수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

요약

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

초록

수용 체 관련 된 효소는 세포 활성화의 주요 중재자. 이 효소는 통제, 적어도 부분에서 수용 체의 세포질 꼬리와 물리적 상호 작용을 통해. 종종 상호 작용 특정 단백질 도메인을 통해 발생 하 고 효소의 활성화에 결과. 단백질 사이 상호 작용을 공부 하는 여러 방법이 있다. 공동-immunoprecipitation은 일반적으로 단백질 단백질 상호 작용에 필요한 도메인을 공부 하는 데 사용 됩니다, 있다 아무 분석 문서를 동시에 모집된 효소의 활동에 특정 도메인의 기여. 따라서 여기 설명 하는 방법을 결합 단백질과 관련된 효소 활성화 사이 상호 작용의 동시 평가 구슬 효소 활동 분석 결과 공동 immunoprecipitation. 이 프로토콜의 목표 단백질 및 효소와 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무는 도메인 간의 실제 상호 작용에 대 한 중요 한 도메인을 식별 하는 것입니다. 이 분석 결과의 중요성을 설명, 특정 수용 체로 단백질 도메인에 기여할 효소, 수용 체의 세포질 꼬리의 바인딩 다른 도메인은 동일한 효소의 기능을 조절 하는 데 필요한.

서문

촉매 수용 체와 수용 체 티로신 kinases는 막 횡단 단백질에 extracellular ligand의 바인딩 세포내 측면¹에 효소 활동을 하면. 다른 kinases와 그들의 세포질 꼬리를 가수분해 등 특정 효소를 모집 하는 동안 일부 수용 체 수용 체 및 효소 기능 보유. 수용 체의 꼬리를이 효소의 촉매 조치는 효소의 채용은 항상 동일한 단백질 도메인²에 의해 통제 되지 않는 두 개의 별도 프로세스. 불행 하 게도, 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 평가 하기 위해 특정 도구가 있다. 여기에 설명 된 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 정품 인증에서 수용 체의 꼬리에는 효소의 채용을 해 부하는 유용한 방법입니다. 이 분석 결과 항 체 코팅 구슬에 의해 태그 수용 체의 immunoprecipitation를 사용합니다. 그 후, 효소 활동 분석 결과 구슬에 서쪽 오 점 분석 수행 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 단백질 도메인은 수용 체와 효소 (서쪽 오 점 분석에 의해 평가) 간의 상호 작용에 필요한 폭로 이며 도메인 (구슬에 의해 측정 하는 효소의 완전 한 활성화에 대 한 의무 효소 활동 분석 결과)입니다. 그것은 인간의 질병의 병 인에서 그들의 개입으로 인해 수용 체 관련 된 효소의 기능을 별도 공부를 위한 도구를 개발 하는 중요 한. 또한, 추가이 단백질의 행동의 메커니즘을 이해 하는 것은 소설 치료 개입의 디자인을 도울 수 있다.

프로그램 된 죽음-1 (PD-1) T 세포의 표면에는 금지 수용 체 이며, 과도 한 T 세포 응답을 제한 하는 데 필요한. 최근 몇 년 동안에서 안티-PD-1 항 체 여러 악성^1,2의 치료에 연루 되었습니다. PD 1 결 찰 확산, 접착, 및 여러 cytokines^3,,45의 분 비를 포함 하 여 다양 한 T 세포 기능을 멈출. PD 1은 면역학 시 냅 스, 그것은 T 세포 수용 체 (TCR)⁷colocalizes T 세포와 항 원 제시 세포⁶, 사이의 인터페이스를 지역화 됩니다. 그 후,는 티로신 인산 가수분해 효소 SHP2 [Src 상 동 2 (SH2) 도메인 티로신 인산 가수분해 효소 2] PD-1, 인접 복잡 한 TCR 및 그것의 관련 된 키 티로신 잔류물의 dephosphorylation로 이어지는 세포질 꼬리를 모집 신호 분자^3,,45,,89. PD 1의 세포질 꼬리 두 티로신 모티프는 immunoreceptor 티로신 근거한 금지 주제 (ITIM), 및 immunoreceptor 티로신 기반 스위치 모티브 (ITSM)¹⁰에 포함 되어 있습니다. 두 모티프는 PD 1 결 찰^9,10시 phosphorylated는. Mutagenesis 연구 SHP2 PD-1 신호 및 기능에 있는 그의 역할은 분명 ITIM 반대로 모집⁴ITSM에 대 한 기본 역할을 계시 했다.

SHP2 중 하나는 닫힌 (접혀) 채택, 구조 또는 오픈 (확장), 활성 구조¹¹저해. SHP2 바인딩 또는 활성화 PD 1의 각 꼬리 도메인의 기여는 아직 해명 하지. 이 질문에 대답, 우리는 PD-1와 그것의 활동¹²의 꼬리에 SHP2의 채용의 병렬 테스트 수 있도록 분석 결과 개발 했다. 우리는 공동-immunoprecipitation와 동시에 상호 작용 및 효소 활동을 테스트 하는 구슬에 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 고용. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 PD 1의 ITSM PD 1의 ITIM 완벽 하 게 확장 하 고 효소를 활성화 하는 데 필요한 동안 PD-1, 꼬리 SHP2 모집 충분 한지 보여줍니다.

여러 인접 한 도메인 그들의 세포질 꼬리에 있는 많은 수용 체가 있다. 기능 공동-immunoprecipitation 분석 결과 단백질 모집 또는 효소 활성화에 필요한 특정 도메인의 역할을 파악할 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 세포의 transfection

1. 씨앗 HEK 293T 세포도 12 10 cm 접시 (접시 당 5 x 10⁶ 세포)는 전날 transfection (그림 1). 세포는 hemocytometer를 사용 하 여 계산을 수행 합니다. 각 접시에 대 한 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 DMEM의 10 mL을 사용 합니다. 5% CO₂에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
2. 셀은 80-90% 합칠, 일단 transfect 5 HEK 293T 격판덮개 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여 다음 플라스 미드 중 하나: SHP2을 표현 하는 벡터, PD 1 GFP 표현 벡터 [PD 1의 야생 유형 (WT) 버전], ITIM 돌연변이 버전 (Y223F )의 PD 1 GFP 표현 벡터와는 ITSM 돌연변이 (Y248F)의 버전 PD 1 GFP 표현 벡터 (그림 1).
   참고: 두 접시 WT PD-1-GFP-표현 벡터와 페 될 것입니다. 한 추가 판 비 페 셀 컨트롤 (그림 1) 될 것입니다.
3. 10 cm 번호판에 부착 세포에 대 한 제조 업체의 프로토콜에 의하여 transfection를 수행 합니다.
   참고: PD 1의 돌연변이 버전에 각 주제에 티로신 (Y) phosphorylated 수 없습니다 페닐알라닌 (F)에 의해 대체 되었다.
4. 5 접시와 immunoprecipitation (그림 1) 전에 표현한 단백질 금액 [입력; 일컬어 전체 세포 lysate (WCL)]의 측정에 대 한 비 페 제어로 봉사 한 추가 접시의 두 번째 동일 집합 transfect
5. 37 ° C에서 48 h, 5% CO₂ 조직 문화 인큐베이터에서 transfected 세포를 품 어.
   참고: 해당 transfection 성공적으로 발생 되도록 GFP 식 형광 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다.

2. 추진 Transfected 세포 인 산화

1. 부 화, 다음 30% H₂O₂의 50 µ L와 신선한 pervanadate (100 m m 재고)에서 나트륨-orthovanadate의 50 µ L를 혼합 하 여 준비 합니다.
   참고: 혼합 노란 색으로 변경 해야 합니다. Pervanadate는 티로신 잔류물¹³의 인 산화를 촉진 하는 세포 투과성 인산 가수분해 효소 억제 물. 이 분석 결과에서 튼튼하게 PD 1의 꼬리의 인 산화를 유도 하기 위해 사용 됩니다.
2. PD 1의 태그 버전 phosphorylate PD 1 GFP transfected 세포에서 미디어를 제거 하 고 각 10 cm 접시 (8 접시 표현 결과 10 µ L pervanadate (2.1 단계)의 함께 (하지 않고 혈 청 또는 항생제) 일반 DMEM의 10 mL를 추가 PD 1의 다른 버전) (그림 1). 15 분 동안 어둠 속에서 실 온에서 접시를 놓습니다.
   참고: SHP2 페 셀 (2 개의 격판덮개; 그림 1) 그리고 이후이 번호판 활성 SHP2 효소에 대 한 소스로 사용할 것입니다 두 비 페 제어 접시 pervanadate와 함께 처리 되지 않습니다.
3. 얼음 처럼 차가운 1 x PBS의 5 mL로 세포 세척. 이 단계를 두 번 반복 합니다.

3입니다. Immunoprecipitation

참고: 다음 단계 수행 해야 또는 얼음에 4 ° c.에

1. 세포의 용 해 버퍼 (50 m m Tris HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, 0.1 %NP-40, 2 mM EDTA, 10% 글리세롤) protease 억제제 (세포의 용 해 버퍼의 10 mL에 녹 1 태블릿)와 1mm 나트륨 orthovanadate 보충. 셀에 500 µ L의 얼음 세포의 용 해 버퍼를 추가 및 제거 하 고 즉시 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개에서 세포를 수집.
   참고: 그것은 SHP2 페 접시와 비 페 컨트롤 플레이트 인산 가수분해 효소 활동을 유지 해야 하므로 PD 1 GFP 페 번호판에 대 한 사용할 수 세포의 용 해 버퍼에만 나트륨 orthovanadate를 추가 하는 것이 중요.
2. 1.5 mL 찬 튜브는 lysates 전송 및 0.005 x g, 30 분 동안 4 ° C에서 그들을 회전.
3. lysates에서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집, 4 ° C에서 10000 x g 에서 10 분 동안 lysates 아래로 회전 하 고는 supernatants 새로운 튜브로 전송 합니다. 펠 릿을 삭제 합니다. 6 판 (그림 1)의 두 번째 세트의 supernatants 나중 WCL 분석을 위한 얼음에 저장 합니다.
4. 첫 번째의 PD 1 GFP 페 lysates에서 PD-1-GFP의 immunoprecipitation에 대 한 안티-GFP 구슬의 준비 (4 판) 설정 (그림 1).
   1. 구슬의 침전을 방지 하기 위해 부드럽게 열기 전에 구슬 가진 병을 흔들어. 각 조건 마다 슬러리에서 안티-GFP 구슬의 40 µ L을 제거 합니다.
   2. 4 ° C에서 3 분 동안 500 x g 에서 회전 시키십시오 고 구슬 씻고 상쾌한을 제거 합니다.
      참고: 플라스틱 피 펫 팁 및 손실을 방지 하기 위해 agarose 구슬 사이의 접촉을 최소화 하기 위해 중요 하다. 다른 튜브에 비즈를 전송 하기 전에 200 µ L 팁의 가장자리를 잘라 하는 것이 좋습니다.
   3. (샘플) 당 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L에 구슬 resuspend.
5. 씻어 구슬 lysate 셀에 직접 (PNS) 첫 번째 세트 (4 판)의 PD 1 GFP 표현 세포에서 추가 (단계 3.3). GFP 태그 immunoprecipitate 단백질에 4 ° C에서 30 분 동안 0.005 x g 에서 회전 합니다.
6. 워시 (orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL와 구슬 3 번. 2500 x g 10에서 튜브 원심 s.
   참고: 구슬에 세포의 용 해 버퍼를 추가 하는 경우 추가 구슬에 직접 팁 그들을 건드리지 않고. 아래로 세척 동안 플라스틱 필요가 있다.
7. 똑같이 lysate 첫 세트 (한 접시; 단계 3.3)에서 활성 SHP2의 분할 하 고 씻어 PD 1 GFP 함유 구슬 (WT PD-1-GFP와 두 개의 서로 다른 phosphdeficient 돌연변이, Y223F 및 Y248F)의 3 관에 그것을 추가. 비 transfected 세포 lysate에서 WT PD-1-GFP 구슬의 두 번째 튜브에는 볼륨의 1 / 3를 추가 합니다. 나머지 2/3를 삭제 합니다.
8. 부드러운 회전 (0.005 x g) 4 ° C에서 4 h 구슬을 품 어.
9. 3.6 단계에서 보고 된 구슬 (pervanadate 또는 orthovanadate) 없이 차가운 세포의 용 해 버퍼의 1 mL로 두 번 세척.
10. 80 µ L의 샘플 확인 각 관에서 총 볼륨 100 µ L (구슬의 20 µ L) 및 세포의 용 해 버퍼의 80 µ L 당 (하지 않고 pervanadate 또는 orthovanadate) 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 두 개의 신선한 1.5 mL 튜브 각 튜브에서 50 µ L를 전송.
    참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 구슬 및 세포의 용 해 버퍼를 포함 하는 혼합물으로 채워진 2 개의 관: 1 개의 관 서쪽 blotting에 의해 co immunoprecipitated SHP2를 테스트 하는 데 사용 됩니다 및 두 번째 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과 대 한 사용 됩니다.

4. 인산 가수분해 효소 활동 분석 결과

1. 구슬 인산 가수분해 효소 워시 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4와 120 m m NaCl)로 한 번 씻는 다. 상쾌한을 완전히 제거 합니다.
2. 구슬를 분석 결과 버퍼 (30mm Hepes pH 7.4, 120 m m NaCl, 5mm DTT, 10 m m p-nitrophenylphosphate)의 100 µ L을 추가 하 고 부드러운 동요에서 30 분 동안 30 ° C에서 품 어. 참고: 보육 시간 다 수 있지만 버퍼 dephosphorylation 시 노란색으로 될 때까지 기다립니다.
3. 반응 종료 때 버퍼 노란색 1 M NaOH의 50 µ L를 추가 합니다.
4. 2500 x g 10 s 및 전송 50 µ L의 절반 영역의 두 웰 스 (잘 당 50 µ L와 중복) 상쾌한에 스핀 다운 96 잘 접시에. 405에서 흡 광도 읽고 nm.
5. PD-1-GFP의 제어 야생-타입 버전 상대 광학 밀도 (OD)로 결과 표현 한다.

5. SHP2 서쪽 오 점 분석

1. 구슬 아래로 회전 시키십시오 그리고 제거는 상쾌한.
2. 2 x Laemmli 버퍼의 20 µ L 추가 ( 자료 표참조) 구슬 및 5 분 동안 95 ° C에 종 기.
3. 입력의 단백질 농도 측정 컨트롤 (2) 사용 하 여 설정를 BCA 키트 ( 자료 표참조). 새로운 튜브에 가장 희석된 샘플의 30 µ L를 전송. 입력된 컨트롤과 가장 희석된 샘플으로 동일한 농도에 세포의 용 해 버퍼의 나머지 부분을 희석 하 고 그들의 각각에서 새로운 튜브 30 µ L를 전송.
   참고:이 단계에 따라 있을 것입니다 30 µ L 각각 4 튜브 비슷한 단백질 농도에서 lysates 제어 입력을 나타내는.
4. 동등한 lysates와 95 ° C 5 분 스핀에서 종 2 x Laemmli 버퍼의 구슬 아래로 볼륨과 4-20 %SDS 페이지 트리 기반 젤에 상쾌한 로드 추가 ( 자료 표참조) 서 부에 대 한 분석 오 점. 또한, 두 번째 집합의 각 샘플에서 50 µ L를 로드 합니다.
5. 서쪽 오 점 분석 프로토콜에 따라 이전¹²설명 계속.

결과

기여의 ITSM의 PD-1 SHP2 바인딩을 설정 하는 동안 PD 1의 ITIM의 역할은 보다 적게 명확 하다. SHP2 두 SH2 도메인 PD-1 (한 티로신은 ITSM에서)와 다른은 ITIM 두 순차 phosphotyrosines 바인딩할 수 있기 때문에, 우리는 PD 1의 ITIM 안정화 여 SHP2 활동을 용이 하 게 하는 동안 PD 1의 ITSM PD-1, SHP2를 앵커 가설의 구조적 상태^11,14을 엽니다. 이 테스트 하...

토론

수용 체-효소의 상호 작용은 세포내 시그널링을 위한 중요 한. 많은 효소 SH2 도메인 동일한 수용 체의 꼬리를 장식 phosphorylated tyrosines에 바인딩 통해 수용 체에 채용 됩니다. 그러나, 효소는 종종 닫힌된 비활성 conformations 통합 하며 활성화 다른 도메인의 동일한 수용 체에 의해 중재 될 수 있는 구조적 변경¹¹ . 분석 결과 설명 여기 측정 이러한 상호 작용에 의해 유도 된 활동 뿐 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Lonza	17-516F	Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H	Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin	Fisher	BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine	Lonza	BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti–GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001	EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC2676	Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-well
Nitrocellulose membranes	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium chloride
HEPES	Gibco	15630080	N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT	Invitrogen	D1532	Dithiothreitol
pNPP	Sigma	20-106	p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH	Sigma	S8045	Sodium hydroxide
BCA	Fisher	23225	Bi Cinchoninic Acid assay