АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем собой протокол для co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay одновременно изучать вклад доменов конкретных протеина плазматической мембраны рецепторов фермента вербовки и активность фермента.

Аннотация

Рецептор связанных ферментов являются основными посредниками клеточных активации. Эти ферменты, регулируются, по крайней мере в части, физических взаимодействий с хвостами цитоплазматических рецепторов. Взаимодействия часто происходят через конкретные белка доменов и привести к активации ферментов. Существует несколько методов для изучения взаимодействия белков. В то время как co иммунопреципитация обычно используется для изучения домены, которые требуются для взаимодействий протеин протеина, есть без анализов, этот документ вклад конкретных доменов на активность ферментов, набранных в то же время. Соответственно метод, описанный здесь сочетает в себе co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay для одновременной оценки взаимодействия белков и связанные ферментативной активации. Цель настоящего Протокола заключается в идентификации доменов, которые являются критическими для физических взаимодействий между белков и ферментов и домены, которые являются обязательными для полной активации фермента. Продемонстрировал важное значение этот assay, как некоторые рецептор доменов протеина вклад связывание фермента цитоплазматических хвост рецептора, в то время как другие домены необходимо регулировать функции же фермент.

Введение

Трансмембранные белки, в которых привязка внеклеточных лигандов вызывает ферментативную активность на внутриклеточную сторона1каталитического рецепторов и рецепторов тирозин киназы. Некоторые приемные устройства обладают рецепторов и ферментативные функции, в то время как другие набирать специфических ферментов как киназы и фосфатаз в их цитоплазматических хвосты. Набор фермента рецептор хвост и последующих каталитического действия этого фермента являются два отдельных процессов, которые не всегда регулируются же домены белка2. К сожалению Есть нет конкретных инструментов для оценки взаимодействия и ферментативную активность одновременно. Assay функциональные co иммунопреципитация, описанные здесь является полезным методом вскрыть вербовки фермента к хвосту рецепторов от ее активации. Этот assay иммунопреципитации тегами рецепторов использует антителами бисером. Впоследствии выполняются ферментативную активность пробирного и Западный анализ помаркой на бусины. Общая цель этого метода является выявить, какие домены белка, необходимые для взаимодействия между рецепторами и ферментов (оценены Западный анализ помаркой) и какие домены являются обязательными для полной активации ферментов (измеряется на шарик Ферментативная активность проба). Важно разработать инструменты для изучения отдельных функций рецептор связанных ферментов из-за их участие в патогенезе заболеваний человека. Кроме того дальнейшее понимание механизмов действий этих белков может помочь дизайн роман терапевтических вмешательств.

Запрограммированной смерти-1 (PD-1) является ингибирующее рецепторами на поверхности клеток T и требуется для ограничения чрезмерного Т-клеток ответов. В последние годы антитела анти PD-1 были вовлечены в лечении множественные злокачественные опухоли1,2. PD-1 перешнуровка сдерживает многочисленные функции Т-клеток, включая распространения, адгезии и секрецию несколько цитокинов3,,4-5. PD-1 локализован для иммунологических синапса, интерфейс между Т-клеток и антиген представляющих клеток6, где он colocalizes с Т клеточных рецепторов (TCR)7. Впоследствии, тирозин фосфатазы SHP2 [Src гомологии 2 (Ш2) домена, содержащие тирозин фосфатазы 2] набирается цитоплазматических хвост PD-1, приводит к dephosphorylation остатков ключевых тирозина в рамках комплекса TCR и его связанные проксимальной сигнальные молекулы3,4,5,8,9. Цитоплазматических хвост PD-1 содержит два мотивы тирозин, immunoreceptor на основе тирозин ингибирующее мотив (ITIM) и immunoreceptor тирозин основе переключатель мотив (ITSM)10. Обе мотивы фосфорилированных на PD-1 перешнуровка9,10. Мутагенез исследования показали основную роль для ITSM вербовка, в отличие от ITIM, чья роль в PD-1 сигнализации и функция не ясно SHP24.

SHP2 принимает либо закрытые (сложить), ингибирует конформации или открытой (расширенный), активной конформации11. Вклад каждого домена хвост PD-1 SHP2 привязки или активации пока не выяснены. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали assay который позволяет параллельно тестирования набор SHP2 к хвосту PD-1 и его деятельность12. Мы использовали co иммунопреципитация и assay активности фосфатазы на шарик для тестирования взаимодействия и ферментативной активности параллельно. С помощью этого анализа, мы покажем, что ITSM PD-1 достаточно набрать SHP2 к хвосту PD-1, в то время как ITIM PD-1 необходимо в полной мере распространить и активировать энзим.

Есть много рецепторов, которые имеют несколько смежных доменов в их цитоплазматических хвосты. Функциональные co иммунопреципитация assay может раскрыть роль определенных доменов, которые необходимы для белка вербовки или ферментативной активации.

протокол

1. transfection клеток

  1. Семя ГЭС 293T клетки в двенадцать 10 см пластины (5 х 106 клеток на пластину) за день до трансфекции (рис. 1). Выполните подсчет клеток с помощью Горяева. Для каждой пластины используйте 10 мл DMEM дополнена 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 ° C в 5% CO2.
  2. После того, как клетки притока 80-90%, transfect 5 ГЭС 293T плит с помощью реагент на основе липидов трансфекции с одним из следующих плазмидов: SHP2-выражая вектора, PD-1-GFP-выражая вектора [дикого типа (WT) версии PD-1], мутировал ITIM версия (Y223F ) PD-1-GFP-выражая вектора и ITSM-мутировал версия (Y248F) PD-1-GFP-выражая вектора (рис. 1).
    Примечание: Две пластины будет transfected с WT PD-1-GFP-выражая вектора. Одна дополнительная табличка будет служить в качестве элемента не transfected клеток (рис. 1).
  3. Выполните трансфекции согласно производителя протокол для адэрентных клеток в 10 см пластины.
    Примечание: В мутировавших версии PD-1, тирозина (Y) в каждый мотив был заменен фенилаланин (F), который не может быть фосфорилированных.
  4. Transfect второй идентичный набор из пяти плит и одна дополнительная пластина, выступающей в качестве не transfected контроля для измерения количества выраженным белком [ввод; также известен как клеточных lysate (ВКТ)] перед иммунопреципитации (рис. 1).
  5. Инкубируйте transfected клеток для 48 ч при 37 ° C, 5% CO2 в инкубатор культуры ткани.
    Примечание: Для обеспечения что трансфекции произошло успешно, изучите клетки для экспрессия гена GFP с помощью флуоресцентный Микроскоп.

2. содействие фосфорилирования в Transfected клеток

  1. После инкубации готовить свежие pervanadate, смешивая 50 мкл натрия Ортованадат (от 100 мм запас) с 50 мкл 30% H2O2.
    Примечание: Смеси следует изменить в желтоватый цвет. Pervanadate – это ингибитор клетки проницаемой фосфатазы, что способствует фосфорилирования тирозина остатков13. В этот assay он используется для решительно побуждать фосфорилирование хвосты PD-1.
  2. Фосфорилировать тегами версии PD-1, удалите СМИ от PD-1-GFP-transfected клеток и добавить 10 мл равнина DMEM (без сыворотки или антибиотики) вместе с 10 мкл pervanadate (шаг 2.1) к каждой табличке 10 см (в результате восьми пластины выражая различные версии PD-1) (рис. 1). Поместите пластины при комнатной температуре в темноте за 15 мин.
    Примечание: SHP2-transfected клеток (две пластины; Рисунок 1) и две пластины не transfected управления не относятся с pervanadate, так как эти пластины будет служить в качестве источника для активного SHP2 фермента.
  3. Вымойте клетки с 5 мл ледяной ПБС. Повторите этот шаг два раза.

3. иммунопреципитации

Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены на льду или на 4 ° C.

  1. Дополнить буфера lysis (50 мм трис-HCl при рН 7,2, 250 мм NaCl, 0,1% NP-40, 2 мм ЭДТА, 10% глицерина) с ингибиторами протеаз (растворить 1 таблетка в 10 мл буфера lysis) и с Ортованадат натрия 1 мм. Добавьте 500 мкл буфера ледяной lysis клетки и удалить и собирать клетки от пластин, немедленно с помощью скребка ячейки.
    Примечание: Важно добавить Ортованадат натрия только литического буфера, который будет использоваться для PD-1-GFP-transfected пластины, так как SHP2-transfected плиты и плиты не transfected управления должны сохранять фосфатазы.
  2. Передача лизатов в 1,5 мл холодной трубы и повернуть их на 0,005 x g, 4 ° C на 30 мин.
  3. Чтобы собрать лизатов пост ядер супернатанта (ПНС), спин вниз лизатов 10 мин на 10000 x g при 4 ° C и передачи supernatants в новой трубы. Выбросите гранулы. Храните на льду для последующего анализа ВКТ supernatants второго набора из шести пластин (рис. 1).
  4. Подготовка анти GFP бусы для иммунопреципитации PD-1-GFP от PD-1-GFP-transfected лизатов первого набора (четыре пластины) (рис. 1).
    1. Чтобы предотвратить оседание бисер, осторожно встряхните бутылку с бисером перед открытием. Удаление 40 мкл анти GFP бусы из пульпы за каждое условие.
    2. Спина на 500 x g 3 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант мыть бисер.
      Примечание: Важно свести к минимуму контакт между пластиковые наконечники и бусы агарозы для предотвращения потери. Рекомендуется сократить края кончик 200 мкл до перевода бисер в другую трубу.
    3. Ресуспензируйте бисер в 80 мкл буфера lysis (на сэмпл).
  5. Добавить промытый бусины непосредственно в lysate клетки (ПНС) от PD-1-GFP-выражая клетки первого набора (четыре пластины) (шаг 3.3). Поворот на 0,005 x г за 30 мин при 4 ° C до immunoprecipitate GFP-тегами белков.
  6. Вымойте бусины с 1 мл холодного литического буфера (без Ортованадат) 3 раза. Центрифуга трубки на 2500 x g 10 s.
    Примечание: При добавлении буфера lysis бисер, добавьте непосредственно на бисер не касаясь их с советами. Существует не нужно Пипетка вверх и вниз во время мойки.
  7. Одинаково разделить lysate активной SHP2 из первого набора (одна пластина; шагу 3.3) и добавить его в три трубки промывают PD-1-GFP-содержащих бусины (WT PD-1-GFP и два разных phosphdeficient мутации, Y223F и Y248F). Добавьте одну треть объема от lysate не transfected клеток второй трубки WT PD-1-GFP бусины. Отменить оставшиеся две трети.
  8. Инкубируйте Бусины 4 ч при температуре 4 ° C с нежным вращения (0,005 x g).
  9. Вымойте бусины дважды с 1 мл холодного литического буфера (без pervanadate или Ортованадат), как сообщалось в шаге 3.6.
  10. 80 мкл буфера lysis (без pervanadate или Ортованадат) на примере обеспечения того, чтобы общий объем в каждой тюбике 100 мкл (20 мкл бусины) и 80 мкл буфера lysis. Осторожно перемешать и передача 50 мкл от каждой трубы в две свежие 1.5 мл пробирок.
    Примечание: После этого шага, будет существовать две трубки, наполненные смесью, содержащий бусы и буфера lysis: одна трубка будет использоваться для тестирования SHP2 co-immunoprecipitated, Западный blotting, а вторая будет использоваться для анализа активности фосфатазы.

4. фосфатазы деятельности пробирного

  1. Вымойте бусины с фосфатазы мыть буфера (30 мм Hepes на рН 7,4 и 120 мм NaCl). Полностью удалите супернатант.
  2. Добавьте 100 мкл аналитического буфера (30 мм Hepes на рН 7,4, 120 мм NaCl, 5 DTT, p-nitrophenylphosphate 10 мм) бисер и Инкубируйте на 30 ° C в течение 30 мин под нежным агитации. Примечание: Время инкубации могут отличаться, но ждать до тех пор, пока буфер желтеет на дефосфорилирование.
  3. Для завершения реакции, 50 мкл 1 M NaOH когда буфер желтеет.
  4. Спин вниз на 2500 x g для 10 s и передачи 50 мкл супернатант двух скважин (дубликаты с 50 мкл в колодец) половина-района в 96-луночных пластине. Читайте поглощения в 405 нм.
  5. Экспресс результаты как относительная оптической плотности (OD) управления одичал тип версии PD-1-GFP.

5. SHP2 Западный анализ помаркой

  1. Спин вниз бисер и удалить супернатант.
  2. 20 мкл буфера 2 x Laemmli (см. Таблицу материалов) бисер и кипятят на 95 ° C за 5 мин.
  3. Измерить концентрацию белка входного контроля (второй набор) с помощью BCA комплекта (см. Таблицу материалов). Передача 30 мкл наиболее разреженных образца к новой пробке. Разбавить остальные элементы управления вводом с буфера lysis же концентрации как наиболее разреженных образца и передачи 30 мкл от каждого из них новой трубки.
    Примечание: После этого шага, там будет 4 пробирки с 30 мкл каждого, на аналогичные концентрации белка, представляющие ввод контролирует лизатов.
  4. Добавить равных объемах 2 буфера x Laemmli лизатов и кипятят на 95 ° C за 5 мин спин вниз бисер и загрузить супернатант на 4 – 20% гель SDS-PAGE Tris-основе (см. Таблицу материалов) для западного анализа помаркой. Кроме того Загрузите 50 мкл от каждого образца из второго набора.
  5. Далее, что Западный анализ помаркой согласно протоколу описанных ранее12.

Результаты

Хотя вклад ITSM PD-1 SHP2 связывание устанавливается, роль ITIM PD-1 менее ясно. Поскольку SHP2 имеет два SH2 доменов, которые можно привязать к двум последовательным phosphotyrosines PD-1 (один тирозина в ITSM), а другой в ITIM, мы предположили, что ITSM PD-1 якорей SHP2 PD-1, в то время как ITIM PD-1 облегчает SH...

Обсуждение

Рецептор фермента взаимодействия имеют решающее значение для внутриклеточная сигнализация. Многие ферменты набираются через SH2 доменов, привязка к фосфорилированных tyrosines, которые украшают хвосты же рецепторов рецепторы. Однако ферментов часто складывают в закрытых неактивной конфо...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект финансировался NIH грантов 1R01AI125640-01 и ревматологии исследовательский фонд.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSLonza17-516FPhosphate Buffered Saline
MicrocentrifugeEppendorf5424-R1.5 mL
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol RedGibco25200114
Heat Inactivated FBSDenvilleFB5001-HFetal bovine serum
Penicillin / StreptomycinFisherBP295950
DMEM high glucose without L-glutamineLonzaBE12-614F
SuperFect Transfection ReagentQiagen301305
Anti-SHP2Santa CruzSC-280
Anti–GFP-agaroseMBLD153-8
Anti-GFPRoche118144600
Anti-ActinSanta CruzSC-1616
HEK-293 cellsATCCCRL-1573
OrthovanadateSigmaS6508
H2O2Sigma21676330%
Protease inhibitor cocktailRoche11836170001EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2x)InvitrogenLC2676Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini GelsInvitrogenXP04205BOX15-well
Nitrocellulose membranesGeneral Electric10600004
NaClSigmaS7653Sodium chloride
HEPESGibco15630080N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTTInvitrogenD1532Dithiothreitol
pNPPSigma20-106p-Nitrophenyl Phosphate
NaOHSigmaS8045Sodium hydroxide
BCAFisher23225Bi Cinchoninic Acid assay

Ссылки

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

139Co11

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены