Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova

Riepilogo

Mouse di uova fecondate ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene. Questo articolo descrive un protocollo per la zona di perforazione con un laser per trasdurre cellule embrionali con vettori lentivirali e creare topi transgenici.

Abstract

Lentivirus sono efficienti vettori per la consegna del gene in cellule di mammifero. A seguito di trasduzione, il genoma lentivirale stabile è incorporato nel cromosoma ospite ed è passato sopra alla progenie. Pertanto, essi sono vettori ideale per la creazione di linee cellulari stabilizzate, in vivo consegna degli indicatori e trasduzione di uova di singola cellula fecondata per creare animali transgenici. Tuttavia, mouse fecondato uova ed embrioni in fase precoce sono protetti dalla zona pellucida, una matrice di glicoproteina che forma una barriera contro la consegna del gene lentivirali. Lentivirus sono troppo grandi per penetrare la zona e sono in genere consegnati dal microinjection di particelle virali in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali. Il requisito per i tecnologi altamente qualificati e attrezzature specializzate è ridotto al minimo l'uso di lentivirus per consegna del gene di embrioni di topo. Questo articolo descrive un protocollo per permeabilizing le uova fecondata del mouse di perforare la zona con un laser. Perforazione laser non comporta alcun danno agli embrioni e permette lentivirus ottenere l'accesso alle cellule embrionali per consegna del gene. Trasdotte embrioni possono svilupparsi in blastocisti in vitro e se impiantati nei topi pseudopregnant, svilupparsi in cuccioli transgenici. Il laser utilizzato in questo protocollo è efficace e facile da usare. Geni consegnati da lentivirus stabile incorporano nelle cellule embrionali di topo e sono germinale trasmissibile. Si tratta di un metodo alternativo per la creazione di topi transgenici che non richiede nessun micromanipolazione e microiniezione di uova fecondate.

Introduzione

Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per permeabilizing la zona pellucida di uova fecondata mouse per rendere le cellule embrionali accessibile per la consegna del gene di lentivirus. Lentivirus sono progettati dalla natura per la consegna efficiente del gene in cellule di mammifero. Essi infettano le cellule di divisione e divisione e integrare il genoma lentivirale nella loro ospite cromosomi¹. La gamma delle cellule dell'ospite lentivirali prontamente viene espanso dal pseudotipizzazione il lentivirus ricombinanti con la glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSV-G), dovuto il vasto trofismo della proteina VSV-G². A seguito di trasduzione, geni lentivirali sono stabilmente integrati ed espresso come parte del loro cromosomi ospite creando uno strumento ideale per la generazione di animali transgenici. Se consegnato alle prime cellule embrionali di fase, il genoma lentivirale è replicato ed espresso nell'intero organismo. Trasduzione lentivirale ha portato alla produzione di ratto, topi, quaglie, pollo e maiale^3,4,5,6,7 , tra le altre specie di transgenica. Il tipico metodo di consegna del gene lentivirali, tuttavia, richiede attrezzature specializzate e tecnici specializzati di superare la barriera di zona pellucida che incapsula gli embrioni in fase precoce. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere come permeabilize la zona usando un laser per facilitare la consegna del gene lentivirali.

Le uova dei mammiferi sono circondate dalla zona pellucida che indurisce dopo fertilizzazione per proteggere le uova fecondate contro gamete e per limitare le interazioni ambientali^8,9. La zona costituisce una barriera che allontana le cellule embrionali lentivirus fino a quando gli embrioni sono nati come una blastocisti. Coltivati del topo fecondate le uova si schiudono dopo 4 giorni e devono essere impiantati in topi pseudopregnant prima schiusa per lo sviluppo normale in cuccioli. Pertanto, per la trasduzione, lentivirus vengono microiniettati prima della schiusa dalla zona in cavità perivitellino, lo spazio tra la zona e le cellule embrionali.

La zona pellucida viene spesso rimosso per fecondazione in vitro di ovuli umani per aumentare il tasso di fertilizzazione¹⁰. Tuttavia, rimozione chimica di mouse zona pellucida negativamente colpisce lo sviluppo dell'embrione di topo ed è nociva per le cellule embrionali^11,12. Altri metodi per la consegna del gene di uova fecondata mouse superare la barriera di zona pellucida di microiniezione diretta del DNA nella cellula nucleo¹³. Microiniezione pronuclei è un mezzo efficace di fornire geni agli embrioni. Tuttavia, poiché ogni embrione è tenuto in posizione singolarmente per la microiniezione, la pratica può essere laborioso e che richiede tempo per un utente inesperto.

Altri metodi quali l'elettroporazione e photoporation sono utili per transitori e a breve termine consegna del gene di topo fecondato uova^14,15,16. Questi metodi sono ampiamente utilizzati per la consegna di ricombinasi e componenti CRISPR-Cas9. Tuttavia, elettroporazione e photoporation consegna dei geni non utilizzabile in modo efficiente per creare transgenica. Gli spermatozoi che vengono raccolti da epididimo forato del mouse possono anche essere microlavorati lentivirus e utilizzati per la fecondazione in vitro per la produzione di animali transgenici^{17,18,19, 20}.

In questo protocollo, la consegna del gene lentivirali di embrioni di topo è facilitata da permeabilizing la zona utilizzando un laser. Il laser XYClone è stato sviluppato come sussidio per la coltivazione di cellule staminali embrionali²²e in vitro fertilizzazione²¹ . Si tratta di un piccolo apparecchio che è semplice da configurare e facile da usare. Una volta installata su un microscopio, occupa lo spazio di una lente obiettiva e il software in dotazione permette di puntamento laser mentre guardando attraverso gli oculari del microscopio (Vedi protocollo: sezione 3). Una volta che la zona è perforata dal laser XYClone, lentivirus può essere introdotto nel terreno di coltura per gene consegna²³. Lentivirus multiple potrebbero essere utilizzati per inviare simultaneamente diversi geni per costituzione cromosomica.

Questo protocollo descriverà come isolare e cultura mouse fecondato uova, viene illustrato l'utilizzo del laser per perforazione della zona pellucida e dimostra la trasduzione di cellule embrionali di topo da lentivirus.

Protocollo

Tutte le procedure animale e trattamenti utilizzati nel presente protocollo erano in conformità con le linee guida di NIH/NIEHS cura degli animali e sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) presso il NIH/NIEHS, animale protocollo 2010-0004.

1. preparati

1. Preparare/acquisto ricombinante non propagante lentivirus che trasporta il gene di interesse. In questo studio, lentivirus SBI511 espressione della proteina fluorescente verde Copepoda (copGFP; abbreviato in GFP) da un allungamento promotore 1a fattore è stato usato per la trasduzione. Protocolli standard² sono stati utilizzati per produrre e lentivirus titolo a titoli superiori a 1e8 transducing unità / mL (TU/mL).
   Nota: Prestare attenzione e tutto il materiale che sono stati a contatto con lentivirus di candeggina. Fare riferimento alle linee guida del vostro Istituto per sicurezza d'uso e la manipolazione di lentivirus.
2. L'installazione di coppie riproduttrici di razza del topo desiderato il giorno prima della raccolta di embrioni. In questo esperimento, è stato utilizzato C57BL/6J ceppo di topi. Utilizzato per la raccolta di ovidotto e ovaie di topi femmina non sono stati trattati con ormoni per superovulazione.
3. 2 – 24 h prima della raccolta uova mouse fertilizzato, preparare diverse piastre di goccia²⁴ (KSOM) di potassio Simplex ottimizzato Medium come segue: aggiungere una goccia di 50 μL di mezzo KSOM per mezzo di una piastra di coltura tissutale-trattati di 35 mm e coprire con 2 mL di Dimetilpolisiloxano (DMPS5X) e posto al 37 ^oC, 5% CO₂, 5% O₂ e 90% N₂ per equilibrare.
   Nota: Usare piastre sterili monouso e gettare a seguito dell'esposizione a lentivirus.
4. Preparare soluzione 1x dell'ialuronidasi nel terreno di M2 da soluzione madre (100 x, 30 mg/mL, conservare a-20 ° C). 100 x soluzione di riserva è stato preparato in acqua.
5. 24h post laser-assistita di trasduzione delle uova fecondata del mouse, impostare coppie tra vasectomia topi maschi e femmine per preparare i topi femminili pseudopregnant.

2. isolamento del Mouse fecondate le uova

1. 16 – 24 h post accoppiamento, selezionare topi femminili con spine vaginali indicative di accoppiamento riuscito e umanamente eutanasia²⁵. I topi utilizzati in questo studio sono stati eutanasizzati di dislocazione cervicale sotto profonda inalazione di CO₂ o isoflurano.
2. Isolare le ovaie e ovidotti secondo protocolli standard²⁵.
3. Trasferire le ovaie e ovidotti ad un piatto di 35 mm contenente M2 media.
4. Per ogni ovaia, strappare ampolla a pezzi per rilasciare le uova fecondate circondate da cellule del cumulo.
5. Trasferire le uova fecondate e le cellule del cumulo a un 35 mm piatto contenente 1 ialuronidasi x nel mezzo di M2 e incubare a temperatura ambiente per 3 – 5 min.
6. Dispensare fecondate le uova su e giù per rilasciare le cellule del cumulo.
7. Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente M2 media e dispensare su e giù per lavare via l'ialuronidasi.
8. Trasferire uova fecondate in un piatto di 35 mm contenente KSOM e dispensare su e giù per lavare via i rimanenti M2 media e ialuronidasi.
9. Trasferire le uova fecondate per le piastre di goccia KSOM preparate dal passaggio 1.3.
   Nota: Mouse fecondato uova in KSOM devono essere mantenute in coltura tissutale incubatore a 37 ° C, 5% CO₂, 5% O₂ e 90% N₂ per equilibrare. Rimozione di piastre da incubatrice per più di 15 min si tradurrà in danno agli embrioni.
10. Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice prima di passare al passaggio successivo.

3. perforazione del Mouse fecondato uova con Laser XYClone

1. Configurare e calibrare XYClone laser secondo la raccomandazione del costruttore. Altri laser, in genere utilizzato per la fecondazione in vitro , può essere sostituito con XYClone laser perforare le uova fecondate.
   1. Collegare il filo di casella controller laser all'apparato laser sul microscopio.
   2. Fissare la scatola del regolatore laser al computer che esegue il software laser tramite una porta USB. 3.1.3. Collegare il controller laser e accenderlo.
   3. Guardando attraverso l'oculare, perforare un campione (ad es. a secco-erase marcature su un vetrino).
   4. Utilizzare un piccolo cacciavite (incluso nel kit laser) per regolare la X e posizione Y del laser per abbinare il LED luce visibile attraverso l'oculare del microscopio e tarare il laser.
2. Posizionare un piatto di goccia KSOM contenenti uova fecondata mouse sul tavolino del microscopio. Non tenere la piastra di fuori dell'incubatore per più di 15 min.
3. Guardare attraverso l'oculare del microscopio e assicurarsi che zona pellucida dell'embrione è a fuoco e il laser luce LED è visibile.
4. Spostare il tavolino del microscopio per indirizzare la zona con il laser e la luce del LED.
5. Utilizzo del software PC impostato XYClone laser 250 μs.
6. Regolare le dimensioni di luce LED per dimensioni desiderate (impostazione 5 in questo esperimento).
7. Perforare la zona di ogni ovulo fecondato tre volte con il laser. La zona può essere trafitto o diluito. Utilizzando le impostazioni di cui sopra, il laser si produrrà un buco con un diametro di 10 μm (Figura 2).
   Nota: Laser che mira vicino al corpo di polar allontana le cellule embrionali.
8. Consentire uova fecondate di recuperare per 2 h nell'incubatrice di coltura del tessuto prima di passare al passaggio successivo.

4. trasduzione del Mouse fecondate le uova dopo perforazione Laser XYClone

1. Pipettare 2 μL di concentrato lentivirus (maggiore di titolo TU/mL 1e8) nella goccia KSOM 50 μL. Non pipettare su e giù. Le uova fecondate facilmente collegare il puntale. Basandoci sulla nostra esperienza, 1e5-5e5 unità trasduzione di lentivirus in un volume minore di 3 µ l è ottimale per la consegna del gene.
2. Consentire uova fecondate di svilupparsi in blastocisti per 4 giorni nell'incubatrice. Nessuna necessità di cambiare il supporto.

5. non-chirurgico trasferimento degli embrioni del Mouse trasdotte ai topi pseudo-incinto

1. Utilizzare il mouse pseudopregnant, 3,5 giorno dopo l'accoppiamento, preparata al punto 1.5.
2. Usare il dispositivo Non-Surgical Embryo Transfer (SNE) per impiantare embrioni di topo in pseudopregnant topi.
   1. Utilizzando un microscopio chirurgico o dissezione, inserire uno speculum vaginale per visualizzare la cervice.
   2. Inserire il dispositivo di trasferimento di embrioni Non-Surgical (SNE) circa 5 mm la cervice e deposito embrioni in un volume di circa 2 µ l.
      Nota: Un dispositivo sterile SNE è utilizzato per ogni trasferimento e scartato dopo la procedura. Tutti i reattivi utilizzati nella manipolazione degli embrioni devono essere sterili.
3. Trasferire 10 – 15 blastocisti sano nel volume 2 di μL di KSOM ogni pseudopregnant topi.
4. Continuare a monitorare e misurare il guadagno di peso nei topi pseudopregnant nei giorni successivi per determinare se lo SNE è stata completata.
5. Recuperare i cuccioli permettendo i topi incinto a partorire naturalmente o effettuando un taglio cesareo 17 giorni dopo il trasferimento dell'embrione²⁶. Un taglio cesareo è spesso necessario se pochissimi embrioni sono presenti e crescono troppo grande per nascita naturale.
6. Raccogliere tessuto da cuccioli per la genotipizzazione determinare il tasso di transgenesi²⁷.

Risultati

Sviluppo di uova mouse isolato/trasdotte fertilizzato può essere verificato sotto il microscopio ogni giorno (Figura 1). Gli embrioni sani si sviluppano in blastocisti entro 3-4 giorni. In questo protocollo, 60 – 70% degli embrioni non trattati sviluppano in blastocisti²³. Su 114 embrioni trasdotte traforato al laser, 54 sviluppato in blastocisti (tasso del 47%) e 46 blastocisti espresso GFP (46/54 = 85%)²³.<...

Discussione

La capacità di integrare nel loro genoma ospite il lentivirus li rende un vettore ideale per consegna stabile del gene. Vettori lentivirali possono trasportare fino a 8,5 paio di kilobase (kbp) di materiale genetico che può ospitare promotori cellula-specifico o inducibili, marcatori di selezione o moiety fluorescente. Materiale genomico incorporato può replicare come parte del loro genoma ospite e regolato per esprimere o disattivare a intervalli di tempo desiderato. Questi vettori consentono un controllo spatiotempo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CD510B-1 plasmid	System Biosciences	CD510B-1	used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
Dimethylpolysiloxane	Sigma	DMPS5X	culturing embryos
hyaluronidase	Sigma	H3506	used to remove cumulus cells
XYClone Laser	Hamilton Thorne Biosciences		perforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Device	ParaTechs	60010	NSET of embryos
KSOM medium	Millipore	MR-020P-5F	culturing embryos
Composition of KSOM:			mg/100mL
NaCl			555
KCl			18.5
KH2PO4			4.75
MgSO4 7H2O			4.95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
Glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt			0.174mL
10 mM EDTA			100µL
Streptomycin			5
Penicillin			6.3
0.5% phenol red			0.1mL
L-Glutamine			14.6
MEM Essential Amino Acids			1mL
MEM Non-essential AA			0.5mL
BSA			100
M2 medium	Millipore	MR-015-D	culturing embryos
Composition of M2:			mg/100mL
Calcium Chloride			25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)			16.5
Potassium Chloride			35.6
Potassium Phosphate, Monobasic			16.2
Sodium Bicarbonate			35
Sodium Chloride			553.2
Albumin, Bovine Fraction			400
D-Glucose			100
Na-HEPES			54.3
Phenol Red			1.1
Pyruvic Acid			3.6
DL-Lactic Acid			295