Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Summary

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Abstract

אנזימים הקשורים קולטן הם המתווכים העיקריים של הפעלה סלולרית. אנזימים אלה מוסדרים, לפחות בחלקו, על ידי אינטראקציות גופניות עם זנבות cytoplasmic של קולטני. האינטראקציות לעיתים קרובות להתרחש דרך חלבון ספציפי תחומים, לגרום ההפעלה של האנזימים. ישנן מספר שיטות ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. בעוד co-immunoprecipitation משמש בדרך כלל כדי ללמוד תחומים הנדרשים עבור אינטראקציות חלבון-חלבון, ישנם מבחני אין מסמך זה התרומה של תחומים ספציפיים לפעילות של אנזימים מגויסים באותו זמן. בהתאם לכך, השיטה המתוארת כאן משלב co-immunoprecipitation וזמינותו פעילות אנזימטי על חרוזי להערכה סימולטני של אינטראקציות בין חלבונים והפעלה אנזימטי המשויך. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות את התחומים הם קריטיים עבור אינטראקציות גופניות בין חלבון לבין האנזים על התחומים שאינם חובה להפעלה מלאה של האנזים. הוכח את החשיבות של זה וזמינותו, בתור קולטן מסוים חלבון תחומים לתרום הכריכה של האנזים ועד הזנב cytoplasmic של הקולטן, בעוד תחומים אחרים נדרשים להסדיר את הפונקציה של אותו אנזים.

Introduction

קולטנים קטליטי קולטן טירוזין kinases חלבונים transmembrane שבו איגוד של ליגנד חוץ-תאית גורמת פעילות אנזימטי הצד תאיים¹בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. קולטנים מסוימים בעלי קולטן והן פונקציות אנזימטיות, בעוד אחרים לגייס אנזימים מסוימים כגון kinases ו- phosphatases כדי cytoplasmic הזנבות שלהם. גיוס של אנזים הזנב הקולטן ואת הפעולה קטליטי עוקבות של האנזים הזה הם שני תהליכים נפרדים שמווסתים לא תמיד על-ידי אותו חלבון תחומים². למרבה הצער, אין כלים ספציפיים כדי להעריך את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי בו זמנית. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation המתוארים כאן היא שיטה שימושית לנתח הגיוס של אנזים ועד הזנב של קולטן מהפעלה שלה. זה וזמינותו מנצל immunoprecipitation של קולטני שתייגת על ידי חרוזים מצופים נוגדן. לאחר מכן, מבוצעות assay אנזימטי פעילות והן תספיג ניתוח על חרוזים. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחשוף אילו תחומים חלבון הכרחיות עבור אינטראקציות בין קולטנים ואנזימים (מוערך על ידי ניתוח תספיג), אילו תחומים הם חובה הפעלה מלאה של האנזימים (נמדדת בחרוז assay אנזימטי פעילות). היא משמעותית לפתח כלי לימוד הפונקציות נפרדים של אנזימים הקשורים קולטן בשל מעורבותם בפתוגנזה של מחלות אנושיות. יתר על כן, עוד יותר להבין את מנגנוני הפעולה של חלבונים אלו עשוי לסייע בעיצוב של הרומן התערבויות טיפוליות.

מוות מתוכנת-1 (PD-1) הוא קולטן המעכבת על פני השטח של תאי T והוא נדרש עבור הגבלת תגובות תא T מוגזמת. בשנים האחרונות, היו מעורבים נוגדנים anti-PD-1 בטיפול של ממאירות מספר^1,2. PD-1 מצדו ומרסן פונקציות תא T רבים, לרבות הפצה, הדבקה הפרשת ציטוקינים מספר^3,4,5. PD-1 הוא מקומי כדי הסינפסה חיסוניות, הממשק בין תאי T אנטיגן תאים⁶, איפה זה colocalizes עם תא T-קולטן (TCR)⁷. לאחר מכן, טירוזין phosphatase SHP2 [Src הומולוגיה 2 (SH2) תחום המכיל טירוזין phosphatase 2] הוא גויס אל זנב cytoplasmic PD-1, המוביל dephosphorylation של שאריות טירוזין מפתח בתוך TCR את מורכבות, המשויך צינתור איתות מולקולות^3,4,5,8,9. זנב cytoplasmic PD-1 מכיל שני מוטיבים טירוזין immunoreceptor המבוסס על טירוזין מעכבות מוטיב (עתים), מבוסס-switch מוטיב (ITSM) של טירוזין immunoreceptor¹⁰. שני מוטיבים הם phosphorylated על PD-1 מצדו^9,10. מוטגנזה מכוונת מחקרים גילו לתפקיד הראשי עבור ITSM גיוס, בניגוד עתים, שתפקידו PD-1 איתות ומתפקדים לא ברור SHP2⁴.

SHP2 מאמצת או מסוגרת (מקופל), עכבות קונפורמציה או פתוח (מורחב), פעיל קונפורמציה¹¹. לא הובהר כבר התרומה של כל תחום הזנב של PD-1 SHP2 מחייב או הפעלה. כדי לענות על שאלה זו, פיתחנו וזמינותו המאפשרת בדיקה מקבילה של הגיוס של SHP2 אל זנב PD-1 ושלה פעילות¹². אנחנו מועסקים co-immunoprecipitation ואת וזמינותו פעילות בחרוז פוספטאז לבחון את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי במקביל. שימוש assay הזה, אנו מראים כי ITSM של PD-1 מספיקה לגייס SHP2 אל זנב PD-1, בעוד עתים של PD-1 יש צורך להרחיב ולהפעיל את האנזים באופן מלא.

ישנם רצפטורים רבים שיש להם מספר תחומים סמוכים באזור הזנבות cytoplasmic שלהם. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation יכול לחשוף את התפקיד של תחומים ספציפיים הנחוצים עבור גיוס חלבון או הפעלת אנזימטיות.

Protocol

1. תרביות תאים תאים

1. זרע תאים 293T HEK 10 ס מ 12 לוחות (5 x 10⁶ תאים לכל צלחת) יום לפני תרביות תאים (איור 1). לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer. לשימוש בכל צלחת, 10 מ של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO₂.
2. ברגע שהתאים 80-90% confluent, transfect 5 צלחות HEK 293T באמצעות ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים עם אחד פלסמידים הבאים: וקטור לבטא SHP2, וקטור PD-1-GFP-ביטוי [גירסה מסוג בר (WT) של PD-1], גירסה מוטציה-עתים (Y223F ) של וקטור PD-1-GFP-לבטא, מוטציה-ITSM גירסה (Y248F) של וקטור PD-1-GFP-לבטא (איור 1).
   הערה: שתי צלחות להיות transfected עם וקטור WT PD-1-GFP-לבטא. לוח נוסף אחד ישמש פקד תאים שאינם transfected (איור 1).
3. לבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול של היצרן עבור תאים חסיד צלחות 10 ס מ.
   הערה: בגירסאות מוטציה של PD-1, טירוזין (Y) בכל מוטיב הוחלף על ידי פנילאלנין (נ) זה לא יכול להיות phosphorylated.
4. Transfect ערכה זהה שניה של חמישה לוחות, לוח נוסף אחד משמש פקד ללא transfected לשקילת כמות חלבון ביטוי [קלט; ידוע גם lysate התא כולו (WCL)] לפני immunoprecipitation (איור 1).
5. דגירה התאים transfected 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ מגשים תרביות רקמה.
   הערה: כדי להבטיח שאת תקנים בהצלחה אירעה, לבחון את התאים עבור הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. קידום זרחון בתאים Transfected

1. בעקבות דגירה, להכין טרי pervanadate על ידי ערבוב 50 µL של נתרן-orthovanadate (במלאי 100 מ מ) עם 50 µL של 30% H₂O₂.
   הערה: צריך לשנות התערובת לתוך צבע צהבהב. Pervanadate הוא מעכב פוספטאז תא חדיר המקדם זרחון טירוזין שאריות¹³. זה assay, הוא משמש כדי לגרום robustly זרחון של זנבות PD-1.
2. כדי phosphorylate את גרסאות מתויג PD-1, מסיר את המדיה מתאי PD-1-GFP-transfected ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM רגיל (ללא סרום או אנטיביוטיקה) יחד עם 10 µL של pervanadate (שלב 2.1) כל צלחת 10 ס מ (וכתוצאה שמונה צלחות לבטא גרסאות שונות של PD-1) (איור 1). מקם את הצלחות בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות.
   הערה: SHP2 transfected התאים (שתי צלחות; איור 1) שני לוחות בקרה שאינם transfected שאינם מטופלים עם pervanadate, מאז הצלחות האלה ישמש מקור האנזים SHP2 פעיל.
3. לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS קר כקרח 1 x. חזור על שלב זה פעמיים.

3. Immunoprecipitation

הערה: השלבים הבאים יש לבצעו על קרח או ב- 4 מעלות צלזיוס.

1. תוספת למאגר פירוק (50 מ מ טריס-HCl ב pH 7.2, 250 מ מ NaCl, 0.1% NP-40, 2 מ מ EDTA, 10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז (להמיס 1 טבלית 10 מ"ל של פירוק מאגר) ועם orthovanadate נתרן 1 מ מ. להוסיף 500 µL של המאגר הקר פירוק תאים, להסיר ולאסוף את התאים מן הלוחות מיידי באמצעות המגרד של התא.
   הערה: חשוב להוסיף את orthovanadate נתרן רק למאגר פירוק שישמש עבור לוחות PD-1-GFP-transfected, מאז הצלחות SHP2 transfected ואת לוחות בקרה שאינם transfected חייב לשמור על פעילות פוספטאז.
2. להעביר את lysates לתוך צינורות קר 1.5 mL ולסובב אותם ב 0.005 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
3. איסוף גרעינים פוסט supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) lysates, ספין למטה lysates 10 דקות ב x 10,000 g ב 4 ° C ולהעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים. להתעלם בגדר. אחסן את supernatants של הסט השני של שש צלחות (איור 1) על הקרח לניתוח WCL בשלב מאוחר יותר.
4. הכנה של חרוזים אנטי-GFP immunoprecipitation של PD-1-GFP מן lysates PD-1-GFP-transfected הראשונים להגדיר (ארבעה לוחות) (איור 1).
   1. כדי למנוע שיקוע של החרוזים, לנער בעדינות את הבקבוק עם החרוזים לפני הפתיחה. הסר µL 40 של חרוזים אנטי-GFP slurry לפי כל תנאי.
   2. ספין-x 500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע לשטוף את החרוזים.
      הערה: חשוב למזער את הקשר בין טיפים פלסטיק פיפטה חרוזים agarose למניעת אובדן. מומלץ לחתוך את הקצה של טיפ µL 200 לפני העברת את החרוזים צינור אחר.
   3. Resuspend את החרוזים ב- 80 µL פירוק מאגר (לכל דגימה).
5. הוסף את שטף החרוזים ישירות לתא lysate (מערכת העצבים ההיקפית) מתאי PD-1-GFP-לבטא הסט הראשון (ארבעה לוחות) (שלב 3.3). סובב ב x 0.005 גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C immunoprecipitate ה-GFP מתויג חלבונים.
6. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא orthovanadate) 3 פעמים. Centrifuge את הצינור ב x 2,500 g 10 s.
   הערה: בעת הוספת המאגר פירוק החרוזים, הוסף אותו ישירות על גבי החרוזים מבלי לגעת בהם עם העצות. יש צורך פיפטה למעלה ולמטה במהלך שוטף.
7. במידה שווה לחלק את lysate של SHP2 הפעיל מהסט הראשון (לוח אחד; שלב 3.3) ולהוסיף אותו שלושה צינורות של חרוזים PD-1-GFP-המכיל שטף (את WT PD-1-GFP, שתי מוטציות שונות phosphdeficient, Y223F ו- Y248F). להוסיף שליש אחד של אמצעי האחסון של lysate של תאים שאינם transfected הצינור השני של חרוזים WT PD-1-GFP. להתעלם הנותרים של שני שלישים.
8. דגירה החרוזים במשך 4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב עדין (0.005 x g).
9. לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא pervanadate או orthovanadate), כפי שדווח בשלב 3.6.
10. מוסיפים 80 µL מאגר פירוק (ללא pervanadate או orthovanadate) לכל דגימה שהייתך הנפח הכולל של כל שפופרת 100 µL (20 µL של חרוזים) ו- 80 µL מאגר פירוק. לערבב בעדינות, להעביר 50 µL מהצינור כל שני צינורות mL 1.5 טריים.
    הערה: לאחר שלב זה, יהיו שני צינורות ממולא בתערובת המכילה חרוזים ומאגר פירוק: שפופרת אחת תשמש עבור בדיקות של SHP2 co-immunoprecipitated על ידי סופג המערבי, ואת השני ישמש עבור פעילות פוספטאז וזמינותו.

4. פוספטאז פעילות Assay

1. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם מאגר שטיפת פוספטאז (30 מ מ Hepes pH 7.4 ו- 120 מ"מ NaCl). הסר את תגובת שיקוע לחלוטין.
2. להוסיף 100 µL assay מאגר (30 מ מ Hepes ב- pH 7.4, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ DTT, 10 מ מ p-nitrophenylphosphate) החרוזים, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות עדין. הערה: זמן הדגירה עלול להשתנות, אלא להמתין עד המאגר לצהוב על dephosphorylation.
3. לסיום התגובה, להוסיף 50 µL של 1 M NaOH כאשר המאגר לצהוב.
4. ספין למטה ב 2,500 x g עבור 10 s והעברת 50 µL של תגובת שיקוע על שתי בארות (כפילות עם µL 50 לכל טוב) של חצי-אזור בצלחת 96-ובכן. לקרוא את ספיגת-405 ננומטר.
5. לבטא את התוצאות כמו צפיפות אופטית היחסי (OD) על פני גירסת פראי-סוג הבקרה PD-1-GFP.

5. SHP2 תספיג ניתוח

1. ספין למטה החרוזים ולהסיר את תגובת שיקוע.
2. הוסף 20 µL מאגר x Laemmli 2 (ראה טבלת חומרים) חרוזים, לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. למדוד את ריכוז חלבון הקלט פקדים (סט שני) באמצעות BCA קיט (ראה טבלת חומרים). µL 30 המדגם מדולל ביותר להעביר צינור חדש. לדלל את שאר הפקדים קלט עם פירוק מאגר לריכוז אותו כמו הדגימה מדולל ביותר ולאחר להעביר 30 µL של כל אחד מהם צינור חדש.
   הערה: לאחר שלב זה, יהיו 4 צינורות עם 30 µL כל אחד, בריכוזים חלבון דומה, המייצג את הקלט שולטת lysates.
4. להוסיף נפחים שווים של מאגר x Laemmli 2 ה lysates ל לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק ספין למטה את החרוזים ולטעון את תגובת שיקוע על 4 – 20% ג'ל המבוסס על טריס מרחביות-דף (ראה טבלת חומרים) המערבי כתם ניתוח. בנוסף, טען 50 µL מ כל דגימה של הסט השני.
5. המשך ניתוח תספיג לפי הפרוטוקול שתואר קודם לכן¹².

תוצאות

בעוד התרומה של ITSM PD-1 עד SHP2 האיגוד נוצר, התפקיד של עתים PD-1 הוא פחות ברור. מכיוון SHP2 יש שני תחומים SH2 שאינם יכולים לאגד שני phosphotyrosines רציפים ב- PD-1 (אחד טירוזין ב ITSM) ובחודש עתים, שיערנו כי ITSM של PD-1 עוגנים SHP2 ל- PD-1, בעוד עתים של PD-1 מקלה על פעילות SHP2 על-ידי ייצוב שלה פתח את המדינה הסתג...

Discussion

קולטן-אנזים אינטראקציות מכריעים עבור מערכת אזעקה תאיים. אנזימים רבים גייסו לקולטנים באמצעות תחומים SH2 מחייב את tyrosines phosphorylated המעטרים זנבות של קולטני אותו. עם זאת, אנזימים מקופלים לעתים קרובות לתוך הייצורים החיים לא פעיל סגור, ודורש הפעלה לשינוי הסתגלותי¹¹ זה יכול להיות מתווכת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Lonza	17-516F	Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H	Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin	Fisher	BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine	Lonza	BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti–GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001	EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC2676	Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-well
Nitrocellulose membranes	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium chloride
HEPES	Gibco	15630080	N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT	Invitrogen	D1532	Dithiothreitol
pNPP	Sigma	20-106	p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH	Sigma	S8045	Sodium hydroxide
BCA	Fisher	23225	Bi Cinchoninic Acid assay