마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

요약

수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

초록

Lentiviruses는 포유류 세포에 유전자 배달에 대 한 효율적인 벡터. 변환, 다음 lentiviral 게놈은 안정적으로 호스트 염색체에 통합 하 고 자손 전달 됩니다. 따라서, 그들은 안정 된 세포의 생성, 지표, vivo에서 배달 및 유전자 변형 동물을 만드는 단일 셀 수정 된 달걀의 변환에 대 한 이상적인 벡터. 그러나, 마우스 수정 된 계란 및 초기 단계 배아 zona pellucida, lentiviral 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. Lentiviruses 너무 커서는 zona 침투 하 고 perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에 바이러스 성 입자의 microinjection에 의해 일반적으로 전달 됩니다. 고도로 숙련 된 기술자와 전문된 장비에 대 한 요구 사항을 마우스 배아에 유전자 배달 lentiviruses 사용 하 여를 최소화 했다. 이 문서는 레이저로는 zona 꿰뚫기에 의해 수정 된 마우스 달걀 permeabilizing 위한 프로토콜을 설명 합니다. 레이저 구멍 뚫 기 손해 태아를 초래 하지 않습니다 하 고 배아 세포에 유전자 배달에 대 한 액세스는 lentiviruses를 허용 한다. 불리고 배아 blastocyst 생체 외에서 로 발전 하 고 pseudopregnant 마우스에 이식 하는 경우 유전자 변형 새끼로 발전 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용 되는 레이저는 효과적이 고 사용 하기 쉬운. 유전자는 lentiviruses 안정적으로 전달 마우스 배아 세포로 통합 하 고 생식 전송 됩니다. 필요 없는 micromanipulation 유전자 변형 생쥐의 생성 및 수정 된 난 자의 microinjection에 대 한 대체 방법입니다.

서문

이 메서드는 lentiviruses에 의해 배아 세포 유전자 배달을 위한 액세스할 수 있도록 마우스 수정 된 달걀의 zona pellucida permeabilizing에 대 한 자세한 지침을 제공 합니다. Lentiviruses는 포유류 세포에 효율적인 유전자 전달에 대 한 자연에 의해 설계 되었습니다. 그들은 나누어 및 비 분열 세포를 감염 하 고 그들의 호스트 염색체¹에 lentiviral 게놈을 통합. Lentiviral 호스트 셀 범위는 쉽게 확장 pseudotyping VSV G 단백질²의 광범위 한 차 있는 굴곡 운동으로 인해 vesicular 구내 염 바이러스 당단백질 (VSV-G)와 재조합 lentivirus. 변환, 다음 lentiviral 유전자는 안정적으로 통합 하 고 그들의 호스트 염색체 유전자 변형 동물을 생성 하기 위한 이상적인 도구를 만들기의 일환으로 표현. 초기 단계 배아 세포에 전달 하는 경우 lentiviral 게놈 복제 이며 전체 유기 체에 표현. Lentiviral 변환 쥐, 쥐, 닭, 메 추 라 기의 생산을 주도하 고 있다 고^3,,45,,67 제 닉의 다른 종 중 돼지. 그러나 Lentiviral 유전자 전달의 일반적인 방법, 숙련 된 기술자 및 특수 장비 초기 단계 배아를 캡슐화 하는 zona pellucida 장벽을 극복 하기 위해 필요 합니다. 이 방법의 전반적인 목표 permeabilize lentiviral 유전자 납품을 촉진 하기 위하여 레이저를 사용 하 여 구역 하는 방법을 설명 하는 것입니다.

포유류 계란 zona pellucida는 polyspermy에 대 한 수정 된 알을 보호 하 고 환경 상호 작용^8,9제한 수정에 따라 견고 하 게 둘러싸여 있습니다. 구역까지 태아는 blastocyst로 부 화는 lentiviruses 배아 세포에서 유지 하는 방 벽을 형성 한다. 교양된 마우스 4 일 후 계란 해치를 수정 하 고 pseudopregnant 쥐 새끼로 정상적인 개발을 위한 부 화 이전에 이식 해야 합니다. 따라서, 변환, lentiviruses perivitelline 구멍, 배아 세포는 구역 사이의 공간에는 구역에서 부 화 하기 전에 microinjected는.

Zona pellucida 종종 수정 속도¹⁰증가 인간의 계란의 체 외에서 수정에 대 한 제거 됩니다. 그러나, 마우스 zona pellucida의 화학 제거 부정적인 마우스 배아 개발에 영향을 하 고는 배아 세포^11,12. 마우스 수정 된 달걀에 유전자 배달에 대 한 다른 방법 DNA의 세포 핵¹³에 직접 microinjection에 의해 zona pellucida 방 벽 극복. Pronuclear microinjection는 태아를 유전자를 전달 하는 효율적인 방법 이다. 그러나, 각 배아는 개별적으로 microinjection에 대 한 장소에서 개최 됩니다, 이후 연습 힘들고 초보자 사용자에 대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.

Electroporation 및 photoporation 등 다른 방법을 과도에 유용 하며 마우스를 단기 유전자 전달 수정 된 달걀^14,,1516. 이러한 방법은 광범위 하 게 recombinases CRISPR-Cas9 구성 요소를 제공 하는 데 사용 됩니다. 그러나, electroporation 그리고 photoporation 유전자의 배달 제 닉 생성을 효율적으로 사용할 수 없습니다. 구멍이 마우스 epididymis에서 수집 된 정 충 수 또한 lentiviruses에 의해 불리고 하 고 체 외에서 수정에 대 한 유전자 변형 동물^17,,1819, 를 생산 하는 데 사용 ²⁰.

이 프로토콜에서 마우스 배아를 lentiviral 유전자 배달 permeabilizing 레이저를 사용 하 여 구역에 의해 촉진 된다. XYClone 레이저는 체 외에서 수정²¹ 와²²배아 줄기 세포 경작에 대 한 지원으로 개발 되었다. 그것은 설치 프로그램을 간단 하 고 사용 하기 쉬운 작은 기구 이다. 현미경에 설치, 그것은 대물 렌즈의 공간을 차지 하 고 동반 소프트웨어는 현미경 접 안 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 레이저를 목표에 대 한 허용 ( 프로토콜참조: 3 절). zona XYClone 레이저 천공은, 일단 lentiviruses 유전자 배달²³문화 미디어에 소개 될 수 있습니다. 여러 lentiviruses 염색체 설립에 대 한 여러 유전자를 동시에 제공 하 사용 될 수 있습니다.

이 프로토콜을 분리 하는 방법을 설명 합니다 및 문화 마우스 수정 된 계란, zona pellucida의 천공에 대 한 레이저의 사용을 보여 줍니다 lentiviruses로 마우스 배아 세포의 변환 방법을 보여 줍니다.

프로토콜

모든 동물 절차와이 프로토콜에 사용 되는 치료 NIH/NIEHS 동물 보호 지침을 준수 했다 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC) NIH/NIEHS, 동물 프로토콜 2010-0004에 의해 승인 했다.

1입니다. 준비

1. 관심사의 유전자를 운반 하는 재조합 형 비 전파 lentiviruses 준비/구매 이 연구에서 lentivirus SBI511 copepod 녹색 형광 단백질을 표현 (copGFP; GFP에 약식)는 신장에서 요소 1a 발기인 변환을 위해 사용 되었다. ² 생산 하는 데 사용 했다 표준 프로토콜 그리고 titer lentiviruses titers 1e8 시험 단위 (TU/mL) 당 보다 높은에서.
   참고: 주의 사용 하 고 모든 자료는 lentiviruses 접촉 되어 표 백제. 안전 사용 및 lentiviruses의 취급에 대 한 연구소의 지침을 참조 하십시오.
2. 배아를 수확 하기 전에 하루 원하는 마우스 스트레인의 번 식 쌍 설치. 이 실험에서 쥐의 C57BL/6J 변형 사용 되었다. 여성 쥐 난소와 수 란 관 컬렉션 사용 superovulation에 대 한 어떤 호르몬으로 치료 하지 했다.
3. 마우스 수정 된 달걀, 수확 전에 2-24 h 다음과 같이 몇 가지 칼륨 단면 최적화 된 매체²⁴ (KSOM) 드롭 접시 준비: KSOM 매체의 50 μ 드롭의 2 mL와 함께 35 m m 조직 문화 취급 요리와 커버의 중간에 추가 Dimethylpolysiloxane (DMPS5X)과 equilibrate 37 ^oC, 5% CO₂, 5% O₂ 와 90% N₂ 에서 장소.
   주: 일회용 살 균 접시를 사용 하 고 lentiviruses에 노출 다음 삭제.
4. 재고 솔루션에서 M2 매체에 hyaluronidase의 1 x 솔루션을 준비 (100 x, 30 mg/mL,-20 ° C에 저장). 재고 솔루션 x 100는 물에서 준비 되었다.
5. 24 시간 레이저를 이용한 변환 마우스 수정 된 달걀, pseudopregnant 여성 마우스를 준비 vasectomized 남성 및 여성 쥐 사이 쌍 사육 설정의 게시.

2. 절연 마우스의 수정 된 계란

1. 16-24 h 게시물 짝짓기, 질 플러그 성공적인 짝짓기의 지표와 여성 쥐를 선택 하 고 고통 없이 안락사²⁵. 이 연구에 사용 된 쥐 깊은 CO₂ 또는 isoflurane 흡입에서 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.
2. 난소와 표준 프로토콜²⁵에 따르면 oviducts 격리.
3. 난소와 oviducts M2 미디어를 포함 하는 35 mm 접시에 전송.
4. 각 난소에 대 한 적 운 세포에 의해 포위 하는 수정 된 달걀을 풀어 ampulla 떨어져 눈물.
5. 수정 된 난 자 전송 및 적 운 세포는 35 mm 접시 1 x hyaluronidase M2 매체에서를 포함 하 고 3-5 분 동안 실 온에서 품 어.
6. 피펫으로 계란 적 운 세포를 아래로 수정 된.
7. 수정 된 난 자 M2 미디어 및 아래로 씻어 hyaluronidase을 피펫으로 35 mm 접시에 전송.
8. 수정 된 난 자 포함 된 KSOM 피펫으로 아래로 나머지 M2 미디어와 hyaluronidase 씻어 35 mm 접시에 전송 합니다.
9. 1.3 단계에서 수정 된 난 자 준비 KSOM 드롭 격판덮개 전송.
   참고: 마우스 수정 된 달걀 KSOM에 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ 와 equilibrate를 90% N₂ 에서 조직 문화 인큐베이터에서 유지 되어야 한다. 15 분 이상 인큐베이터에서 번호판을 제거 배아에 손상 될 것 이다.
10. 다음 단계로 이동 하기 전에 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.

3. 마우스의 천공 수정 XYClone 레이저와 계란

1. 설치 하 고 XYClone 레이저 제조 업체의 권장 사항에 따라 보정. 수정 된 난 자에 구멍을 XYClone 레이저에 대 한 일반적으로 체 외에서 수정, 사용, 다른 레이저를 교체하실 수 있습니다.
   1. 현미경에 레이저 장치를 레이저 컨트롤러 상자 와이어를 연결 합니다.
   2. USB 포트를 통해 레이저 소프트웨어를 실행 하는 컴퓨터를 레이저 컨트롤러 상자를 연결 합니다. 3.1.3. 레이저 컨트롤러에 연결 하 고 켭니다.
   3. 테스트 샘플 (예: 유리 슬라이드에 드라이 지우기 표시)을 꿰뚫기 접 안 렌즈를 통해 찾습니다.
   4. (레이저 키트에 포함 된) 작은 스크루 드라이버를 사용 하 여 X 조정 및 LED에 맞게 레이저의 Y 위치 현미경 접 안 렌즈를 통해 보이는 빛 레이저 교정.
2. 현미경 단계에 마우스 수정 된 달걀을 포함 KSOM 드롭 접시를 놓습니다. 15 분 이상 인큐베이터 외부 플레이트를 보관 하지 마십시오.
3. 현미경 접 안 렌즈를 통해 모양과 태아의 zona pellucida 초점 고 레이저 발광 표시 됩니다.
4. LED 빛/레이저 zona 대상 현미경 단계를 이동 합니다.
5. 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여 XYClone 레이저 250 µs 설정 합니다.
6. LED 빛 크기 (이 실험에서 설정 5) 원하는 크기를 조정 합니다.
7. 레이저로 몇 번이 고 각 수정 된 달걀의 zona 구멍. zona은 수 중 관통 하거나 thinned 수 있습니다. 위의 설정을 사용 하 여, 레이저는 직경 10 μ m (그림 2)의 구멍을 생산할 예정 이다.
   참고: 배아 세포에서 레이저를 유지 북극 몸 가까이 목표로 합니다.
8. 다음 단계로 이동 하기 전에 조직 문화 인큐베이터에 2 h에 대 한 복구를 수정 된 알 수 있습니다.

4. 마우스의 변환 수정 된 달걀 다음 XYClone 레이저 구멍 뚫 기

1. 피펫으로 2 50 μ KSOM 드롭에 집중된 lentivirus (1e8 TU/mL titer 이상)의 μ. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 하지 마십시오. 수정 된 난 자는 쉽게 피펫으로 끝에 연결합니다. 우리의 경험을 바탕으로, 1e5-5e5 시험 단위 lentivirus 3 μ 보다 작은 볼륨에 유전자 배달에 대 한 최적입니다.
2. 수정 된 계란 인큐베이터에서 4 일 동안 blastocyst으로 개발을 허용 합니다. 미디어를 변경할 필요가 없습니다.

5. 비-외과 전송 불리고 마우스 배아의 의사 임신 쥐

1. 1.5 단계에서 준비 pseudopregnant 마우스, 짝짓기 후 3.5 일에 사용 합니다.
2. 비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 사용 하 여 pseudopregnant 마우스에 마우스 배아를 이식.
   1. 수술 또는 해 현미경을 사용 하 여, 자 궁 경부를 시각화 하기 위해 질 speculum을 삽입 합니다.
   2. 약 2 μ의 볼륨에서 자 궁 경부 및 예금 배아로 약 5 m m 비 수술 배아 전송 (NSET) 장치를 삽입 합니다.
      참고: 살 균 NSET 장치는 각 전송에 대 한 사용 하 고 절차 후 삭제. 배아의 조작에 사용 되는 모든 시 약은 살 균 해야 합니다.
3. 각 pseudopregnant 마우스 10-15 건강 blastocyst KSOM의 2 μ 볼륨에서을 전송.
4. 계속 모니터링 하 고는 NSET 성공 했는지 확인 하려면 다음 일에 pseudopregnant 쥐에 있는 체중 증가 측정 합니다.
5. 자연스럽 게 출산 임신 쥐 또는 17 일 후 배아 전송²⁶제왕 섹션을 수행 하 여 새끼를 복구 합니다. 제왕 절 개는 경우 거의 배아 자연 출산에 대 한 너무 큰 성장 경우가 많습니다.
6. Transgenesis²⁷의 속도 결정 하는 유전형 새끼에서 티슈를 수집 합니다.

결과

절연/불리고 마우스 수정 된 달걀의 개발 매일 현미경 (그림 1)에서 확인할 수 있습니다. 건강 한 태아는 blastocyst으로 3-4 일 이내 발전. 이 프로토콜에서 치료 배아의 60-70%는 blastocyst²³으로 발전. 54 blastocyst (47%의 비율)으로 발전 하는 114 레이저 천공 불리고 배아에서 46 blastocysts 표현 GFP (46/54 = 85%)²³.

토론

그들의 호스트 게놈으로 통합 하는 lentiviruses의 능력은 그들이 안정적인 유전자 배달에 대 한 이상적인 벡터 합니다. Lentiviral 벡터 셀 또는 유도할 수 있는 발기인, 선택 표시, 또는 형광 moieties 수용할 수 있는 유전 물질의 최대 8.5 kilobase 쌍 (kbp)을 수행할 수 있습니다. 법인된 게놈 자료 그들의 호스트 게놈의 일환으로 복제할 수 고를 표현 하거나 원하는 시간 지점에서 비활성화할 통제 될. 이러한 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295