JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Reseptör ilişkili hücresel harekete geçirmek büyük arabulucu enzimlerdir. Bu enzimler, en azından kısmen, reseptörleri sitoplazmik kuyrukları ile fiziksel etkileşimleri tarafından düzenlenmektedir. Etkileşimleri kez aracılığıyla belirli protein etki oluşur ve enzimler harekete geçirmek içinde neden. Proteinler arasındaki etkileşimler incelemek için birkaç yöntem vardır. Co-immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri için gerekli olan etki alanları incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bu belge işe enzimlerin etkinliğini belirli etki alanlarına katkı aynı anda hiçbir deneyleri vardır. Buna göre burada açıklanan yöntemi co-immunoprecipitation ve bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil proteinler ve ilişkili enzimatik harekete geçirmek arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilmesi için birleştirir. Bu iletişim kuralı bir protein ve enzim ve enzim tam harekete geçirmek için zorunlu olan etki alanları arasında fiziksel etkileşimleri için kritik olan etki alanları tanımlamak için hedeftir. Bu testin önemi gösterdi, diğer etki alanlarındaki aynı enzim fonksiyonu düzenlenmesi için gerekli olmakla birlikte bazı reseptör enzim reseptör, sitoplazmik kuyruk için bağlayıcı protein etki katkıda.

Giriş

Katalitik reseptörleri ve reseptör Tirozin kinaz transmembran proteinler neden olan bir hücre dışı ligand bağlayıcı enzimatik aktivite hücre içi yan1' dir. Diğerleri belirli enzimler kinaz ve fosfatazlar sitoplazmik onların kuyrukları için gibi işe iken bazı reseptörleri reseptörü ve enzimatik işlevler, sahip. İşe bir enzim reseptör'ın kuyruğu ve bu enzim sonraki katalitik eylem için her zaman aynı protein etki alanları2tarafından düzenlenir değil iki ayrı işlemler vardır. Ne yazık ki, etkileşim ve enzimatik aktivite aynı anda değerlendirmek için belirli bir aracı vardır. Burada açıklanan fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil bir enzim alımı bir reseptör kuyruğuna onun aktivasyon incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Bu tahlil immunoprecipitation tagged reseptörlerinin antikor kaplı boncuk tarafından kullanır. Daha sonra bir enzim etkinliği tahlil ve western blot Analizi boncuk üzerinde gerçekleştirilir. Hangi protein etki alanlarının reseptörleri ve enzimler (western blot analizi ile değerlendirilmesi) arasındaki etkileşimler için gerekli olduğunu ortaya çıkarmak için bu yöntem genel amacı olduğunu ve hangi etki alanlarının (boncuk üzerinde ölçülen enzimlerin tam harekete geçirmek için zorunlu olduğunu enzimatik aktivite assay). İnsan hastalıkları patogenezinde onların katılımı nedeniyle reseptör ilişkili enzimlerin ayrı işlevleri eğitim araçları geliştirmek önemlidir. Ayrıca, daha fazla bu proteinlerin mekanizmaları anlama roman tedavi müdahaleler tasarım yardımcı olabilir.

Programlanmış ölüm-1 (PD-1) T hücrelerinin yüzeyinde bir inhibitör reseptörü ve aşırı T hücre yanıt-e doğru sınırlamak için gereklidir. Son yıllarda, birden çok maligniteler1,2tedavisinde anti-PD-1 antikorlar karıştığı olmuştur. PD-1 tüp ligasyonu yayılması, yapışma ve salgı birden çok sitokinler3,4,5gibi çok sayıda T hücre işlevi kısıtlayan. PD-1 immünolojik sinaps, T hücreleri ve antijen sunan hücreler6arasında nerede T hücre reseptör (TCR)7ile colocalizes arayüz için yerelleştirilmiştir. Daha sonra Tirozin fosfataz SHP2 [Src Homoloji 2 (SH2) Tirozin fosfataz 2 içeren etki alanını] PD-1 anahtar Tirozin kalıntıları karmaşık TCR ve onun ilişkili içinde proksimal dephosphorylation önde gelen, sitoplazmik kuyruk için oluşturulmuştur sinyal molekülleri3,4,5,8,9. PD-1 sitoplazmik kuyruk iki Tirozin motifleri, bir immunoreceptor Tirozin tabanlı inhibitör motifi (ITIM) ve bir immunoreceptor Tirozin dayalı-anahtar motifi (ITSM)10içerir. Her iki motifleri PD-1 tüp ligasyonu9,10fosforile. Mutagenesis çalışmalar bir birincil rolü için SHP2 işe alım, ITIM rolünü PD-1 sinyal ve fonksiyon açık değildir, aksine4ITSM ortaya çıkardı.

SHP2 ya da kapalı bir (katlanmış) benimser, uyum veya açık bir etkin uyum11(genişletilmiş), inhibe. PD-1 her kuyruk etki alanı SHP2 bağlama ya da harekete geçirmek için katkısını henüz aydınlatılmamıştır değil. Bu soruyu cevaplamak için biz SHP2 istihdamı PD-1 ve onun etkinlik12kuyruk için paralel test sağlar bir tahlil geliştirilmiştir. Co-immunoprecipitation ve etkileşim ve enzimatik aktivite paralel olarak test etmek için bir boncuk üzerinde fosfataz etkinliği tahlil çalıştırmaya başladık. Bu tahlil kullanarak, PD-1 ITSM ITIM PD-1 tam olarak genişletmek ve enzim harekete geçirmek için gerekli süre SHP2 PD-1, kuyruk için işe almak için yeterli olduğunu göstereceğiz.

Çeşitli bitişik etki alanlarına sitoplazmik onların kuyrukları birçok reseptörleri vardır. Fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil protein alımı ya da enzimatik harekete geçirmek için gerekli olan belirli etki alanları rolünü ortaya çıkarmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. transfection hücre

  1. HEK 293T hücre içine on iki 10 cm tabak (tabak başına 5 x 106 hücre) transfection (Şekil 1) önceki gün tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Her plaka için 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  2. Hücrelerin % 80-90 birleşmesi olduğunda, aşağıdaki Plasmid'ler ile lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak 5 HEK 293T plakaları transfect: SHP2 ifade vektör, PD-1-GFP-ifade vektör [PD-1'in vahşi türü (WT) sürüm], ITIM mutasyona uğramış bir sürüm (Y223F ) PD-1-GFP-ifade vektör ve bir ITSM mutasyona uğramış sürümü (Y248F) bir PD-1-GFP-ifade vektör (Şekil 1).
    Not: İki tabak ile WT PD-1-GFP-ifade vektör transfected. Bir ek plaka bir sigara transfected hücreleri denetimi (Şekil 1) hizmet edecektir.
  3. Transfection üreticinin iletişim kuralı göre 10 cm tabak yapışık hücreleri için gerçekleştirin.
    Not: PD-1 mutasyona uğramış sürümlerinde, her motif olarak (Y) Tirozin tarafından Fenilalanin (F) bu fosforile olamaz değiştirildi.
  4. İkinci aynı birtakım beş tabak ve ifade edilen protein miktarı [giriş; olarak da bilinen bütün hücre lysate (WCL)] immunoprecipitation (Şekil 1) önce ölçümü için transfected sigara denetimi olarak hizmet veren bir ek plaka transfect.
  5. Transfected hücreler 37 ° C'de 48 h, % 5 CO2 bir doku kültürü kuluçka için kuluçkaya.
    Not: Bu transfection başarılı bir şekilde oluştu emin olmak için hücreleri floresan mikroskop kullanarak GFP ifade için inceleyin.

2. teşvik Transfected hücrelerdeki fosforilasyon

  1. Kuluçka, taze pervanadate %30 H2O250 µL ile sodyum-orthovanadate (100 mM stoktan) 50 µL karıştırılarak hazır olun.
    Not: Karışım sarımsı bir renk olarak değiştirmeniz gerekir. Pervanadate fosforilasyon Tirozin kalıntıları13teşvik bir hücre geçirgen fosfataz inhibitörü olduğunu. Bu tahlil, bu sağlam PD-1 kuyruk fosforilasyon ikna etmek için kullanılır.
  2. PD-1 etiketlenmiş sürümlerini fazdan için medya PD-1-GFP-transfected hücrelerden kaldırın ve (olmadan serum veya antibiyotik) düz DMEM ile birlikte pervanadate (adım 2.1) 10 µL 10 mL (sekiz tabak ifade sonuçlanan her 10 cm plaka ekleyin PD-1'in farklı sürümleri) (Şekil 1). Karanlıkta 15 dakika oda sıcaklığında tabak koyun.
    Not: SHP2-transfected hücreleri (iki tabak; Şekil 1) ve bu levhalar için active SHP2 enzim kaynağı olarak görev yapacak bu yana iki sigara transfected denetim tabak pervanadate ile kabul edilmediği.
  3. 5 mL de buz gibi 1 x PBS hücrelerle yıkayın. Bu iki kez tekrarlayın.

3. Immunoprecipitation

Not: Aşağıdaki adımları buz üzerinde veya 4 ° C'de yapılmalıdır

  1. Lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 250 mM NaCl, %0.1 NP-40, 2 mM EDTA, % 10 gliserol) proteaz inhibitörleri (10 ml lizis arabellek erime 1 tablet) ve 1 mM sodyum orthovanadate ile ek. Buz gibi lizis arabelleği 500 µL hücrelere eklemek ve kaldırmak ve hücreleri kullanarak hemen bir hücre sıyırıcı plaka toplamak.
    Not: Sodyum orthovanadate SHP2 transfected plakaları ve sigara transfected denetim plakaları fosfataz aktivitesi saklamanız gerekir bu yana, PD-1-GFP-transfected plakaları için kullanılan yalnızca lizis arabelleğe eklemek önemlidir.
  2. Lysates 1.5 mL soğuk tüpler içine aktarmak ve onları 0.005 x g, 30 dk için 4 ° C, döndürün.
  3. Sonrası çekirdeklerin süpernatant (PNS) lysates toplamak için spin aşağı 10.000 x g 4 ° c de 10 dakika lysates ve supernatants yeni tüpler içine aktarın. Pelet atmak. Daha sonra WCL analiz için buz üzerindeki altı tabak (Şekil 1) ikinci kümesi supernatants saklar.
  4. PD-1-GFP immunoprecipitation PD-1-GFP-transfected lysates ilk gelen anti-GFP boncuk hazırlanması ayarla (dört tabak) (Şekil 1).
    1. Boncuk yerleşme önlemek için hafifçe açmadan önce boncuk şişeyle sallayın. Anti-GFP boncuk 40 µL Bulamaç başına her koşul kaldırın.
    2. 500 x g 4 ° C'de 3 dk de spin ve boncuk yıkamayı süpernatant kaldırın.
      Not: Pipet plastik ipuçları ve kaybını önlemek için özel boncuk arasında teması en aza indirmek önemlidir. Bu boncuklar için başka bir tüp aktarmadan önce 200 µL bahşiş kenarına kesmek için tavsiye edilir.
    3. Boncuk lizis arabelleği (örnek) başına 80 µL resuspend.
  5. Yıkanmış boncuk doğrudan hücreye lysate (PNS) ilk kümenin (dört tabak) PD-1-GFP-ifade hücrelerden ekleyin (adım 3.3). 0.005 x g immunoprecipitate GFP öğesini proteinler için 4 ° C'de 30 dk için de döndürün.
  6. Boncuk 1 mL soğuk lizis arabelleği (olmadan orthovanadate) ile 3 kez yıkayın. 2500 x g 10 için de tüp santrifüj kapasitesi s.
    Not: lizis arabellek için boncuk eklerken, bu doğrudan boncuklar ipuçları ile dokunmadan ekleyin. Yukarı ve aşağı yıkama sırasında pipet için gerek yoktur.
  7. Aynı derecede ilk kümedeki (bir tabak; adım 3.3) aktif SHP2 lysate bölmek ve yıkanmış PD-1-GFP-içeren boncuk (WT PD-1-GFP ve iki farklı phosphdeficient mutasyonlar, Y223F ve Y248F) üç tüpler için ekleyin. -Üçte birimin WT PD-1-GFP boncuk ikinci tüp sigara transfected hücre lysate ekleyin. Kalan üçte iki atın.
  8. Boncuk nazik döndürme (0.005 x g) ile 4 ° C'de 4 h için kuluçkaya.
  9. İki kez ile 1 mL soğuk lizis arabelleği (olmadan, pervanadate veya orthovanadate), boncuk adım 3.6 bildirildiği gibi yıkayın.
  10. 80 µL örnek her tüpün içinde toplam hacim 100 µL (boncuk 20 µL) ve 80 µL lizis arabelleği sağlamak başına lizis arabelleği (olmadan, pervanadate veya orthovanadate) ekleyin. Karışımı yavaşça ve 50 µL her tüp sizden iki taze 1,5 mL tüpler içine aktarın.
    Not: Bu adımı, orada-ecek var olmak iki tüp boncuk ve lizis arabellek içeren bir karışımı ile dolu: bir tüp co-immunoprecipitated SHP2 western Blot tarafından test etmek için kullanılacaktır ve ikinci fosfataz aktivitesi tayini için kullanılacaktır.

4. fosfataz etkinliği tahlil

  1. Boncuk fosfataz yıkama arabellek (30 mM Hepes pH 7,4 ve 120 mM NaCl) ile yıkayın. Süpernatant tamamen kaldırın.
  2. Boncuk için tahlil arabelleği (30 mM Hepes pH 7.4, 120 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 mM p-nitrophenylphosphate) 100 µL ekleyin ve nazik ajitasyon altında 30 dakika 30 ° C'de kuluçkaya. Not: Kuluçka zaman değişir, ancak arabellek dephosphorylation sarı yaşına gelene kadar bekle.
  3. Reaksiyon sona erdirmek için arabellek sarı döndüğünde 1 M NaOH 50 µL ekleyin.
  4. Spin aşağı 2500 x g 10 s ve transfer 50 µL süpernatant iki kuyu (iyi başına 50 µL alınanlarla) yarı-alan için için de bir 96-şey plaka. 405 absorbans okumak nm.
  5. Sonuçları göreli optik yoğunluğu (OD) PD-1-GFP denetim vahşi tipi sürümü üzerine hızlı.

5. SHP2 Western Blot Analizi

  1. Boncuk spin ve süpernatant kaldırın.
  2. 2 x Laemmli arabelleği 20 µL ekleyin ( Malzeme tabloyabakın) boncuk ve 95 ° c 5 dakika kaynatın.
  3. Giriş protein konsantrasyonu ölçmek (ikinci bir BCA kullanarak set) denetimleri kiti ( Malzeme tabloyabakın). 30 µL en seyreltilmiş örneği için yeni bir tüp aktarın. Giriş denetimleri lizis arabellek en seyreltilmiş numune olarak aynı konsantrasyonu ile kalan sulandırmak ve 30 µL her biri için yeni bir tüp aktarın.
    Not: Bu adımı, orada-ecek var olmak 30 µL her, ile 4 tüpler benzer protein konsantrasyonları, giriş temsil eden lysates kontrol eder.
  4. Lysates ve kaynatın 5 dk. Spin için 95 ° C'de 2 x Laemmli arabelleğe eşit miktarda aşağı boncuk ve süpernatant 4 – %20 jel SDS-sayfa Tris tabanlı yük eklemek ( Malzeme tabloyabakın) için western blot analizi. Buna ek olarak, 50 µL ikinci küme her örnek--dan yük.
  5. Western blot Analizi protokolüne göre daha önce12açıklanan devam edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Katkı, ITSM PD-1'in SHP2 bağlama için kurulan iken, rol ITIM PD-1, daha az açıktır. SHP2 iki sıralı phosphotyrosines PD-1 (ITSM içinde bir Tirozin) ve ITIM diğerinde bağlayabilirsiniz iki SH2 etki alanı olduğundan, PD-1 ITIM SHP2 aktivite sabitleme ile kolaylaştırır süre ITSM PD-1 PD-1, SHP2 tutturur onaylanmadığına karar onun konformasyon devlet11,14' ü aç. Bu test etmek için bir kombine co-immunoprecipitat...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Reseptör-enzim etkileşimleri hücre içi sinyal için büyük önem taşımaktadır. Birçok enzim reseptörleri SH2 etki alanları aynı reseptörlerinin kuyrukları süslemeleri fosforile tyrosines bağlama aracılığıyla işe. Ancak, enzimler kez kapalı etkin olmayan biçimler katlanmış ve diğer etki alanlarının aynı reseptör aracılı konformasyonal değişim11 istemek harekete geçirmek. Tahlil reseptörleri ve enzimler gibi faaliyet arasındaki etkileşimler bu etkileşimler tara...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu proje NIH hibe 1R01AI125640-01 ve Romatoloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSLonza17-516FPhosphate Buffered Saline
MicrocentrifugeEppendorf5424-R1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol RedGibco25200114
Heat Inactivated FBSDenvilleFB5001-HFetal bovine serum
Penicillin / StreptomycinFisherBP295950
DMEM high glucose without L-glutamineLonzaBE12-614F
SuperFect Transfection ReagentQiagen301305
Anti-SHP2Santa CruzSC-280
Anti–GFP-agaroseMBLD153-8
Anti-GFPRoche118144600
Anti-ActinSanta CruzSC-1616
HEK-293 cellsATCCCRL-1573
OrthovanadateSigmaS6508
H2O2Sigma21676330%
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)InvitrogenLC2676Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini GelsInvitrogenXP04205BOX15-well
Nitrocellulose membranesGeneral Electric10600004
NaClSigmaS7653Sodium chloride
HEPESGibco15630080N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTTInvitrogenD1532Dithiothreitol
pNPPSigma20-106p-Nitrophenyl Phosphate
NaOHSigmaS8045Sodium hydroxide
BCAFisher23225Bi Cinchoninic Acid assay

Referanslar

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46(2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037(2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 139Co immunoprecipitationenzimatik aktiviteprotein protein etkile imiprotein etki alanlarfosfatazl m 1PD 1 programlanm

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır