Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

Zusammenfassung

Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.

Zusammenfassung

Lentiviren sind effiziente Vektoren für gen-Lieferung für Säugerzellen. Nach Transduktion Lentivirale Genom ist stabil in das Host-Chromosom integriert und werden an die Nachkommen weitergegeben. Daher sind sie ideale Vektoren für die Schaffung von stabilen Zelllinien, in Vivo Lieferung von Indikatoren und Transduktion Einzelzelle befruchtete Eier transgene Tiere zu erstellen. Aber Maus befruchtete Eier und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen Lentivirale gen Lieferung bildet. Lentiviren sind zu groß, um die Zona durchdringen und werden in der Regel durch Mikroinjektion von viralen Partikel in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen geliefert. Der Bedarf an hochqualifizierten Technologen und spezialisierte Ausrüstung hat die Verwendung von Lentiviren für gen-Lieferung an Mäuseembryonen minimiert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Maus, die befruchteten Eier durch Perforation der Zona mit einem Laser permeabilizing. Laser-Perforation führt nicht Schäden an Embryonen und Lentiviren Zugriff auf embryonale Zellen für gen Lieferung ermöglicht. Ausgestrahlt Embryonen können entwickeln sich zu Blastozysten in-vitro- und wenn bei pseudopregnant Mäusen implantiert in transgenen Welpen entwickeln. Die in diesem Protokoll verwendeten Laser ist effektiv und einfach zu bedienen. Gene stabil von Lentiviren geliefert in embryonalen Mauszellen integrieren und Keimbahn übertragbare sind. Dies ist eine alternative Methode zur Erstellung von transgenen Mäusen, die keine Mikromanipulation erfordert und Mikroinjektion von befruchteten Eiern.

Einleitung

Diese Methode bietet detaillierte Anweisungen für die Zona Pellucida der Maus befruchtete Eier permeabilizing embryonale Zellen von Lentiviren gen Lieferung zugänglich zu machen. Lentiviren sind naturgemäß für effiziente gen Lieferung für Säugerzellen ausgelegt. Sie trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und ihre Gastgeber Chromosomen¹das Lentivirale Genom integrieren. Das Lentivirale Wirtszellen ist leicht durch Pseudotyping der rekombinanten Lentivirus mit vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G), aufgrund der breiten Tropismus des VSV-G Protein²erweitert. Nach Transduktion Lentivirale Gene stabil integriert und als Teil ihrer Host-Chromosomen schaffen ein ideales Werkzeug zur Erzeugung transgener Tiere ausgedrückt. Frühen Stadium embryonalen Zellen geliefert, das Lentivirale Genom repliziert und ausgedrückt in den gesamten Organismus. Lentivirale Transduktion hat dazu geführt, die Produktion von Mäusen, Ratten, Huhn, Wachtel und Schwein^3,4,5,6,7 unter anderen Arten von gentechnisch veränderten Pflanzen. Die typische Art der Lentivirale gen Lieferung, erfordert jedoch qualifizierte Techniker und Spezialgeräte, die Zona Pellucida-Barriere zu überwinden, die die frühen Embryonen kapselt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Zona mit Hilfe eines Lasers auf um Lentivirale gen Lieferung zu erleichtern permeabilize beschreiben.

Säugetier Eier sind von der Zona Pellucida umgeben, nach Befruchtung härtet, die befruchteten Eier gegen Polyspermy zu schützen und Umweltwechselwirkungen^8,9zu beschränken. Die Zona bildet eine Barriere, die Lentiviren Weg von den embryonalen Zellen hält, bis die Embryonen als Blastozyste ausgebrütet werden. Kultivierte Maus befruchteten Eiern schlüpfen nach 4 Tagen und muss in pseudopregnant Mäuse vor der Schraffur für eine normale Entwicklung in Welpen implantiert werden. Daher sind für die Transduktion, Lentiviren vor dem schlüpfen aus der Zona in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen mikroinjiziert.

Die Zona Pellucida wird oft für in-vitro- Befruchtung der menschlichen Eizellen, die Befruchtung Rate¹⁰erhöhen entfernt. Jedoch chemische Entfernung der Maus Zona Pellucida nachteilig wirkt sich auf die Entwicklung des Embryos und ist schädlich für die embryonalen Zellen^11,12. Andere Methoden für die gen-Lieferung an Maus befruchtete Eier überwunden die Zona Pellucida Barriere durch direkte Mikroinjektion von DNA in die Zelle Kern¹³. Man Mikroinjektion ist ein effizientes Mittel zur Bereitstellung von Genen für Embryonen. Da jedes Embryo im Ort individuell für die Mikroinjektion stattfindet, kann die Praxis mühsam und zeitaufwendig für einen Neuling jedoch.

Andere Methoden wie Electroporation und Photoporation eignen sich für transiente und kurzfristige gen Lieferung an Maus befruchtete Eier^14,15,16. Mit diesen Methoden sind ausführlich für die Bereitstellung von CRISPR-Cas9 Komponenten und Rekombinasen. Electroporation und Photoporation Bereitstellung von Gene jedoch kann nicht effizient zum gentechnisch veränderten Pflanzen zu schaffen. Spermien, die aus punktierten Maus Nebenhoden gesammelt werden können auch von Lentiviren ausgestrahlt und für in-vitro- Befruchtung verwendet, um transgene Tiere^17,18,19, zu produzieren ²⁰.

In diesem Protokoll wird die Lentivirale gen Lieferung an Mäuseembryonen durch permeabilizing der Zona mit Hilfe eines Lasers erleichtert. Die XYClone Laser wurde als Hilfsmittel für in-vitro- Befruchtung²¹ und Anbau von embryonalen Stammzellen²²entwickelt. Es ist ein kleiner Apparat, der einfach zu installieren und einfach zu bedienen ist. Einmal installiert am Mikroskop, es den Raum von einem Objektiv nimmt und die mitgelieferte Software ermöglicht mit dem Ziel des Lasers beim Blick durch das Mikroskop Okulare (siehe Protokoll: Abschnitt 3). Sobald die Zona vom XYClone Laser perforiert ist, können die Nährmedien für gen Lieferung²³Lentiviren eingeführt. Mehreren Lentiviren könnte verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Gene für chromosomale Integration liefern.

Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie zu isolieren und Kultur Maus Eier befruchtet, veranschaulicht die Verwendung der Laser für die Perforation der Zona Pellucida und zeigt die Signalweiterleitung Maus embryonalen Zellen von Lentiviren.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren und Behandlungen, die in diesem Protokoll verwendeten wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der NIH/NIEHS Tierbetreuung und vom Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (ACUC) am NIH/NIEHS, Tier-Protokoll 2010-0004 genehmigt wurden.

1. Vorbereitungen

1. Vorbereitung/Kauf rekombinante nicht propagieren Lentiviren tragen Ihre gen von Interesse. In dieser Studie, Lentivirus SBI511 mit dem Ausdruck schalenlose grün fluoreszierendes Protein (CopGFP; abgekürzt GLP) aus eine Dehnung Faktor-1a-Promoter für Transduktion verwendet wurde. Standard-Protokolle² wurden verwendet, um zu produzieren und Titer Lentiviren bei Titer höher als 1e8 3D-Steuerung Einheiten pro mL (TU/mL).
   Hinweis: Seien Sie vorsichtig und sämtliches Material, das in Kontakt mit Lentiviren wurden zu bleichen. Finden Sie in Ihrem Institut Richtlinien für sichere Anwendung und Handhabung von Lentiviren.
2. Setup Brutpaare der gewünschten Maus Belastung am Tag vor der Ernte Embryonen. In diesem Experiment wurde C57BL/6J Stamm von Mäusen verwendet. Weibliche Mäuse für Eierstöcke und Eileiter Sammlung verwendet wurden nicht mit Hormonen für Superovulation behandelt.
3. 2 bis 24 h vor der Ernte Maus befruchtete Eier, mehrere Kalium Simplex optimiert Medium²⁴ (KSOM) Drop Platten wie folgt vorbereiten: einen Tropfen 50 μL KSOM Medium in die Mitte eines 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale und Deckel mit 2 mL Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) und bei 37 ^oC, 5 % CO₂, 5 % O₂ und 90 % N₂ equilibrate.
   Hinweis: Sterile Einweggeschirr und verwerfen nach Exposition gegenüber Lentiviren.
4. 1 X Lösung von Hyaluronidase in M2 Medium aus Stammlösung vorbereiten (100 X, 30 mg/mL, Lagerung bei-20 ° C). 100 x Stammlösung wurde im Wasser vorbereitet.
5. 24 h post lasergestützte Transduktion von Maus befruchtete Eier, Brutpaare zwischen vasektomierten männlichen und weiblichen Mäusen pseudopregnant weibliche Mäusen Vorbereitung eingerichtet.

2. Isolierung der Maus befruchtete Eier

1. 16 – 24 h Post Paarung, wählen Sie weibliche Mäuse mit vaginalen Stecker bezeichnend für erfolgreiche Paarung und Human einzuschläfern²⁵. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden durch zervikale Dislokation unter tiefen CO₂ oder Isofluran Inhalation eingeschläfert.
2. Eierstöcke und Eileiter nach Standardprotokollen²⁵zu isolieren.
3. Übertragen Sie die Eierstöcke und Eileiter auf eine 35 mm-Schale mit M2-Medien.
4. Reißen Sie für jeder Eierstock Ampulla auseinander um befruchtete Eier von Kumuluszellen umgeben zu lösen.
5. Befruchtete Eier zu übertragen und Kumuluszellen bis 35 mm Schale mit 1 X Hyaluronidase in M2 Medium und bei 3 – 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
6. Pipettieren befruchtete Eier nach oben und unten, die Kumuluszellen freizugeben.
7. Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit M2 Medien und Pipettieren rauf und runter, Hyaluronidase abwaschen.
8. Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit KSOM und Pipettieren rauf und runter, die restlichen M2 Medien und Hyaluronidase abwaschen.
9. Übertragen Sie befruchtete Eier von Schritt 1.3 auf die vorbereiteten KSOM Drop Platten.
   Hinweis: Maus, die befruchteten Eier in KSOM müssen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO₂, 5 % O₂ und 90 % N₂ bis equilibrate gehalten werden. Entfernen von Platten aus dem Inkubator für länger als 15 min führt zu Schäden an Embryonen.
10. Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in den Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.

(3) Perforation der Maus befruchtete Eier mit XYClone Laser

1. Setup und Kalibrierung XYClone Laser nach Empfehlung des Herstellers. Andere Laser, normalerweise verwendet für in-vitro- Befruchtung, können für XYClone Laser zu perforieren befruchtete Eier ersetzt werden.
   1. Befestigen Sie den Laser Controller Box Draht Lasergerät am Mikroskop.
   2. Legen Sie die Laser-Controller-Box auf den Computer mit der Lasersoftware über einen USB-Anschluss. 3.1.3 der Laser-Controller anschließen und einschalten.
   3. Blick durch das Okular, Perforieren Sie eine Probe (z.B. trocken abwischbaren Markierungen auf einem Objektträger).
   4. Verwenden eines kleinen Schraubendrehers (enthalten in der Laser-Kit) Anpassung der X und Y-Position des Lasers entsprechen die LED Licht sichtbar durch das Mikroskop Okular und kalibrieren den Laser.
2. Legen Sie eine KSOM Drop-Platte mit Maus befruchteten Eier auf den Mikroskoptisch. Halten Sie nicht die Platte außerhalb der Inkubator für länger als 15 Minuten.
3. Blick durch das Mikroskop Okular und sicherstellen, dass der Embryo Zona Pellucida im Mittelpunkt steht und der Laser LED-Licht sichtbar ist.
4. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, Zona mit dem LED-Licht/Laser Ziel.
5. Legen Sie mithilfe der Computersoftware XYClone Laser auf 250 μs.
6. Passen Sie die LED Licht Größe zum gewünschten Abmessungen (Einstellung 5 in diesem Experiment).
7. Perforieren der Zona jeder befruchteten Eizelle dreimal mit dem Laser. Die Zona werden durchbohrt oder verdünnt. Mithilfe der oben genannten Einstellungen erzeugt der Laser ein Loch mit einem Durchmesser von 10 μm (Abbildung 2).
   Hinweis: Mit dem Ziel, in der Nähe der Polkörper Laser hält, Weg von der embryonalen Zelle.
8. Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in der Gewebekultur Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.

(4) Transduktion Maus befruchtete Eier nach XYClone Laserperforation

1. Pipettieren 2 μL der konzentrierten Lentivirus (größer als 1e8 TU/mL Titer) in den 50 μL KSOM Tropfen. Tun Sie nicht Pipettieren rauf und runter. Befruchtete Eier legen leicht bis zur Spitze pipettieren. Basierend auf unserer Erfahrung, 1e5 5e5 3D-Steuerung Einheiten des Lentivirus in einem Volumen von weniger als 3 μL ist optimal für gen-Lieferung.
2. Lassen Sie befruchtete Eier für 4 Tage im Inkubator zu Blastozysten entwickeln. Keine Notwendigkeit, die Medien zu ändern.

5. nicht-chirurgische Übertragung von ausgestrahlt Mausembryonen Pseudo-schwangeren Mäusen

1. Verwenden Sie pseudopregnant Mäuse, 3,5 Tage nach der Paarung im Schritt 1.5 vorbereitet.
2. Verwenden Sie Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Gerät, in pseudopregnant Mäuse Maus-Embryonen einzupflanzen.
   1. Mit einem chirurgischen oder Mikroskop, sezieren einfügen ein vaginal Spekulum, den Gebärmutterhals zu visualisieren.
   2. Das nicht-chirurgische Embryo Transfer (NSET) Gerät ca. 5 mm in die Zervix und Kaution Embryonen in einem Volumen von ca. 2 μL einsetzen.
      Hinweis: Ist eine sterile NSET Gerät für jede Übertragung verwendet und nach dem Eingriff verworfen. Alle Reagenzien in der Manipulation der Embryonen müssen steril sein.
3. Übertragen Sie 10 – 15 gesunde Blastozyste 2 μL Volumen der KSOM auf jeder pseudopregnant Mäuse.
4. Weiter zur Überwachung und Messung der Gewichtszunahme bei pseudopregnant Mäusen an folgenden Tagen um festzustellen, ob die NSET erfolgreich war.
5. Indem die schwangere Mäuse gebären natürlich oder Durchführung einen Kaiserschnitt 17 Tage nach dem Embryotransfer²⁶Welpen zu erholen. Ein Kaiserschnitt ist oft notwendig, wenn sehr wenige Embryonen vorhanden sind und sie zu groß für die natürliche Geburt wachsen.
6. Sammeln Sie Gewebe von Welpen für die Genotypisierung zur Bestimmung des Transgenese²⁷.

Ergebnisse

Entwicklung von isoliert/ausgestrahlt Maus befruchteten Eiern kann unter dem Mikroskop täglich (Abbildung 1) überprüft werden. Gesunde Embryonen entwickeln sich zu Blastozysten innerhalb von 3 – 4 Tagen. In diesem Protokoll entwickeln 60 – 70 % der unbehandelten Embryonen sich zu Blastozysten²³. Aus 114 Laser perforiert ausgestrahlt Embryonen, 54 entwickelte sich zu Blastozysten (Höhe von 47 %) und 46 Blastozysten ausgedrückt ...

Diskussion

Die Fähigkeit der Lentiviren, in deren Wirtsgenom integrieren macht sie einen idealen Vektor für stabile gen Lieferung. Lentivirale Vektoren können bis zu 8,5 Kilobase paar (Kbp) des genetischen Materials führen, die zellspezifische oder induzierbaren Promotern, Selektionsmarker oder fluoreszierende Moieties aufnehmen können. Eingearbeitete genomische Material kann als Bestandteil ihrer Wirtsgenom replizieren und zu äußern oder zu gewünschten Zeitpunkten deaktivieren geregelt werden. Diese Vektoren ermöglichen r...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295