Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris

Résumé

Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.

Résumé

Lentivirus sont des vecteurs efficaces pour gène de cellules de mammifères. Suite de transduction, le génome des gènes est solidement intégré dans le chromosome de l’hôte et est transmis à la descendance. Ils sont donc un vecteur idéal pour la création de lignées cellulaires stables, en vivo livraison d’indicateurs et la transduction des oeufs seule cellule fertilisée pour créer des animaux transgéniques. Cependant, souris des oeufs fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène des gènes. Lentivirus sont trop grosses pour pénétrer la zona et sont généralement livrés par microinjection de particules virales dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires. L’exigence de techniciens hautement qualifiés et d’équipements spécialisés a réduit au minimum l’utilisation de lentivirus pour la livraison de gène à des embryons de souris. Cet article décrit un protocole pour perméabiliser les oeufs souris fécondée par perforer le zona avec un laser. Laser-perforation n’entraîne pas de dommages aux embryons et permet des lentivirus accéder aux cellules embryonnaires pour la livraison de gène. Transduite embryons peuvent devenir blastocyste in vitro et si implantés chez des souris pseudopregnant, évoluer vers des chiots transgéniques. Le laser utilisé dans le présent protocole est efficace et facile à utiliser. Gènes envoyés par lentivirus stablement incorporent sur les cellules embryonnaires de souris et sont transmissible germline. Il s’agit d’une méthode alternative pour la création de souris transgéniques qui ne nécessite aucun micromanipulation et microinjection des oeufs fécondés.

Introduction

Cette méthode fournit des instructions détaillées pour perméabiliser la zone pellucide des oeufs fécondée de souris pour fabriquer des cellules embryonnaires accessibles pour la livraison de gène de lentivirus. Lentivirus ont été conçues par nature pour la livraison efficace de gène aux cellules de mammifères. Ils infectent les cellules en division et non de division et intègrent le génome des gènes de leur hôte chromosomes¹. La plage de cellules de l’hôte des gènes est facilement développée par pseudotypage le lentivirus recombinant avec la glycoprotéine de virus de stomatite vésiculaire (VSV-G), en raison de la large tropisme de la VSV-G protein². Suite de transduction, les gènes des gènes sont stablement intégrés et exprimées dans le cadre de leurs chromosomes hôtes créant un outil idéal pour la production d’animaux transgéniques. S’il est livré à des cellules embryonnaires au stade précoce, le génome des gènes est reproduit et exprimé dans tout l’organisme. Transduction LENTIVIRAUX a conduit à la production de rat, souris, cailles, poulet et porc^3,4,5,6,7 , parmi d’autres espèces d’organismes transgéniques. La méthode typique de la livraison de gène des gènes, toutefois, exige des techniciens qualifiés et un équipement spécialisé pour surmonter la barrière de la zone pellucide qui encapsule les embryons au stade précoce. L’objectif général de cette méthode est de décrire comment permeabilize la zona en utilisant un laser pour faciliter la livraison de gène des gènes.

Des oeufs chez les mammifères sont entourées par la zone pellucide qui durcit après la fertilisation afin de protéger les œufs fécondés contre polyspermie et de limiter les interactions environnementales^8,9. Le zona forme une barrière qui empêche les lentivirus loin les cellules embryonnaires jusqu'à ce que les embryons sont éclos comme un blastocyste. Cultivés de souris fécondé les œufs éclosent après 4 jours et doivent être implantés chez des souris pseudopregnant avant l’éclosion pour un développement normal dans les petits. Par conséquent, pour la transduction, lentivirus sont micro avant l’éclosion de la zona dans la cavité périvitellin, l’espace entre le zona et les cellules embryonnaires.

La zone pellucide est souvent supprimée pour fécondation in vitro des ovocytes humains pour augmenter le taux de fécondation¹⁰. Cependant, élimination chimique de souris zone pellucide négativement affecte le développement embryonnaire chez la souris et est nocive pour les cellules embryonnaires^11,12. Autres méthodes pour la livraison de gène aux oeufs souris fécondée surmonter la barrière de la zone pellucide par microinjection directe de l’ADN dans le noyau de cellule¹³. Microinjection pronucléaire est un moyen efficace de transporter les gènes dans des embryons. Toutefois, étant donné que chaque embryon est maintenu en place individuellement pour la micro-injection, la pratique peut être laborieux et fastidieux pour un utilisateur novice.

Autres méthodes comme l’électroporation et photoporation sont utiles pour transitoire et à court terme livraison de gène aux souris fécondés oeufs^14,15,16. Ces méthodes sont largement utilisés pour livrer les recombinases et composants CRISPR-Cas9. Cependant, électroporation et photoporation livraison de gènes ne peut servir efficacement à créer des organismes transgéniques. Les spermatozoïdes qui proviennent de l’épididyme souris crevé aussi peuvent être transduites par lentivirus et utilisés pour la fécondation in vitro pour produire des animaux transgéniques^{17,18,19, 20}.

Dans ce protocole, la livraison de gène des gènes à des embryons de souris est facilitée par perméabiliser le zona à l’aide d’un laser. Le laser XYClone a été développé pour aider à l’in vitro fertilization²¹ et de la culture de cellules souches embryonnaires,²². C’est un petit appareil qui est simple à installer et facile à utiliser. Une fois installé sur un microscope, il occupe la place d’une lentille de l’objectif et le logiciel permet pour viser le laser tout en regardant dans les oculaires de microscope (voir protocole: l’article 3). Une fois que le zona est perforé par le laser XYClone, lentivirus peuvent être introduits dans les milieux de culture pour la livraison de gène²³. Lentivirus multiples pourraient servir à offrir simultanément plusieurs gènes chromosomiques incorporation.

Ce protocole décrit comment isoler et souris de la culture des oeufs fécondés, illustre l’utilisation de laser pour la perforation de la zone pellucide et illustre la transduction des cellules embryonnaires de souris de lentivirus.

Protocole

Toutes les procédures animales et les traitements utilisés dans le présent protocole ont été en conformité avec les directives de protection des animaux de NIH/NIEHS et ont été approuvées par la protection des animaux et utilisation Comité (ACUC) au NIH/NIEHS, Animal protocole 2010-0004.

1. les préparatifs

1. Préparer/achat recombinants non multiplication lentivirus portant votre gène d’intérêt. Dans cette étude, lentivirus SBI511 exprimant la protéine fluorescente verte copépode (copGFP ; en abrégé GFP) d’un allongement promoteur de facteur 1 a a été utilisé pour la transduction. ² ont été utilisés pour produire des protocoles standard et lentivirus titre aux concentrations supérieures 1e8 transduction unités / mL (TU/mL).
   Remarque : Soyez prudent et eau de Javel tous les documents qui ont été en contact avec des lentivirus. Voir les lignes directrices de l’Institut pour l’utilisation en toute sécurité et de la manipulation des lentivirus.
2. Installation de couples reproducteurs de souche de souris désiré le jour avant la récolte d’embryons. Dans cette expérience, souche C57BL/6J de souris a été utilisée. Des souris femelles utilisées pour ovaires et oviducte n’étaient pas traités avec des hormones de superovulation.
3. 2 – 24 h avant la récolte des oeufs fécondée de souris, préparer plusieurs plaques de goutte Potassium Simplex optimisé Medium²⁴ (HLGHW) comme suit : ajoutez une goutte de 50 μL de moyen de HLGHW au milieu d’un plat de 35 mm-traitée pour la culture de tissus et couvrir avec 2 mL de Diméthylpolysiloxane (DMPS5X) et place à 37 ^oC, 5 % de CO₂, 5 % O₂ et 90 % N₂ s’équilibrer.
   Remarque : Utilisez les plaques stériles jetables et jeter après une exposition à lentivirus.
4. Préparer 1 x solution de hyaluronidase au M2 moyen de la solution mère (100 x, 30 mg/mL, conserver à-20 ° C). 100 x solution-mère était établie dans l’eau.
5. 24h après transduction assistée par laser des oeufs de souris fécondée, mis en place nicheurs entre vasectomie souris mâles et femelles pour préparer des souris femelles pseudo-gravides.

2. isolement des souris des oeufs fécondés

1. 16 – 24 h après l’accouplement, sélectionnez souris femelles avec fiches vaginales indicatives du succès reproducteur et humainement euthanasier²⁵. Les souris utilisées dans cette étude ont été euthanasiés par dislocation cervicale sous inhalation profonde de CO₂ ou l’isoflurane.
2. Isoler les ovaires et les oviductes selon des protocoles standard²⁵.
3. Transférer les ovaires et les oviductes dans un plat de 35 mm contenant les médias M2.
4. Pour chaque ovaire, déchirer ampulla part pour libérer des oeufs fécondés, entourées de cellules du cumulus.
5. Transfert des oeufs fécondés et les cellules du cumulus à un 35 mm plat contenant 1 hyaluronidase x dans un milieu M2 et incuber à température ambiante pendant 3 à 5 min.
6. Les ovocytes fécondés pipette de haut en bas pour libérer les cellules du cumulus.
7. Transférer des oeufs fécondés dans un plat de 35 mm contenant M2 médias et pipette up et down pour laver la hyaluronidase.
8. Transférer des oeufs fécondés dans un plat de 35 mm, contenant HLGHW et pipette up et down à laver restant M2 médias et hyaluronidase.
9. Transfert des oeufs fécondés des plaques de goutte HLGHW préparés de l’étape 1.3.
   Remarque : Des oeufs de souris fécondée en HLGHW doivent être conservés dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5 % de CO₂, 5 % O₂ et 90 % N₂ s’équilibrer. Enlever les plaques de l’incubateur pendant plus de 15 min se traduira par des dommages aux embryons.
10. Permettre des oeufs fécondés de récupérer pendant 2 h dans l’incubateur avant de passer à l’étape suivante.

3. perforation de souris fécondés avec Laser XYClone

1. Configurer et calibrer XYClone laser conformément à la recommandation du manufacturier. D’autres lasers, généralement utilisés pour la fécondation in vitro , peuvent être substituées à XYClone laser perforer des oeufs fécondés.
   1. Attachez le fil de boîte de contrôleur laser à l’appareil laser sur le microscope.
   2. Fixer le boîtier de laser à l’ordinateur exécutant le logiciel laser via un port USB. 3.1.3. Branchez le contrôleur de laser et allumez-le.
   3. Regardant dans l’oculaire, perforer un échantillon test (p. ex. les marques effaçables à sec sur une lame de verre).
   4. Utilisez un petit tournevis (inclus dans le kit laser) pour ajuster le X et position Y du laser pour correspondre à la LED lumière visible à travers l’oculaire du microscope et calibrer le laser.
2. Posez une plaque de goutte de HLGHW contenant des oeufs fécondée de la souris sur la platine du microscope. Ne gardez pas la plaque à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 min.
3. Regardez dans l’oculaire du microscope et veiller à ce que les pellucide de l’embryon est au point et le laser LED lumière est visible.
4. Déplacer la platine du microscope pour cibler le zona avec la lumière LED/laser.
5. En utilisant le logiciel de l’ordinateur la valeur XYClone laser 250 μs.
6. Ajuster la taille de lumière LED aux dimensions désirées (réglage 5 dans cette expérience).
7. Perforer la zona de chaque œuf fécondé trois fois avec le laser. Le zona peut être percé ou aminci. Utilisez les paramètres ci-dessus, le laser va produire un trou d’un diamètre de 10 μm (Figure 2).
   NOTE : Visant près du corps polaire garde laser de la cellule embryonnaire.
8. Permettre des oeufs fécondés de récupérer pendant 2 h dans l’incubateur de culture de tissus avant de passer à l’étape suivante.

4. transduction de souris fécondés après Perforation Laser XYClone

1. Pipeter 2 μL de lentivirus concentrés (plus de titre TU/mL 1e8) dans la chute de HLGHW 50 μL. Ne pas pipeter de haut en bas. Oeufs fécondés fixer facilement à la pointe de la pipette. Basé sur notre expérience, unités de transduction 1e5-5e5 de lentivirus dans un volume inférieur à 3 μl est optimale pour la livraison de gène.
2. Laissez les oeufs fécondés se transformer en blastocyste pendant 4 jours dans l’incubateur. Pas besoin de changer les médias.

5. non-chirurgicale transfert d’embryons de souris transduite à des souris enceintes Pseudo-aléatoire

1. Utilisez la souris pseudopregnant, 3,5 jours après l’accouplement, préparé à l’étape 1.5.
2. Utiliser le dispositif de transfert d’embryon Non-Surgical (NSET) d’implanter des embryons de souris à des souris pseudopregnant.
   1. À l’aide d’un microscope chirurgical ou dissection, insérer un spéculum vaginal pour visualiser le col de l’utérus.
   2. Insérez le périphérique de transfert d’embryon Non-Surgical (NSET) environ 5 mm dans les col de l’utérus et dépôt des embryons dans un volume d’environ 2 μL.
      Remarque : Un dispositif NSET stérile est utilisé pour chaque transfert et jeté après la procédure. Tous les réactifs utilisés dans la manipulation des embryons doivent être stériles.
3. Transfert de blastocyste sain de 10 – 15 2 volume μL de HLGHW pour chaque souris pseudopregnant.
4. Continuer de suivre et de mesurer le gain de poids chez des souris pseudopregnant dans les jours suivants pour déterminer si le NSET a réussi.
5. Récupérer des chiots en permettant les souris enceintes à accoucher naturellement ou d’effectuer une césarienne 17 jours après le transfert de l’embryon²⁶. Une césarienne est souvent nécessaire si les embryons très peu sont présents et ils deviennent trop gros pour accouchement naturel.
6. Recueillir des tissus de petits pour le génotypage déterminer le taux de transgénèse²⁷.

Résultats

Développement des oeufs de souris isolé/transduites fécondée peut être vérifiée au microscope par jour (Figure 1). Santé des embryons se développent en blastocyste en 3 à 4 jours. Dans ce protocole, 60 à 70 % des embryons non traités développent en blastocyste²³. Hors 114 perforé laser transduits embryons, 54 devenue blastocyste (taux de 47 %) et 46 blastocystes exprimé GFP (46/54 = 85 %)²³.

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Discussion

La capacité des lentivirus à intégrer dans leur génome de l’hôte rend un vecteur idéal pour la livraison de gène stable. Vecteurs LENTIVIRAUX peuvent transporter jusqu'à 8,5 kilobases paire (kbp) du matériel génétique pouvant accueillir les promoteurs spécifiques des cellules ou inductibles, marqueurs de sélection ou moitiés fluorescents. Constituée de matériel génomique peut répliquer dans le cadre de leur génome de l’hôte et réglementé pour exprimer ou désactiver aux moments souhaités. Ces v...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295