Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.

Zusammenfassung

Rezeptor-assoziierten Enzyme sind die wichtigsten Vermittler der zellulären Aktivierung. Diese Enzyme sind mindestens im Teil, durch die physikalischen Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Schwänzen der Rezeptoren geregelt. Die Interaktionen oft durch spezifisches Protein Domänen auftreten und Aktivierung der Enzyme führen. Es gibt mehrere Methoden, um Interaktionen zwischen Proteinen zu untersuchen. Während co-Immunopräzipitation häufig verwendet, um Domänen zu studieren, die für Protein-Protein-Wechselwirkungen erforderlich sind, gibt es keine Tests dieses Dokument den Beitrag von bestimmten Domänen zur Aktivität der rekrutierten Enzyme zur gleichen Zeit. Die hier beschriebene Methode kombiniert dementsprechend co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle-Assay für simultane Auswertung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und damit verbundenen enzymatische Aktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist, die Domains zu identifizieren, die sind entscheidend für die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Protein und Enzym und Domänen, die für die vollständige Aktivierung des Enzyms obligatorisch sind. Die Bedeutung des Assays gezeigt, als bestimmten Rezeptor Protein Domänen dazu beitragen, die Bindung des Enzyms der cytoplasmatischen Schwanz des Rezeptors, während andere Bereiche sind notwendig, um die Funktion des gleichen Enzyms zu regulieren.

Einleitung

Katalytische Rezeptoren und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen sind transmembrane Proteine in die Bindung eines extrazellulären Liganden enzymatische Aktivität auf die intrazelluläre Seite¹verursacht. Einige Rezeptoren besitzen Rezeptor und enzymatische Funktionen, während andere spezifische Enzyme wie Kinasen und Phosphatasen zu ihre cytoplasmatischen Tails zu rekrutieren. Rekrutierung eines Enzyms an den Rezeptor Tail und die anschließende katalytische Wirkung dieses Enzyms sind zwei separate Prozesse, die nicht immer von der gleichen Protein Domänen²geregelt sind. Leider gibt es keine spezifische Werkzeuge, um das Zusammenspiel und die enzymatische Aktivität gleichzeitig zu beurteilen. Hier beschriebenen funktionellen co-Immunopräzipitation-Assay ist eine nützliche Methode, um die Rekrutierung eines Enzyms am Schwanz eines Rezeptors aus seiner Aktivierung zu sezieren. Dieser Assay nutzt Immunopräzipitation tagged Rezeptoren durch Antikörper-beschichtete Perlen. Anschließend erfolgt eine enzymatische Aktivität Assay und western-Blot-Analyse auf Perlen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist zu entdecken, welche Protein-Domains für Interaktionen zwischen Rezeptoren und Enzymen (bewertet von western-Blot Analyse) notwendig sind und welche Domains sind verbindlich für die vollständige Aktivierung der Enzyme (gemessen am Wulst enzymatische Aktivität Assay). Es ist bezeichnend, Werkzeuge für das Studium der getrennten Funktionen der Rezeptor-assoziierten Enzyme aufgrund ihrer Beteiligung an der Pathogenese von Krankheiten des Menschen zu entwickeln. Weitere Verständnis der Wirkmechanismen dieser Proteine kann darüber hinaus die Gestaltung der neue therapeutische Interventionen helfen.

Programmierten Tod-1 (PD-1) ist eine inhibitorische Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen und ist erforderlich für die Begrenzung der übermäßige T-Zell-Reaktionen. In den letzten Jahren haben Anti-PD-1 Antikörper bei der Behandlung von mehreren Malignome^1,2verwickelt. PD-1 Ligatur hemmt zahlreiche T-Zell-Funktionen, einschließlich der Proliferation, Haftung und Sekretion von mehrere Zytokine^3,4,5. PD-1 ist auf der immunologischen Synapse, die Schnittstelle zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen⁶, lokalisiert, wo es mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR)⁷colocalizes. Anschließend die Tyrosin-Phosphatase SHP2 [Src Homologie 2 (SH2) Domäne mit Tyrosin Phosphatase 2] wird der cytoplasmatischen Schwanz des PD-1, führt zu wichtigen Tyrosin Rückstände innerhalb der TCR komplex und die damit verbundenen proximalen dephosphorylation rekrutiert Signalisierung Moleküle^3,4,5,8,9. Die zytoplasmatischen Schweif von PD-1 enthält zwei Tyrosin Motive, ein Immunoreceptor Tyrosin-basierte hemmenden Motiv (ITIM) und eine Immunoreceptor Tyrosin basierend-Schalter Motiv (ITSM)¹⁰. Beide Motive sind auf PD-1 Ligatur^9,10phosphoryliert. Mutagenese Studien ergaben eine primäre Rolle für die ITSM im SHP2 Einstellung, im Gegensatz zu den ITIM, deren Rolle in der PD-1 Signal- und Funktion nicht klar ist⁴.

SHP2 nimmt entweder eine geschlossene (gefaltet), Konformation oder eine offene (verlängert), aktive Konformation¹¹gehemmt. Der Beitrag der jeweiligen Tail-Domäne von PD-1 SHP2 Bindung oder Aktivierung ist noch nicht aufgeklärt. Um diese Frage zu beantworten, haben wir eine Probe, die es ermöglicht parallele Prüfung der Einstellung von SHP2 am Schwanz des PD-1 und seine Aktivität¹²entwickelt. Wir Beschäftigten co-Immunopräzipitation und eine auf Perle Phosphatase Aktivität Assay, das Zusammenspiel und die Enzymaktivität parallel zu testen. Mit Hilfe dieser Assay, zeigen wir, dass die ITSM PD-1 ausreichend ist, um SHP2 am Schwanz des PD-1, während die ITIM PD-1 erforderlich ist, um vollständig zu erweitern und aktivieren das Enzym zu rekrutieren.

Es gibt viele Rezeptoren, die einige angrenzende Gebiete in den zytoplasmatischen Schwänzen haben. Die funktionale co-Immunopräzipitation-Assay kann die Rolle von bestimmten Domänen aufzudecken, die für Protein Rekrutierung oder enzymatische Aktivierung notwendig sind.

Protokoll

1. die Transfektion von Zellen

1. Samen Sie HEK 293T Zellen in zwölf 10 cm Teller (5 x 10⁶ Zellen pro Platte) am Vortag Transfektion (Abbildung 1). Führen Sie die Zellzählung mit einem Hemocytometer. Verwenden Sie für jede Platte 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in 5 % CO₂.
2. Sobald die Zellen 80-90 % Zusammenfluss sind, transfizieren 5 HEK 293T Platten mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens mit einer der folgenden Plasmide: ein SHP2 Ausdruck Vektor, PD-1-GFP-Ausdruck Vektor [ein Wildtyp (WT) Version von PD-1], eine ITIM mutierte Version (Y223F ) ein PD-1-GFP-Ausdruck Vektor und ein ITSM-mutierte Version (Y248F) eines PD 1-GFP-exprimierenden Vektors (Abbildung 1).
   Hinweis: Zwei Platten werden mit der WT PD 1-GFP-exprimierenden Vektor transfected. Eine zusätzliche Platte dient als ein Steuerelement nicht transfizierten Zellen (Abbildung 1).
3. Führen Sie die Transfektion entsprechend des Herstellers Protokoll für adhärente Zellen in 10 cm-Platten.
   Hinweis: In der mutierten Version von PD-1 war die Tyrosin (Y) in jedes Motiv von Phenylalanin (F) ersetzt, die phosphoryliert werden kann nicht.
4. Transfizieren Sie einen zweiten identischen Satz von fünf Platten und einer zusätzlichen Platte dient als ein nicht-transfizierten Steuerelement für die Messung der exprimierten Protein Betrag [Eingang; auch bekannt als ganze Zelle lysate (WVA)] vor der Immunopräzipitation (Abbildung 1).
5. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 48 h bei 37 ° C, 5 % CO₂ in einer Gewebekultur Inkubator.
   Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich aufgetreten ist, überprüfen Sie die Zellen für die GFP Expression mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

2. Förderung der Phosphorylierung in transfizierten Zellen

1. Bereiten Sie nach Inkubation frische Pervanadate durch das Mischen von 50 µL der Natrium-Orthovanadate (ab 100 mM Lager) mit 50 µL 30 % H₂O₂.
   Hinweis: Die Mischung sollte in eine gelbliche Farbe ändern. Pervanadate ist eine Zelle durchlässig Phosphatase-Inhibitor, der Phosphorylierung von Tyrosin Rückstände¹³fördert. In diesem Assay dient es robust Phosphorylierung von den Schwänzen von PD-1 induzieren.
2. Um die tagged Versionen von PD-1 phosphorylieren, entfernen Sie das Medium aus den PD-1-GFP-transfizierten Zellen und 10 mL schlicht DMEM (ohne Serum oder Antibiotika) zusammen mit 10 µL des Pervanadate (Schritt 2.1) auf jede 10 cm Platte (was in acht Platten zum Ausdruck zu bringen verschiedene Versionen von PD-1) (Abbildung 1). Legen Sie die Platten bei Raumtemperatur im Dunkeln für 15 Minuten.
   Hinweis: Die SHP2-transfizierten Zellen (zwei Platten; Abbildung 1) und die beiden Platten nicht transfizierten Kontrolle mit Pervanadate, nicht behandelt werden, da diese Platten als Quelle für das aktive Enzym SHP2 dienen.
3. Waschen Sie die Zellen mit 5 mL eiskaltes 1 X PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.

(3) Immunopräzipitation

Hinweis: Die folgenden Schritte sollten auf Eis oder bei 4 ° c durchgeführt werden

1. Lyse-Puffer (pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1 % NP-40, 2 mM EDTA, 10 % Glycerin, 50 mM Tris-HCl) mit Protease-Inhibitoren (Auflösung 1 Tablette in 10 mL Lyse-Puffer) und mit 1 mM Natrium Orthovanadate zu ergänzen. 500 µL Puffer eiskalte Lyse der Zellen hinzufügen und entfernen und die Zellen von den Platten sofort mit einem Zelle Schaber zu sammeln.
   Hinweis: Es ist wichtig die Natrium-Orthovanadate nur der Lyse-Puffer hinzu, der für die PD-1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird, da die SHP2 transfiziert und Kontrolle nicht transfizierten Platten Phosphatase-Aktivität behalten müssen.
2. Die Lysates in 1,5 mL kalten Rohre übertragen und bei 0,005 X g, 4 ° C für 30 min zu drehen.
3. Um die Post-Kerne überstand (PNS) aus der Lysates zu sammeln, spin-down Lysates für 10 min bei 10.000 X g bei 4 ° C und die Überstände in neue Schläuche zu übertragen. Entsorgen Sie das Pellet. Speichern Sie die Überstände des zweiten Satzes von sechs Platten (Abbildung 1) auf dem Eis für die spätere Analyse der WCL.
4. Vorbereitung der Anti-GFP-Perlen für Immunopräzipitation der PD-1-GLP aus der PD-1-GFP-transfizierten Lysates der ersten festgelegt (vier Platten) (Abbildung 1).
   1. Um zu verhindern, Abrechnung der Perlen, schütteln Sie sanft die Flasche mit den Perlen vor Eröffnung. Entfernen Sie 40 µL Anti-GFP-Perlen aus der Gülle pro jede Bedingung.
   2. Mit 500 X g für 3 min bei 4 ° C drehen Sie, und entfernen Sie den überstand um die Perlen zu waschen.
      Hinweis: Es ist wichtig, den Kontakt zwischen den Kunststoff Pipettenspitzen und Agarose Korne um Datenverlust zu verhindern zu minimieren. Es empfiehlt sich, den Rand einer 200 µL Spitze schneiden bevor Sie die Perlen auf ein anderes Rohr übertragen.
   3. Aufschwemmen der Perlen in 80 µL Lyse Puffer (je Probe).
5. Fügen Sie die gewaschenen Perlen direkt auf die Zelle lysate (PNS) aus den PD 1-GFP-exprimierenden Zellen des ersten Satzes (vier Platten) (Schritt 3.3). Drehen Sie bei 0,005 X g für 30 min bei 4 ° C zu Immunoprecipitate der GFP-markierten Proteinen.
6. Waschen Sie die Perlen mit 1 mL kalte Lyse Puffer (ohne Orthovanadate) 3 Mal. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 2.500 X g für 10 s.
   Hinweis: Wenn Sie die Perlen den Lyse-Puffer hinzufügen, fügen Sie es direkt auf die Perlen ohne sie zu berühren mit den Tipps. Rauf und runter während der Waschgänge pipette entfällt.
7. Ebenso teilen Sie der lysate aktive SHP2 aus dem ersten Satz (eine Platte; Schritt 3.3) und drei Röhren der gewaschenen PD-1-GFP-haltigen Perlen (WT PD-1-GLP und die zwei verschiedenen Phosphdeficient Mutationen, Y223F und Y248F) hinzufügen. Die zweite Röhre des WT PD-1-GFP-Perlen ein Drittel des Volumens aus der lysate nicht transfizierten Zellen hinzufügen. Die restlichen zwei Drittel zu verwerfen.
8. Inkubieren Sie die Perlen für 4 h bei 4 ° C mit sanften Drehung (0,005 X g).
9. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 mL kalte Lyse Puffer (ohne Pervanadate oder Orthovanadate), wie in Schritt 3.6 berichtet.
10. Fügen Sie 80 µL Lyse Puffer (ohne Pervanadate oder Orthovanadate) pro Probe um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen in jedem Röhrchen 100 µL (20 µL Perlen) und 80 µL Lyse Puffer ist. Vorsichtig mischen und 50 µL aus jeder Tube in zwei frischen 1,5 mL Röhrchen zu übertragen.
    Hinweis: Nach diesem Schritt werden zwei Röhren, gefüllt mit einer Mischung, die Perlen und Lyse Puffer enthält: eine Röhre wird durch westliche Beflecken zu Testzwecken die co-Immunoprecipitated-SHP2 verwendet werden, und die zweite für die Phosphatase-Aktivität-Assay verwendet werden.

(4) Phosphatase-Aktivität-Assay

1. Waschen Sie die Perlen einmal mit Phosphatase Waschpuffer (30 mM Hepes bei pH 7,4 und 120 mM NaCl). Den überstand vollständig zu entfernen.
2. Die Perlen 100 µL testpuffer (30 mM Hepes bei pH 7,4, 120 mM NaCl, 5 mM DVB-t, 10 mM p-Nitrophenylphosphate) hinzu, und bei 30 ° C für 30 min unter schonenden rühren inkubieren. Hinweis: Inkubationszeit kann variieren, aber warten Sie, bis der Puffer auf Dephosphorylation gelb.
3. Um die Reaktion zu beenden, fügen Sie 50 µL 1 M NaOH hinzu, wenn der Puffer gelb dargestellt wird.
4. Spin-down bei 2.500 X g für 10 s und Transfer 50 µL des Überstands in zwei Vertiefungen (Duplikate mit 50 µL pro Well) halb-Bereich in eine 96-Well-Platte. Lesen Sie die Absorption bei 405 nm.
5. Drücken Sie die Ergebnisse als relative optische Dichte (OD) über die Steuerung Wildtyp Version von PD-1-GFP.

5. SHP2 Western-Blot Analyse

1. Spin-down der Perlen und den überstand zu entfernen.
2. Fügen Sie 20 µL 2 X Laemmli-Puffer (siehe Materialtabelle) zu den Perlen und bei 95 ° C für 5 min kochen.
3. Messen die Konzentration des Proteins der Eingabe Steuerelemente (zweite Gruppe) mit einem BCA kit (siehe Materialtabelle). Übertragen Sie die meisten verdünnten Probe 30 µL auf einen neuen Schlauch. Den Rest der Eingabesteuerelemente mit Lyse Puffer, um die gleiche Konzentration wie die meisten verdünnten Probe verdünnen und 30 µL von jedem von ihnen zu einem neuen Schlauch übertragen.
   Hinweis: Nach diesem Schritt werden 4 Röhren mit jeweils 30 µL auf ähnliche proteinkonzentrationen repräsentieren die Eingabe Lysates steuert.
4. Gleiche Volumina von 2 X Laemmli Puffer der Lysates und Kochen bei 95 ° C für 5 min. Spin unten die Perlen und laden den überstand auf 4 – 20 % SDS-PAGE-Tris-basierte Gel hinzufügen (siehe Materialtabelle) für Western blot Analyse. Darüber hinaus laden Sie 50 µL von jeder Probe des zweiten Satzes.
5. Continue-western-Blot Analyse gemäß dem Protokoll bereits¹²beschrieben.

Ergebnisse

Der Beitrag von ITSM PD-1 SHP2 Bindung festgelegt ist, ist die Rolle von ITIM PD-1 weniger klar. Da SHP2 zwei SH2-Domänen, die an zwei sequentielle Phosphotyrosines PD-1 (ein Tyrosin in den ITSM) und ein weiteres in der ITIM binden können verfügt, wir vermutet, dass die ITSM PD-1 SHP2 PD-1, Anker während die ITIM PD-1 SHP2 Aktivität durch die Stabilisierung erleichtert der Öffnen Sie conformational Zustand^11,14. Um dies zu t...

Diskussion

Rezeptor-Enzym Interaktionen sind entscheidend für die intrazelluläre Signalisierung. Viele Enzyme werden rekrutiert, an Rezeptoren durch SH2-Domänen binden an phosphorylierten Tyrosines, die Enden von den gleichen Rezeptoren zu schmücken. Jedoch Enzyme sind oft in geschlossenen inaktive Konformationen gefaltet und Aktivierung erfordert eine Konformationsänderung¹¹ , die von anderen Domänen die gleichen Rezeptor vermittelt werden können. Der Test beschriebenen hier Maßnahmen, die die Wechs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Lonza	17-516F	Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge	Eppendorf	5424-R	1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H	Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin	Fisher	BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine	Lonza	BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti–GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actin	Santa Cruz	SC-1616
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
Orthovanadate	Sigma	S6508
H2O2	Sigma	216763	30%
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001	EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)	Invitrogen	LC2676	Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Invitrogen	XP04205BOX	15-well
Nitrocellulose membranes	General Electric	10600004
NaCl	Sigma	S7653	Sodium chloride
HEPES	Gibco	15630080	N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT	Invitrogen	D1532	Dithiothreitol
pNPP	Sigma	20-106	p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH	Sigma	S8045	Sodium hydroxide
BCA	Fisher	23225	Bi Cinchoninic Acid assay