、宿主ゲノムの一部としてレプリケートすることができます、表現目的の時点でアクティ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295