JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против Джин доставки. Эта статья описывает протокол для перфорации zona с лазером для передают эмбриональных клеток с лентивирусные векторы и создания трансгенных мышей.

Аннотация

Lentiviruses являются эффективным векторов для доставки гена в mammalian клетках. После трансдукции лентивирусные генома стабильно включены в хромосоме хост и передается потомству. Таким образом они являются идеальным векторов для создания стабильных клеточных линий, в естественных условиях доставки показателей и трансдукция одноклеточного оплодотворенных яиц для создания трансгенных животных. Однако мыши оплодотворенные яйца и ранней стадии эмбрионы находятся под защитой zona pellucida, гликопротеин матрицу, которая формирует барьер против лентивирусные гена доставки. Lentiviruses слишком велики, чтобы проникнуть zona и обычно поставляются микроинъекции вирусных частиц в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток. Потребность в высококвалифицированных технологов и специализированного оборудования свести к минимуму использование lentiviruses для доставки генов эмбрионов мыши. Эта статья описывает протокол для permeabilizing мыши оплодотворенные яйца, перфорации zona с помощью лазера. Лазерная перфорация не приводят к любой ущерб эмбрионов и позволяет lentiviruses для получения доступа к эмбриональных клеток для доставки генов. Transduced эмбрионы могут развиться в бластоцисты в пробирке и если имплантированы в мышей, pseudopregnant, перерасти в трансгенных щенков. Лазер, используемый в настоящем Протоколе, эффективный и простой в использовании. Гены, поставляемые lentiviruses стабильно инкорпорировать в мышиных эмбриональных клеток и являются инфекционными микрофлорой. Это альтернативный метод для создания трансгенных мышей, которая требует не микроманипуляции и микроинъекции оплодотворенных яиц.

Введение

Этот метод предоставляет подробные инструкции сделать доступными для доставки генов эмбриональных клеток, lentiviruses для permeabilizing вителлинового мыши оплодотворенных яиц. Lentiviruses созданным природой для доставки эффективного гена в mammalian клетках. Они заразить деления и не деления клетки и интегрировать их принимающих хромосомы1лентивирусные генома. Диапазон ячеек, лентивирусные узла легко расширяется pseudotyping рекомбинантных человека с гликопротеина вирус везикулярного стоматита (VSV-G), из-за широкого тропизм белка VSV-G2. После трансдукции лентивирусные гены являются стабильно интегрированы и выразили в рамках их принимающих хромосом, создавая идеальный инструмент для создания трансгенных животных. Если доставлены на ранней стадии эмбриональных клеток, лентивирусные генома реплицируется и выражена в весь организм. Лентивирусные трансдукции привела к производству мышей, крыс, курица, перепела и свиней3,4,5,6,7 среди других видов мутация. Типичный способ доставки лентивирусные гена, однако, требует квалифицированных техников и специализированное оборудование для преодоления вителлинового барьер, который инкапсулирует эмбрионы ранней стадии. Общая цель этого метода является описывают разрушения zona, с помощью лазера для облегчения доставки лентивирусные ген.

У млекопитающих яйца окружены zona pellucida, которая твердеет после оплодотворения для защиты оплодотворенных яиц против polyspermy и ограничить экологических взаимодействий8,9. Zona образует барьер, который удерживает lentiviruses от эмбриональных клеток до тех пор, пока эмбрионы вылупились как бластоциста. Культивированный мыши оплодотворенные яйца люк после 4 дней и должен быть имплантированы в pseudopregnant мышей до вылупления для нормального развития в детенышей. Таким образом для трансдукции, lentiviruses microinjected до вылупления из zona в полость наблюдаться, пространство между zona и эмбриональных клеток.

Zona pellucida часто удаляется в пробирке оплодотворение яйцеклетки человека увеличить скорость оплодотворение10. Однако химическое удаление мыши вителлинового отрицательно влияет на развитие эмбриона мыши и вредно для эмбриональных клеток11,12. Другие методы для доставки ген мыши оплодотворенные яйца преодолеть барьер вителлинового прямого микроинъекции ДНК в ядре клетки13. Pronuclear микроинъекции является эффективным средством доставки гены эмбрионов. Однако поскольку каждый эмбрион удерживается на месте индивидуально для микроинъекции, практика может быть трудоемким и требует много времени для начинающего пользователя.

Другие методы, такие как электропорации и photoporation являются полезными для переходных и краткосрочные поставки ген мыши оплодотворенные яйца14,,1516. Эти методы широко используются для доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и recombinases. Однако электропорация и photoporation доставки генов не может эффективно использоваться для создания мутация. Сперматозоидов, которые собираются из пробитого мыши придатка яичка также могут быть преобразованы в lentiviruses и используется для оплодотворения в пробирке для производства трансгенных животных17,18,19, 20.

В этом протоколе лентивирусные гена доставки эмбрионов мыши способствует permeabilizing зона, с помощью лазера. XYClone лазер был разработан для помощи в пробирке оплодотворение21 и культивирование эмбриональных стволовых клеток22. Это небольшой аппарат, который прост в установке и прост в использовании. После того, как установлен на микроскопе, он занимает пространство объектива и сопровождающих программное обеспечение позволяет для направленного лазерного глядя через окуляры микроскопа (см. протокол: раздел 3). После zona Перфорированная лазером XYClone, lentiviruses могут быть введены в культуру СМИ для доставки генов23. Несколько lentiviruses могут использоваться одновременно поставить несколько генов для регистрации хромосом.

Этот протокол будет описывать как изолировать и культуры мыши оплодотворенные яйца, иллюстрирует использование лазерной перфорации zona pellucida и демонстрирует трансдукции мышиных эмбриональных клеток, lentiviruses.

протокол

Все животные процедуры и процедуры, используемые в настоящем Протоколе соблюдают руководящие принципы ухода за животными NIH/NIEHS и были одобрены Уход за животными и использования Комитета (ACUC) на NIH/NIEHS, животное протокол 2010-0004.

1. Подготовка

  1. Подготовка/Покупка рекомбинантных-распространение lentiviruses, перевозящих ваш гена интереса. В этом исследовании, Лентивирусы SBI511, выражая копепод Зеленый флуоресцентный белок (copGFP; сокращенно GFP) с удлинением фактор 1a промоутер был использован для трансдукции. Стандартные протоколы,2 были использованы для производства и титр lentiviruses на титры, выше, чем 1e8 преобразования единиц / мл (TU/мл).
    Примечание: Используйте осторожно и отбеливать все материалы, которые были в контакте с lentiviruses. Обратитесь к рекомендации вашего института для безопасного использования и обработки lentiviruses.
  2. Установка гнездящихся пар штамма желаемого мыши накануне уборки эмбрионов. В этом эксперименте мышей C57BL/6J штамм был использован. Самок мышей, используемые для яичников и маточных труб коллекции не относились с любой гормонов для суперовуляции.
  3. 2 – 24 ч до уборки мыши оплодотворенные яйца, подготовить несколько калия симплекс оптимизирован среднего24 (КСОМ) падение пластины следующим: добавить 50 мкл капля КСОМ среднего до середины крышки и 35 мм культуры ткани лечение блюдо с 2 мл Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) и место на 37 oC, 5% CO2, 5% O2 и 90% N2 , чтобы сбалансировать.
    Примечание: Использование одноразовых стерильных пластин и выбросьте после воздействия lentiviruses.
  4. Подготовка 1 x решение гиалуронидазы в среде м2 от Стоковый раствор (100 x, 30 мг/мл, хранить при температуре от-20 ° C). 100 x Стоковый раствор был подготовлен в воде.
  5. 24 h пост трансдукции при помощи лазерной мыши оплодотворенных яиц, настроить гнездящихся пар между вазэктомии мужские и женские мышей подготовить pseudopregnant самок мышей.

2. изоляция мыши оплодотворенные яйца

  1. 16 – 24 h пост спаривания, выберите самок мышей с показателем успешного спаривания вагинальных свечей и гуманно усыпить25. Мышей, используемые в данном исследовании были умерщвлены, шейки матки дислокации под глубокую CO2 или изофлюрановая ингаляции.
  2. Изолируйте яичников и яйцеводов согласно стандартных протоколов25.
  3. Передать блюдо 35 мм, содержащие м2 СМИ яичников и яйцеводов.
  4. Для каждой завязи рвать ампула отдельно выпустить оплодотворенные яйца, окруженный кучевые клеток.
  5. Передача оплодотворенные яйца и кучевые клетки до 35 мм блюдо, содержащие 1 x гиалуронидазы в среде м2 и инкубации при комнатной температуре 3 — 5 мин.
  6. Накапайте оплодотворенные яйца вверх и вниз, чтобы освободить кучевые клетки.
  7. Передавать блюдо 35 мм, содержащие м2 СМИ и пипетки вверх и вниз, чтобы смыть гиалуронидаза оплодотворенных яиц.
  8. Передавать блюдо 35 мм, содержащие КСОМ и пипетки вверх и вниз, смыть оставшиеся м2 СМИ и гиалуронидазы оплодотворенных яиц.
  9. Оплодотворенные яйца передать подготовленные КСОМ падение пластины из шага 1.3.
    Примечание: Мышь оплодотворенные яйца в КСОМ должны храниться в инкубатор культуры ткани при 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 и2 90% N, чтобы сбалансировать. Удаление пластины из инкубатора для дольше, чем 15 минут приведет к повреждению эмбрионов.
  10. Разрешить оплодотворенные яйца взять 2 h в инкубаторе перед переходом к следующему шагу.

3. перфорация мыши оплодотворенные яйца с лазерным XYClone

  1. Настройки и калибровки лазерного XYClone согласно рекомендации производителя. Другие лазеры, как правило, используется для в пробирке оплодотворение, можно заменить XYClone лазерной перфорации оплодотворенных яиц.
    1. Подсоедините провод поле лазерного контроллер лазерного аппарата на микроскопе.
    2. Приложите поле контроллер лазерных на компьютер, работает лазер программного обеспечения через USB-порт. 3.1.3. подключить контроллер лазерных и включите его.
    3. Глядя через окуляр, перфорации испытательный образец (например сухого стирания маркировка на слайде стекла).
    4. Используйте небольшой отвертки (входит в комплект лазерных) для настройки X и Y позиции лазера, чтобы соответствовать светодиодный свет видимый через окуляр микроскопа и калибровку лазера.
  2. Место КСОМ падение пластины, содержащие мыши оплодотворенные яйца на сцене Микроскоп. Не держите пластину за пределами инкубатора для дольше, чем 15 мин.
  3. Посмотрите через окуляр микроскопа и убедитесь, что эмбрион вителлинового находится в фокусе и лазерный светодиодный свет виден.
  4. Перемещения микроскопа целевой zona с LED свет/лазера.
  5. С помощью компьютерного программного обеспечения XYClone лазер равным 250 МКС.
  6. Отрегулируйте размер Светодиодные света до желаемых размеров (настойка 5 в этом эксперименте).
  7. Трижды с лазерной перфорации zona каждое оплодотворенное яйцо. Zona можно проколоть или разбавлять. Используя выше настройки, лазер будет производить отверстие с диаметром 10 мкм (рис. 2).
    Примечание: Направленный недалеко от полярного тела держит лазера от эмбриональных клеток.
  8. Разрешить оплодотворенные яйца взять 2 h в инкубатор культуры ткани перед переходом к следующему шагу.

4. трансдукции мыши оплодотворенные яйца, после XYClone Лазерная перфорация

  1. Пипетки 2 мкл концентрированного человека (больше чем 1e8 титр ту/мл) в 50 мкл КСОМ падение. Сделать не накапайте вверх и вниз. Оплодотворенные яйца легко прикрепить до кончика пипетки. Основываясь на нашем опыте, преобразования единиц 1e5-5e5 человека в том, менее чем в 3 мкл является оптимальным для доставки генов.
  2. Разрешить оплодотворенные яйца перерасти в бластоциста 4 дней в инкубаторе. Нет необходимости менять средства массовой информации.

5. не хирургического перенос эмбрионов Transduced мыши на псевдо-беременных мышей

  1. Используйте pseudopregnant мышей, 3,5 дня после спаривания, подготовленные на шаге 1.5.
  2. Используйте Non-Surgical передачи эмбриона (NSET) устройство для имплантации эмбрионов мыши в pseudopregnant мышей.
    1. С помощью хирургического или рассекает микроскопом, вставьте вагинальный расширитель для визуализации шейки матки.
    2. Вставьте устройство нехирургическая передачи эмбриона (NSET) около 5 мм в шейки матки и депозит эмбрионов в объеме приблизительно 2 мкл.
      Примечание: Стерильные NSET устройство используется для каждой передачи и удаляются после процедуры. Все реактивы, используемые в манипуляции эмбрионы должны быть стерильными.
  3. Передача 10 – 15 здоровых бластоциста объема 2 мкл КСОМ для каждого pseudopregnant мышей.
  4. Продолжать отслеживать и оценивать увеличение веса в pseudopregnant мышей в последующие дни, чтобы определить, успешно ли NSET.
  5. Восстановите щенков, позволяя беременных мышей, чтобы родить естественно или выполнения кесарева сечения 17 дней после передачи эмбриона26. Кесарево сечение часто бывает необходимо, если присутствуют очень несколько эмбрионов и они растут слишком большой для естественного рождениа.
  6. Соберите ткани от щенков для генотипирования для определения скорости трансгенез27.

Результаты

Разработка изолированных/преобразованы мыши оплодотворенные яйца могут быть проверены под микроскопом ежедневно (рис. 1). Здорового эмбриона развиться в бластоцисты в течение 3 – 4 дней. В этом протоколе 60 – 70% необработанных эмбрионов развиться в блас?...

Обсуждение

Lentiviruses способность интегрироваться в их геном принимающей делает их идеальным вектор для доставки стабильного ген. Лентивирусные векторы могут нести до 8,5 kilobase пары (kbp) генетического материала, который может вместить клеток конкретных или индуцибельной промоутеров, маркеры выделения...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано очной программе исследований Национального института здравоохранения (НИЗ), Национальный институт окружающей среды медицинских наук (NIEHS). Мы благодарны д-р Роберт Петрович и доктор Джейсон Уильямс для критических чтении рукописи и полезные советы. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить д-р Бернд глянец, нокаут ядро, поток цитометрии фондом, микроскопии флуоресцирования и центр томографии и сравнительные ветвь медицины услуги NIEHS для их технический вклад. Мы хотели бы поблагодарить г-н Дэвид Гулдинг от сравнительной ветвь медицины и г-жа Лоис Вириком из центра изображения на NIEHS за предоставленную нам с фотографиями и иллюстрациями.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
CD510B-1 plasmidSystem BiosciencesCD510B-1used to package the lentivirus expressing EF1a-copGFP
DimethylpolysiloxaneSigmaDMPS5Xculturing embryos
hyaluronidaseSigmaH3506used to remove cumulus cells
XYClone LaserHamilton Thorne Biosciencesperforating mouse fertilized eggs
Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) DeviceParaTechs60010NSET of embryos
KSOM mediumMilliporeMR-020P-5Fculturing embryos
Composition of KSOM:mg/100mL
NaCl555
KCl18.5
KH2PO44.75
MgSO4 7H2O4.95
CaCl2 2H2O25
NaHCO3210
Glucose3.6
Na-Pyruvate2.2
DL-Lactic Acid, sodium salt0.174mL
10 mM EDTA100µL
Streptomycin5
Penicillin6.3
0.5% phenol red0.1mL
L-Glutamine14.6
MEM Essential Amino Acids1mL
MEM Non-essential AA0.5mL
BSA100
M2 mediumMilliporeMR-015-Dculturing embryos
Composition of M2:mg/100mL
Calcium Chloride25.1
Magnesium Sulfate (anhydrous)16.5
Potassium Chloride35.6
Potassium Phosphate, Monobasic16.2
Sodium Bicarbonate35
Sodium Chloride553.2
Albumin, Bovine Fraction400
D-Glucose100
Na-HEPES54.3
Phenol Red1.1
Pyruvic Acid3.6
DL-Lactic Acid295

Ссылки

  1. Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
  2. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , (2007).
  3. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  4. Filipiak, W. E., Saunders, T. L. Advances in transgenic rat production. Transgenic Research. 15 (6), 673-686 (2006).
  5. McGrew, M. J., Sherman, A., Lillico, S. G., Taylor, L., Sang, H. Functional conservation between rodents and chicken of regulatory sequences driving skeletal muscle gene expression in transgenic chickens. BMC Developmental Biology. 10, 26 (2010).
  6. Zhang, Y., et al. Production of transgenic pigs mediated by pseudotyped lentivirus and sperm. PLoS One. 7 (4), e35335 (2012).
  7. Zhang, Z., et al. Transgenic quail production by microinjection of lentiviral vector into the early embryo blood vessels. PLoS One. 7 (12), e50817 (2012).
  8. Wassarman, P. M. Zona pellucida glycoproteins. Annul Review of Biochemistry. 57, 415-442 (1988).
  9. Clift, D., Schuh, M. Restarting life: fertilization and the transition from meiosis to mitosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (9), 549-562 (2013).
  10. Fong, C. Y., et al. Blastocyst transfer after enzymatic treatment of the zona pellucida: improving in-vitro fertilization and understanding implantation. Human Reproduction. 13 (10), 2926-2932 (1998).
  11. Nijs, M., Van Steirteghem, A. C. Assessment of different isolation procedures for blastomeres from two-cell mouse embryos. Human Reproduction. 2 (5), 421-424 (1987).
  12. Ribas, R. C., et al. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. Biology of Reproduction. 74 (2), 307-313 (2006).
  13. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of National Academy of Science U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  14. Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Scientific Reports. 4, 6382 (2014).
  15. Hosokawa, Y., Ochi, H., Iino, T., Hiraoka, A., Tanaka, M. Photoporation of biomolecules into single cells in living vertebrate embryos induced by a femtosecond laser amplifier. PLoS One. 6 (11), e27677 (2011).
  16. Horii, T., et al. Validation of microinjection methods for generating knockout mice by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4, 4513 (2014).
  17. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of National Academy of Science U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  18. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Production of transgenic rats via lentiviral transduction and xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 79 (6), 1121-1128 (2008).
  19. Dann, C. T., Garbers, D. L. Production of knockdown rats by lentiviral transduction of embryos with short hairpin RNA transgenes. Methods in Molecular Biology. 450, 193-209 (2008).
  20. Chandrashekran, A., et al. Efficient generation of transgenic mice by lentivirus-mediated modification of spermatozoa. FASEB Journal. 28 (2), 569-576 (2014).
  21. Woods, S. E., et al. Laser-assisted in vitro fertilization facilitates fertilization of vitrified-warmed C57BL/6 mouse oocytes with fresh and frozen-thawed spermatozoa, producing live pups. PLoS One. 9 (3), e91892 (2014).
  22. Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, Q. V., Sills, E. S., Palermo, G. D. Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model. Journal of Translational Medicine. 4, 20 (2006).
  23. Martin, N. P., et al. En masse lentiviral gene delivery to mouse fertilized eggs via laser perforation of zona pellucida. Transgenic Research. 27 (1), 39-49 (2018).
  24. Lawitts, J. A., Biggers, J. D. Culture of preimplantation embryos. Methods in Enzymology. 225, 153-164 (1993).
  25. Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. Journal of Visualized Experiments. (53), (2011).
  26. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Caesarean section and fostering. CSH Protocols. 2006 (2), (2006).
  27. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  28. Bin Ali, R., et al. Improved pregnancy and birth rates with routine application of nonsurgical embryo transfer. Transgenic Research. 23 (4), 691-695 (2014).
  29. Liu, K. C., et al. Integrase-deficient lentivirus: opportunities and challenges for human gene therapy. Current Gene Therapy. 14 (5), 352-364 (2014).
  30. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141XYClone

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены