Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur-perle d’étudier simultanément la contribution de domaines de protéines spécifiques des récepteurs de la membrane plasmique à la fois de recrutement d’enzyme et de l’activité enzymatique.

Résumé

Associés aux récepteurs enzymes sont les principaux médiateurs d’activation cellulaire. Ces enzymes sont réglementés, au moins en partie, par des interactions physiques avec des queues cytoplasmique des récepteurs. Souvent, les interactions sont dus à des domaines spécifiques de la protéine et aboutir à l’activation des enzymes. Il existe plusieurs méthodes pour étudier les interactions entre protéines. Tandis que co-immunoprécipitation est couramment utilisée pour étudier des domaines qui sont requises pour les interactions protéine-protéine, il ne sont a aucun tests que la contribution de domaines spécifiques à l’activité des enzymes recrutés en même temps le document. Par conséquent, la méthode décrite ici combine co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur la perle pour l’évaluation simultanée des interactions entre les protéines et l’activation enzymatique associée. Ce protocole vise à identifier les domaines qui sont essentiels pour les interactions physiques entre une protéine et enzymatiques et les domaines qui sont obligatoires pour l’activation complète de l’enzyme. On démontre l’importance de ce test, comme certains récepteurs domaines protéiques contribuent à la liaison de l’enzyme de la queue cytoplasmique du récepteur, tandis que d’autres domaines sont nécessaires pour réguler les fonctions de la même enzyme.

Introduction

Récepteurs catalytiques et récepteurs tyrosine kinases sont des protéines transmembranaires dont liaison d’un ligand extracellulaire provoque l’activité enzymatique du côté intracellulaire¹. Certains récepteurs possèdent les récepteurs et les fonctions enzymatiques, tandis que d’autres recrutent des enzymes spécifiques tels que les kinases et phosphatases à leur queue cytoplasmique. Recrutement d’une enzyme à queue du récepteur et de l’action subséquente catalytique de l’enzyme sont deux processus distincts qui ne sont pas toujours régis par la même protéine domaines². Malheureusement, il n’y a pas d’outils spécifiques pour évaluer l’interaction et l’activité enzymatique en même temps. L’essai de co-immunoprécipitation fonctionnelle décrite ici est une méthode utile pour disséquer le recrutement d’une enzyme de la queue d’un récepteur de son activation. Ce test utilise immunoprécipitation des récepteurs marqués par perles recouverts d’anticorps. Par la suite, une analyse d’activité enzymatique et analyse par western blot sur perles sont effectuées. L’objectif général de cette méthode consiste à découvrir quels domaines protéiques sont nécessaires pour les interactions entre les récepteurs et les enzymes (évaluées par analyse par western blot) et quels domaines sont obligatoires pour l’activation complète des enzymes (mesurée par sur-perle dosage de l’activité enzymatique). Il est important de développer des outils pour étudier les fonctions distinctes des enzymes associées aux récepteurs en raison de leur implication dans la pathogenèse des maladies humaines. Par ailleurs, mieux comprendre les mécanismes d’action de ces protéines peut aider à la conception de nouvelles interventions thérapeutiques.

1 mort programmée (PD-1) est un récepteur inhibiteur sur la surface des cellules T et est nécessaire pour limiter les lymphocytes T excessive. Ces dernières années, les anticorps anti-PD-1 ont été impliqués dans le traitement de multiples affections malignes^1,2. PD-1 ligature retient de nombreuses fonctions des lymphocytes T, y compris la prolifération, adhérence et la sécrétion de plusieurs cytokines^3,4,5. PD-1 est localisée à la synapse immunologique, l’interface entre les lymphocytes T et les présentatrices d’antigène des cellules⁶, où il approche avec les récepteurs des lymphocytes T (TCR)⁷. Par la suite, la tyrosine-phosphatase SHP2 [homologie Src 2 (SH2) domaine contenant tyrosine-phosphatase 2] est recruté à la queue cytoplasmique de PD-1, conduisant à la déphosphorylation des résidus tyrosine clé au sein du complex TCR et ses associés proximales signalisation des molécules^3,4,5,8,9. La queue cytoplasmique de PD-1 contient deux motifs de tyrosine, un motif inhibiteur d’immunoreceptor tyrosine-basé (ITIM) et un immunoreceptor tyrosine motif basé-commutateur (ITSM)¹⁰. Les deux motifs sont phosphorylées après ligature de PD-1^9,10. Études de mutagenèse ont révélé un rôle primordial pour la GSTI SHP2 recrutement, par opposition à l’ITIM, dont le rôle dans la signalisation PD-1 et la fonction n’est pas clair⁴.

Shp2 adopte soit une fermée (plié), inhibe la conformation ou un ouvert (étendu), conformation active¹¹. La contribution de chaque domaine de queue de PD-1 à SHP2 liaison ou l’activation n’a pas encore été élucidée. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test qui permet l’essai parallèle du recrutement de SHP2 à la queue de PD-1 et son activité¹². Nous avons utilisé co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité de sur-bead phosphatase pour tester l’interaction et l’activité enzymatique en parallèle. À l’aide de ce test, nous montrons que l’ITSM de PD-1 est suffisant pour recruter SHP2 à la queue de PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 est nécessaire pour pleinement s’étendent et activer l’enzyme.

Il n’y a de nombreux récepteurs disposant de plusieurs domaines adjacents dans leurs queues cytoplasmique. Le test fonctionnel co-immunoprécipitation peut découvrir le rôle des domaines spécifiques qui sont nécessaires pour le recrutement de protéines ou activation enzymatique.

Protocole

1. la transfection de cellules

1. Les semences des cellules HEK 293 t en douze plaques de 10 cm (5 x 10⁶ cellules / plaque) la veille de la transfection (Figure 1). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour chaque plaque, utiliser 10 mL de DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C à 5 % de CO₂.
2. Une fois que les cellules sont 80 à 90 % anastomosé, transfecter 5 plaques HEK 293 t en utilisant un réactif à base de lipides transfection avec un des plasmides suivants : un vecteur exprimant le SHP2, un vecteur de PD-1-GFP-exprimer [une version de type sauvage (WT) de PD-1], une version ITIM muté (Y223F ) d’un vecteur exprimant PD-1-GFP et une version d’ITSM muté (Y248F) d’un vecteur exprimant PD-1-GFP (Figure 1).
   Remarque : Deux plaques vont être transfectées avec le vecteur WT PD-1-GFP-exprimer. Une plaque supplémentaire servira à un contrôle de cellules non transfectées (Figure 1).
3. Effectuer la transfection conformément au protocole du fabricant pour les cellules adhérentes en plaques de 10 cm.
   Remarque : Dans les versions mutantes de PD-1, la tyrosine (Y) dans chaque motif a été remplacée par la phénylalanine (F) qui ne peuvent pas être phosphorylée.
4. Transfecter une deuxième série identique de cinq plaques et une plaque supplémentaire, agissant comme un contrôle non transfectées pour la mesure de la quantité de la protéine exprimée [entrée ; également connu sous le nom lysats de cellules entières (CMT)] avant l’immunoprécipitation (Figure 1).
5. Incuber les cellules transfectées de 48 h à 37 ° C, 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture de tissus.
   Remarque : Pour vous assurer que la transfection a eu lieu avec succès, examiner les cellules pour l’expression de la GFP à l’aide d’un microscope à fluorescence.

2. promouvoir la Phosphorylation dans les cellules transfectées

1. Après incubation, préparer pervanadate frais en mélangeant 50 µL d’orthovanadate de sodium (à partir de stock de 100 mM) avec 50 µL de 30 % H₂O₂.
   Remarque : Le mélange devrait se transformer en une couleur jaunâtre. Pervanadate est un inhibiteur de la phosphatase perméable à la cellule qui favorise la phosphorylation de tyrosine résidus¹³. Dans ce test, il est utilisé pour robustement induit la phosphorylation de la queue de PD-1.
2. Pour phosphoryler les versions étiquetées de PD-1, enlevez le média les cellules transfectées de PD-1-GFP et ajouter 10 mL de plaine DMEM (sans sérum ou antibiotiques) ainsi que de 10 µL de pervanadate (étape 2.1) sur chaque plaque de 10 cm (soit huit plaques exprimant différentes versions de PD-1) (Figure 1). Placer les plaques dans l’obscurité pendant 15 min à température ambiante.
   Remarque : Les cellules de SHP2 transfectées (deux planches ; La figure 1) et les deux plaques de contrôle non transfectées ne sont pas traités avec pervanadate, puisque ces plaques serviront comme source pour l’enzyme active de SHP2.
3. Laver les cellules avec 5 mL de PBS glacée 1 x. Répéter cette étape deux fois.

3. immunoprécipitation

Remarque : La procédure suivante doit être effectuée sur la glace ou à 4 ° C.

1. Supplément du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 2 mM EDTA, 10 % de glycérol) avec les inhibiteurs de la protéase (dissoudre 1 comprimé dans 10 mL de tampon de lyse) et orthovanadate de sodium 1 mM. Ajouter 500 µL de tampon de lyse glacée aux cellules et retirer et récupérer les cellules des plaques immédiatement à l’aide d’un grattoir de cellules.
   Remarque : Il est important d’ajouter l’orthovanadate de sodium uniquement pour le tampon de lyse qui sera utilisé pour les plaques PD-1-GFP-transfectées, puisque les plaques SHP2 transfectées et non transfectées contrôle doit conserver l’activité phosphatase.
2. Les lysats de transfert dans des tubes à froid 1,5 mL et tournez-les à 0,005 x g, 4 ° C pendant 30 min.
3. Pour collecter les noyaux post surnageantes (PNS) les lysats, tournez en bas les lysats pendant 10 min à 10 000 x g à 4 ° C et transvaser le surnageant dans tubes neufs. Jeter le culot. Stocker les surnageants de la deuxième série de six planches (Figure 1) sur la glace pour une analyse ultérieure de CMT.
4. Préparation des billes anti-GFP pour l’immunoprécipitation de PD-1-GFP des PD-1-GFP-lysats de la première valeur (quatre plaques) (Figure 1).
   1. Pour empêcher la sédimentation des perles, agiter doucement le flacon avec les perles avant ouverture. Retirez 40 µL de perles anti-GFP de la boue par chaque État.
   2. Essorage à 500 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer le surnageant pour laver les perles.
      Remarque : Il est important de réduire au minimum le contact entre les embouts en plastique et perles d’agarose pour empêcher la perte. Il est recommandé de couper le bord d’une pointe µL 200 avant de transférer les perles dans un autre tube.
   3. Remettre en suspension les perles dans 80 µL de tampon de lyse (par exemple).
5. Ajouter les perles lavés directement dans le lysat cellulaire (PNS) des cellules de la première série (quatre plaques) PD-1-GFP-exprimer (étape 3.3). Tourner à 0,005 x g pendant 30 min à 4 ° C aux protéines de l’immunoprécipitation de la GFP-étiquetée.
6. Laver les billes avec 1 mL de tampon de lyse froid (sans orthovanadate) 3 fois. Centrifuger le tube à 2 500 g pendant 10 s.
   Remarque : Lorsque vous ajoutez le tampon de lyse aux talons, ajoutez-le directement sur les perles sans les toucher avec les pointes. Il n’y a aucun besoin de pipette de haut en bas pendant les lavages.
7. Tout aussi diviser le lysat de la SHP2 active de la première série (une plaque ; étape 3.3) et ajoutez-le à trois tubes de lavé perles PD-1-GFP-contenant (le WT PD-1-GFP et les deux phosphdeficient différentes mutations, Y223F et Y248F). Ajouter un tiers du volume depuis le lysat des cellules non transfectées dans le deuxième tube de perles WT PD-1-GFP. Jeter les deux tiers restants.
8. Incuber les perles pendant 4 h à 4 ° C, avec une légère rotation (0,005 x g).
9. Laver les perles deux fois avec 1 mL de tampon de lyse froid (sans pervanadate ni orthovanadate), comme indiqué à l’étape 3.6.
10. Ajouter 80 µL de tampon de lyse (sans pervanadate ni orthovanadate) par exemple veiller à ce que le volume total dans chaque tube est de 100 µL (20 µL de perles) et 80 µL de tampon de lyse. Mélanger doucement et transférer 50 µL de chaque éprouvette dans deux tubes de frais 1,5 mL.
    NOTE : Après cette étape, il y aura deux tubes remplis d’un mélange qui contient des perles et tampon de lyse : un tube sera utilisé pour tester la SHP2 co-immunoprécipitée western blot, et le second sera utilisé pour le dosage de l’activité phosphatase.

4. analyse d’activité de la phosphatase

1. Laver les billes une fois avec le tampon de lavage phosphatase (Hepes de 30 mM à pH 7.4 et 120 mM NaCl). Retirez complètement le surnageant.
2. Ajouter 100 µL de tampon (Hepes de 30 mM à pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophénylphosphate) aux talons et incuber à 30 ° C pendant 30 min sous agitation modérée. NOTE : Temps d’Incubation peuvent varient, mais attendez que le tampon se colore en jaune sur la déphosphorylation.
3. Pour terminer la réaction, ajouter 50 µL de 1 NaOH M lorsque la mémoire tampon se colore en jaune.
4. Tournez en bas à 2 500 g pendant 10 s et le transfert de 50 µL de surnageant dans deux puits (doublons avec 50 µL / puits) de demi-zone dans une plaque à 96 puits. Lire l’absorbance à 405 nm.
5. Exprimer les résultats sous forme de relative densité optique (do) sur la version sauvage de contrôle de PD-1-GFP.

5. SHP2 Analyse par Western Blot

1. Tournez en bas les perles et éliminer le surnageant.
2. Ajouter 20 µL de tampon de x Laemmli 2 (voir la Table des matières) pour les perles et les faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min.
3. Mesurer la concentration de la protéine de la saisie des REGLAGES (deuxième) à l’aide d’une ACA nécessaire (voir la Table des matières). Transférer 30 µL de l’échantillon plus dilué dans un nouveau tube. Diluer le reste des contrôles d’entrée avec tampon de lyse à la même concentration que l’échantillon plus dilué et transférer 30 µL de chacune d’elles dans un nouveau tube.
   NOTE : Après cette étape, il y aura 4 tubes avec 30 µL de chacune, à des concentrations de protéines similaires, ce qui représente l’entrée contrôle lysats.
4. Ajouter des volumes égaux de 2 x Laemmli tampon aux lysats et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min. Spin bas les perles et le surnageant sur 4 – 20 % gel SDS-PAGE Tris-base de charge (voir la Table des matières) pour western blot analyse. En outre, charger 50 µL de chaque échantillon de la deuxième série.
5. Continuer l’analyse par western blot selon le protocole décrit précédemment¹².

Résultats

Alors que la contribution de l’ITSM de PD-1 à SHP2 liaison est établie, le rôle de l’ITIM de PD-1 est moins clair. Parce que SHP2 a deux domaines SH2 qui peuvent se lier à deux phosphotyrosines séquentiels sur PD-1 (une tyrosine dans l’ITSM) et l’autre à l’ITIM, nous avons émis l’hypothèse que l’ITSM de PD-1 ancre SHP2 PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 facilite l’activité SHP2 en stabilisant sa Ouvrez l’état conformationnel^11,...

Discussion

Des interactions de récepteur-enzyme sont cruciales pour la signalisation intracellulaire. De nombreuses enzymes sont recrutés aux récepteurs à travers les domaines SH2 liant à des tyrosines phosphorylés qui décorent les queues des mêmes récepteurs. Cependant, enzymes sont souvent pliés en conformations inactives fermées, et l’activation requiert un changement conformationnel de¹¹ qui peut être médiée par les autres domaines d’un même récepteur. Le test décrit ici mesures les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Lonza	17-516F	Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H	Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin	Fisher	BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine	Lonza	BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti–GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001	EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC2676	Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-well
Nitrocellulose membranes	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium chloride
HEPES	Gibco	15630080	N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT	Invitrogen	D1532	Dithiothreitol
pNPP	Sigma	20-106	p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH	Sigma	S8045	Sodium hydroxide
BCA	Fisher	23225	Bi Cinchoninic Acid assay