Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per studiare simultaneamente il contributo di domini proteici specifici dei recettori di membrana plasmatica sia reclutamento degli enzimi e l'attività dell'enzima.

Abstract

Associata al recettore gli enzimi sono i principali mediatori di attivazione cellulare. Questi enzimi sono regolati, almeno in parte, da interazioni fisiche con le code citoplasmatiche dei recettori. Le interazioni si verificano attraverso domini proteici specifici spesso e provocare l'attivazione degli enzimi. Ci sono diversi metodi per studiare le interazioni tra proteine. Mentre co-immunoprecipitazione è comunemente utilizzato per lo studio di domini che sono necessari per le interazioni proteina-proteina, non ci sono nessun test che documentano il contributo di domini specifici all'attività degli enzimi reclutati allo stesso tempo. Di conseguenza, il metodo qui descritto combina co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per valutazione simultanea delle interazioni tra proteine e attivazione enzimatica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare i domini che sono critici per interazioni fisiche tra una proteina ed enzima e i domini che sono obbligatori per completare l'attivazione dell'enzima. L'importanza di questo test è dimostrata, come determinato ricevitore domini proteici contribuiscono all'associazione dell'enzima per la coda citoplasmatica del recettore, mentre altri domini sono necessari per regolare la funzione dell'enzima stesso.

Introduzione

Recettori catalitici e recettori tirosin chinasici sono proteine transmembrana, in cui il legame di un ligando extracellulare causa attività enzimatica sul lato intracellulare¹. Alcuni recettori possiedono recettori sia funzioni enzimatiche, mentre gli altri recluta enzimi specifici come chinasi e fosfatasi a loro code citoplasmatiche. Assunzione di un enzima alla coda del recettore e la conseguente azione catalitica di questo enzima sono due processi separati che non sono sempre disciplinati dalla stessa proteina domini². Purtroppo, non ci sono nessun strumenti specifici per valutare l'interazione e l'attività enzimatica simultaneamente. L'analisi di co-immunoprecipitazione funzionale descritto qui è un metodo utile per sezionare il reclutamento di un enzima per la coda di un recettore dalla sua attivazione. Questo test utilizza immunoprecipitazione dei recettori contrassegnati da perline rivestite con anticorpo. Successivamente, vengono eseguite un'analisi di attività enzimatica e l'analisi western blot su perline. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di scoprire quali domini di proteine sono necessari per le interazioni tra recettori e gli enzimi (valutati mediante analisi western blot) e quali domini sono obbligatori per completare l'attivazione degli enzimi (misurato con il tallone analisi di attività enzimatica). È significativo a sviluppare strumenti per studiare le funzioni separate di enzimi associata al recettore a causa del loro coinvolgimento nella patogenesi delle malattie umane. Inoltre, l'ulteriore comprensione dei meccanismi di azione di queste proteine può aiutare la progettazione di nuovi interventi terapeutici.

Morte programmata-1 (PD-1) è un recettore inibitorio sulla superficie delle cellule T ed è necessaria per limitare le risposte delle cellule T eccessivo. Negli ultimi anni, gli anticorpi anti-PD-1 sono stati implicati nel trattamento di tumori maligni multipli^1,2. PD-1 legatura trattiene numerose funzioni a cellula T, tra cui la proliferazione, l'adesione e la secrezione di più citochine^3,4,5. PD-1 è localizzato alla sinapsi immunologica, l'interfaccia tra le cellule T e cellule presentanti l'antigene⁶, dove esso colocalizza con il recettore delle cellule T (TCR)⁷. Successivamente, la tirosina fosfatasi SHP2 [Src homology 2 (SH2) dominio contenente tirosina fosfatasi 2] viene reclutato per la coda citoplasmatica di PD-1, che conduce alla defosforilazione di residui di tirosina chiave all'interno del complesso TCR e suoi associati prossimale segnalazione molecole^3,4,5,8,9. La coda citoplasmatica di PD-1 contiene due motivi di tirosina, un immunorecettore basati su tirosina inibitori motivo (ITIM) e un immunorecettore tirosina motivo basato-interruttore (ITSM)¹⁰. Entrambi motivi vengono fosforilate su PD-1 legatura^9,10. Studi di mutagenesi hanno rivelato un ruolo primario per l'ITSM SHP2 reclutamento, in contrasto con il ITIM, il cui ruolo nella segnalazione di PD-1 e la funzione non è chiaro⁴.

SHP2 adotta sia un chiuso (piegato), ha inibito la conformazione o un open (esteso), conformazione attiva¹¹. Il contributo di ciascun dominio di coda di PD-1 SHP2 associazione o l'attivazione non è stata ancora chiarito. Per rispondere a questa domanda, abbiamo sviluppato un test che consente il test parallelo del reclutamento di SHP2 alla coda del PD-1 e sua attivit๲. Abbiamo impiegato co-immunoprecipitazione e un'analisi di attività della fosfatasi sul tallone per testare l'interazione e l'attività enzimatica in parallelo. Usando questa analisi, indichiamo che l'ITSM di PD-1 è sufficiente per reclutare SHP2 alla coda del PD-1, mentre il ITIM di PD-1 è necessario per estendere completamente e attivare l'enzima.

Ci sono molti recettori che hanno diversi domini adiacenti in loro code citoplasmatiche. Il test funzionale di co-immunoprecipitazione può scoprire il ruolo di specifici domini che sono necessari per l'attivazione enzimatica o di assunzione di proteine.

Protocollo

1. transfezione delle celle

1. Le cellule HEK 293T del seme in dodici piatti da 10 cm (5 x 10⁶ cellule per piastra) il giorno prima di transfezione (Figura 1). Eseguire il conteggio delle cellule usando un emocitometro. Per ogni piastra, utilizzare 10 mL di DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO₂.
2. Una volta che le cellule sono 80-90% confluenti, transfect 5 piastre HEK 293T utilizzando un reagente di transfezione basata sui lipidi con uno dei seguenti plasmidi: un vettore che esprime SHP2, un vettore di PD-1-GFP-esprimendo [una versione di wild type (WT) di PD-1], una versione ITIM-mutato (Y223F ) di un vettore PD-1-GFP-espressione e una versione di ITSM-mutato (Y248F) di un vettore PD-1--espressione della GFP (Figura 1).
   Nota: Due piastre saranno trasfettate con il vettore WT PD-1--espressione della GFP. Una piastra supplementare servirà come un controllo di cellule non trasfettate (Figura 1).
3. Eseguire la transfezione secondo il protocollo del produttore per le celle aderenti nelle piastre di 10 cm.
   Nota: Nelle versioni mutate di PD-1, la tirosina (Y) in ogni motivo è stata sostituita da fenilalanina (F) che non può essere fosforilata.
4. Transfect una seconda serie identica di cinque piastre e una piastra supplementare che serve come controllo non trasfettate per la misurazione della quantità di proteina espressa [ingresso; anche conosciuto come lisato cellulare intero (WCL)] prima di immunoprecipitazione (Figura 1).
5. Incubare le cellule trasfettate per 48 h a 37 ° C, 5% CO₂ in un incubatore di coltura del tessuto.
   Nota: Per garantire che la transfezione con successo si è verificato, esaminare le cellule per espressione di GFP utilizzando un microscopio a fluorescenza.

2. promuovere la fosforilazione in cellule trasfettate

1. A seguito di incubazione, preparare fresco pervanadate mescolando 50 µ l di sodio-orthovanadate (da stock di 100 mM) con 50 µ l di 30% H₂O₂.
   Nota: La miscela dovrebbe cambiare in un colore giallastro. Pervanadate è un inibitore della fosfatasi cellula-permeabile che promuove la fosforilazione della tirosina residui¹³. In questa analisi, serve per robustamente indurre fosforilazione delle code di PD-1.
2. Per fosforilare le versioni con tag di PD-1, rimuovere il supporto dalle cellule trasfettate PD-1-GFP e aggiungere 10 mL di pianura DMEM (senza siero o antibiotici) insieme a 10 µ l di pervanadate (punto 2.1) per ogni piatto di 10 cm (con conseguente otto piastre esprimendo diverse versioni di PD-1) (Figura 1). Posizionare le piastre a temperatura ambiente al buio per 15 min.
   Nota: Cellule trasfettate con SHP2 (due piastre; Figura 1) e le due piastre di controllo non-transfettate non sono trattate con pervanadate, poiché queste piastre servirà come fonte per l'enzima SHP2 attivo.
3. Lavare le cellule con 5 mL di PBS 1X ghiacciata. Ripetere questo passaggio due volte.

3. immunoprecipitazione

Nota: La procedura seguente deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 ° C.

1. Il buffer di lisi (50 mM Tris-HCl a pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2mm EDTA, 10% glicerolo) con inibitori delle proteasi (sciogliere 1 compressa in 10 mL di tampone di lisi) e con 1 mM sodio ortovanadato di supplemento. Aggiungere 500 µ l di tampone di lisi ghiacciata alle cellule e rimuovere e raccogliere le cellule dalle piastre immediatamente utilizzando un raschietto di cella.
   Nota: È importante aggiungere il sodio ortovanadato solo per il buffer di lisi che verrà utilizzato per le piastre PD-1-GFP-transfected, poiché il SHP2-transfettate piastre e placche di comando non trasfettate devono conservare l'attività della fosfatasi.
2. Trasferire i lisati in provette da 1,5 mL freddo e ruotarle a 0,005 x g, 4 ° C per 30 min.
3. Per raccogliere i nuclei post surnatante (PNS) dai lisati, rotazione verso il basso i lisati per 10 min a 10.000 x g a 4 ° C e trasferire i surnatanti in nuovi tubi. Scartare il pellet. Memorizzare i surnatanti del secondo set di sei piatti (Figura 1) sul ghiaccio per un'analisi successiva di WCL.
4. Preparazione delle perle anti-GFP per immunoprecipitazione di PD-1-GFP dai lisati PD-1-GFP-transfected del primo set (quattro piatti) (Figura 1).
   1. Per evitare la sedimentazione dei branelli, agitare delicatamente la bottiglia con i branelli prima dell'apertura. Rimuovere 40 µ l di perline anti-GFP dai liquami per ogni condizione.
   2. Spin a 500 x g per 3 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante per lavare le perle.
      Nota: È importante per ridurre al minimo il contatto tra i puntali in plastica e perle di agarosio per prevenire la perdita. Si consiglia di tagliare il bordo di una punta di 200 µ l prima di trasferire le perle in un'altra provetta.
   3. Risospendere le sfere in 80 µ l di tampone di lisi (per esempio).
5. Aggiungere le perline lavate direttamente alla cella lysata (PNS) dalle cellule PD-1-GFP-espressione del primo set (quattro piastre) (punto 3.3). Ruotare a 0,005 x g per 30 min a 4 ° C a immunoprecipitate GFP-etichettato proteine.
6. Lavare le perline con 1 mL di tampone di lisi fredda (senza orthovanadate) 3 volte. Centrifugare la provetta a 2.500 x g per 10 s.
   Nota: Quando si aggiunge il tampone di lisi per le perline, aggiungerlo direttamente le perline senza toccarli con le punte. Non c'è nessun bisogno di dispensare su e giù durante i lavaggi.
7. Ugualmente dividere il lisato del SHP2 attivo dal primo set (una piastra; passo 3.3) e aggiungerlo a tre tubi di perline PD-1-GFP-contenente lavate (WT PD-1-GFP e le due mutazioni differenti phosphdeficient, Y223F e Y248F). Aggiungere un terzo del volume dal lysate delle cellule non trasfettate per il secondo tubo di perline WT PD-1-GFP. Scartare i rimanenti due terzi.
8. Incubare le perline per 4 h a 4 ° C con una delicata rotazione (0,005 x g).
9. Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi fredda (senza pervanadate o orthovanadate), come riportati al punto 3.6.
10. Aggiungere 80 µ l di tampone di lisi (senza pervanadate o orthovanadate) per esempio garantendo che il volume totale in ciascun tubo è µ l 100 (20 µ l di perline) e 80 µ l di tampone di lisi. Mescolare delicatamente e trasferire 50 µ l da ciascuna provetta in due tubi di fresco 1,5 mL.
    Nota: A seguito di questo passaggio, ci saranno due tubi riempiti con una miscela contenente perline e tampone di lisi: un tubo verrà utilizzato per il test la co-immunoprecipitate SHP2 mediante western blotting, e il secondo verrà utilizzato per l'analisi di attività della fosfatasi.

4. analisi di attività di fosfatasi

1. Lavare le perle una volta con tampone di lavaggio della fosfatasi (30 mM Hepes pH 7.4 e 120 mM NaCl). Rimuovere completamente il surnatante.
2. Aggiungere 100 µ l di tampone di dosaggio (30 mM Hepes pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) ai talloni e incubare a 30 ° C per 30 minuti sotto agitazione delicata. Nota: Tempo di incubazione può variare, ma di attendere fino a quando il buffer diventa giallo su defosforilazione.
3. Per terminare la reazione, aggiungere 50 µ l di NaOH M 1 quando il buffer diventa giallo.
4. Rotazione verso il basso a 2.500 x g per 10 s e trasferimento 50 µ l del surnatante due pozzetti (duplicati con 50 µ l per pozzetto) di metà-zona in una piastra a 96 pozzetti. Leggere l'assorbanza a 405 nm.
5. Esprimere i risultati come relativa densità ottica (OD) rispetto alla versione di selvaggio-tipo di controllo di PD-1-GFP.

5. SHP2 Analisi Western Blot

1. Rotazione verso il basso le perline e rimuovere il surnatante.
2. Aggiungere 20 µ l di tampone di x Laemmli 2 (Vedi Materiali tavolo) per le perline e bollire a 95 ° C per 5 min.
3. Misurare la concentrazione di proteina dell'input controlli (in secondo luogo impostare) utilizzando un BCA kit (Vedi Materiali tavolo). Trasferire 30 µ l del campione più diluito ad un nuovo tubo. Diluire il resto dei controlli di input con tampone di lisi per la stessa concentrazione come il campione più diluito e trasferire 30 µ l di ciascuna di esse ad un nuovo tubo.
   Nota: A seguito di questo passaggio, ci saranno 4 tubi con 30 µ l ciascuna, alle simili concentrazioni di proteina, che rappresenta l'input controlli lisati.
4. Aggiungere volumi uguali di 2 x Laemmli buffer per i lisati e fate bollire a 95 ° C per 5 min, Spin giù le perline e caricare il surnatante 4 – 20% gel di SDS-PAGE Tris (Vedi Materiali tavolo) per western blot analisi. Inoltre, è possibile caricare 50 µ l di ogni campione del secondo set.
5. Continuare l'analisi western blot secondo il protocollo descritto in precedenza¹².

Risultati

Mentre il contributo di ITSM di PD-1 a SHP2 associazione è stabilito, il ruolo della ITIM di PD-1 è meno chiaro. Perché SHP2 ha due domini SH2 che possono legarsi a due fosfotirosine sequenziale su PD-1 (una tirosina nell'ITSM) e un altro in ITIM, abbiamo supposto che l'ITSM di PD-1 ancore SHP2 e PD-1, mentre il ITIM di PD-1 facilita l'attività SHP2 stabilizzando la aprire stato conformazionale^11,14. Per eseguire questo test, ...

Discussione

Interazioni del ricevitore-enzima sono cruciali per segnalazione intracellulare. Molti enzimi sono reclutati ai ricevitori attraverso domini SH2 associazione a tirosine fosforilate che decorano le code degli stessi recettori. Tuttavia, gli enzimi sono spesso piegati in conformazioni inattive chiuse e attivazione richiede un cambiamento conformazionale¹¹ che può essere mediato da altri domini del recettore stesso. Il test descritto qui misure le interazioni tra recettori e gli enzimi come pure l'a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Lonza	17-516F	Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge	Eppendorf	5424-R	1.5 ml
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H	Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin	Fisher	BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine	Lonza	BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti–GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001	EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)	Invitrogen	LC2676	Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-well
Nitrocellulose membranes	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium chloride
HEPES	Gibco	15630080	N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT	Invitrogen	D1532	Dithiothreitol
pNPP	Sigma	20-106	p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH	Sigma	S8045	Sodium hydroxide
BCA	Fisher	23225	Bi Cinchoninic Acid assay