JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

נתאר כאן פרוטוקול לחקור cytotoxicity של טרום הופעל CD8+ T תאים נגד תאים סרטניים על ידי גילוי אפופטוטיים להיפגע סרטן תאים באמצעות בזמן אמת מיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לחקור מנגנונים מאחורי מיאלואידית הנוצרות על-ידי תאי T cell דיכוי והערכת תרכובות שמטרתה חידוש תאי T באמצעות המצור של תאים חיסוניים מיאלואידית מדכאים.

Abstract

Potentiation ליכולת הגידול הרג של CD8+ T התאים בגידולים, יחד עם חדירה יעיל הגידול שלהם, היא מרכיב מרכזי של immunotherapies מוצלח. מספר מחקרים הראו כי הגידול הסתננות התאים מיאלואידית (למשל, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול (MDSCs) וסרטניים הקשורים מקרופאגים (תאמי)) לדכא את cytotoxicity של CD8+ T תאים microenvironment את הגידול, את המיקוד אלה בתאי מיאלואידית הרגולציה יכול לשפר את immunotherapies. כאן, אנו מציגים את מערכת assay במבחנה כדי להעריך את ההשפעות מדכא מערכת החיסון של monocytic-MDSCs תאמי ביכולת הגידול הרג של CD8+ T תאים. לשם כך, אנו קודם תרבותי תמים CD8 הטחול+ T תאי עם הפעלת נוגדנים anti-CD3/CD28 נוכחות או היעדרות של תאים משתיק קול, ואז תרבותי משותף תאי T מופעל מראש עם היעד תאים סרטניים בנוכחות fluorogenic המצע קספאז-3. קרינה פלואורסצנטית מן המצע בתאים סרטניים זוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית בזמן אמת מיקרוסקופ כמחוון של T-cell המושרה גידול התא אפופטוזיס. ב- assay זו, אנו יכולים להבחין בהצלחה העלייה ואפופטוזיס תאים סרטניים על ידי CD8+ T תאים, את הדיכוי התרבות מראש עם תאמי או MDSCs. Assay תפקודית זו שימושית עבור חוקרים CD8+ T תא מנגנוני דיכוי על ידי התאים מיאלואידית רגולטוריות ומטרות druggable מזהים להתגבר באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה.

Introduction

זה ידוע כי CD8+ T תאים יכול לחסל תאים סרטניים כאשר הם מפעילים את cytotoxicity המלא שלהם. לאחר ההפעלה של הקולטן תא T (TCR), CD8+ T תאים להתרבות, להבדיל לתוך תאים אפקטור ציטוטוקסיות. התרחב, הופעל CD8+ T תאים מפרישים בגרגרים ציטוטוקסיות, כולל perforin ו- granzymes, אשר מועברים לתוך תאי היעד וליזום מסלולים lytic שונים כגון קספאז-3 מתווכת אפופטוזיס1. CD8+ T תאים יכול גם לגרום אפופטוזיס תאים סרטניים על ידי הפעלת רצפטורים על התאים היעד, כגון קולטני הגידול נקרוזה מקדם-α (TNF-α), אפופטוזיס הראשון אות ליגנד (FasL) או הקשורים ל- TNF ליגנד בתדר אפופטוזיס (שובל). יתר על כן, הופעל CD8+ T תאים מפרישים אינטרפרון-γ (IFN-γ) שיכול לדכא את התפשטות תאים סרטניים ולהגביר את רמת הרגישות של גידול התאים CD8+ T תאים באמצעות למעלה-ברגולציה של קולטן FasL1. נתון את הפוטנציאל עבור CD8+ T הגידול הרג היכולת, מספר אסטרטגיות כדי להגביר את cytotoxicity שלהם (למשל, מחסום מעכבי חיסון סרטן, העברת המאמצת של chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) המבטאת תאי T) הוקמו שמוצג אפקטים טיפוליים משמעותיים על סוגים מסוימים של סרטן2. עם זאת, לצבירת ראיות מרמז כי החיסון גידולים הסתננות התאים כגון תאי T רגולטוריים, משתיק קול, נגזר מיאלואידית תאים (MDSCs), הקשורים מקרופאגים (תאמי) יכול לדכא CD8+ T תא פונקציות ולהגביל את היעילות immunotherapies3,4,5. כדי לשפר את immunotherapies כל כך, חשוב להבין איך המערכת החיסונית משתיק קול תאים מגבלת CD8+ cytotoxicity תא T. הזיהוי של CD8+ תא T מנגנוני דיכוי, כמו גם מטרות druggable להתגבר על זה, יחייב את פיתוח וניצול מיטבי של מבחני במבחנה.

השיטה תקן הזהב של מדידת CD8+ cytotoxicity תא T הוא lysed הם וזמינותו שחרור כרום אשר שחרורו של החללית רדיואקטיבי (51Cr), היעד תאים זה על ידי CD8+ T תאים, הוא נחוש6. אולם, assay הזה יש מספר חסרונות כולל רגישות נמוכה יחסית, רקע, חוסר יכולת לאתר אירועי מוות מוקדם, בעיות סילוק מסוכנים ותאימות מוגבלת עם טיפול בנוזלים אוטומטי וזיהוי לתמוך יישומי תפוקה גבוהה יותר. שיטה נפוצה נוספת היא זרימה cytometric ניתוחים שבהם אפופטוזיס של תאים סרטניים היעד הוא זוהה על ידי annexin V מחייב7. זה assay, זה אפשרי לגילוי פרמטרים אחרים כגון מוות תאי היעד באמצעות propidium יודיד (PI) או 7-aminoactinomycin D (7-מ) והפעלה אפקטור התא שצוין על-ידי ביטוי CD107a או CD69, בנוסף אפופטוזיס בתאים היעד7 . עם זאת, זה וזמינותו מחייבת מספר גדול של תאים משתיק קול לעומת וזמינותו שחרור כרום. זה גם דורש את הניתוק ואת disaggregation של התאים היעד חסיד, זה יכול הטיה את התוצאות. אכן, בגלל הכרומיום לשחרר assay או זרימה cytometric assay לא משמשות כדי לחקור השפעות תא משתיק קול על פונקציות תא T. במקום זאת, המדד של תא T התפשטות שצוין על-ידי דילול של הפלורסנט (למשל, CFSE) שהוטענו מראש בתאי T נעשה שימוש תכוף כדי להעריך את עיכוב של CD8+ תא T פונקציה על ידי תאים משתיק קול. זיהוי של IFN-γ ייצור מתאי T תרבותי היא שיטה סטנדרטית נוספת כדי להעריך את ההשפעות של תאים משתיק קול על תא T הפעלה8,9. עם זאת, התוצאות של מבחני אלה לא בהכרח מתאימות לתא היעד להרוג את היכולת של CD8+ T תאים.

אנו מציגים כאן assay פונקציונלי חלופי כדי להעריך את ההשפעות של תאים משתיק קול, במיוחד מקרופאגים, גידולים גרורות, על cytotoxicity של CD8+ T תאים. שיטה זו קובעת cytotoxicity של CD8+ T תאים, מראש תרבותי עם או בלי התאים משתיק קול בנוכחות נוגדנים anti-CD3/CD28 הפעלת, על ידי גילוי הגידול תא אפופטוזיס, המצוין על-ידי קרינה פלואורסצנטית מ fluorogenic קספאז-3 המצע6 שימוש אוטומטי זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 1). פרוטוקול זה יש כמה יתרונות לעומת שיטות אחרות; זה דורש רק מספר קטן של תאים, מאפשרת גילוי של מוות תאי הגידול חסיד עם רגישות גבוהה, יכולים ליצור תמונות מערכת אינטראקציה אפקטור-כדי-יעד בזמן אמת והוא נוטה ההקרנה תפוקה גבוהה.

פרוטוקול זה, macrophages הקשורים גרורות (MAMs), שלהם קדמון monocytic-MDSCs (M-MDSCs) מבודד גידולים גרורות עכברים משמשים כתאים משתיק קול. העכבר דגמים של סרטן שד גרורתי, מאופיין אוכלוסיה שונות של מקרופאגים כמו F4/80גבוההLy6G–CD11bגבוההLy6Cנמוכה שמצטבר הריאה המכיל גידולים גרורות. אוכלוסייה זו מקרופאג לעתים רחוקות נמצא בכבד נורמלי, לפיכך נקרא גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAMs)10. במודלים אלה העכבר, אחרת מיאלואידית תא אוכלוסייה, המוגדר בתור F4/80גבוההLy6G–CD11bגבוהLy6Cגבוה, גם שמצטבר בעיקר ריאות גרורתי איפה זה מעורר MAMs11. בהתבסס על המאפיינים שלהם, CD11bגבוההLy6Cגבוהה אמא ובתאים עשוי לייצג M-MDSCs12.

Protocol

כל ההליכים עכברים מעורבים נערכו לפי ברשיון רשות מן הבית משרד בבריטניה (P526C60B3). מידע אודות ריאגנטים מסחרי וציוד מפורטים בטבלה של חומרים.

1. הכנת התאים היעד המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום בגרעין

  1. להשיג קו תא היעד סרטן העכבר ממקור המתאים.
    הערה: פרוטוקול זה, נגזרת מאוד גרורתי של E0771 העכבר החלב גידול תאים (E0771-LG)13 משמשים. הורים E0771 תאים שמקורם C57BL/6 עכברים14.
  2. הפשרת ולתחזק בקבוקון של תאים E0771-LG עם Dulbecco ששינה נשרים בינוני (DMEM) כולל 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS) חממה תרבות תא 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
    הערה: הוא צריך להיות אישר כי תאים הם שליליים עבור mycoplasma. למטרה זו, התרבות תאים E0771 (או תאים להיבדק) במשך 2-3 ימים כפי שתואר לעיל (בהיעדרו של אנטיביוטיקה, antimycotics), לאסוף 500 μL של תרבות בינוני. Centrifuge של המדיום ב x 12,419 g 60 s כדי לסלק שאריות תאים ולהעביר תגובת שיקוע לתוך צינורות חדשים. לקבוע mycoplasma זיהום באמצעות ערכת הבדיקה זמינים מסחרית mycoplasma (עיין טבלה של חומרים) ו/או ה-PCR15 ההוראות של היצרן.
  3. 3 E0771-LG זרע 5 x 10 תאים לכל טוב לתוך צלחת 12-ובכן, התרבות שהתאים עם 10% (v/v) FBS-DMEM בין לילה באינקובטור 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
    הערה: אם קצב התפשטות התאים היעד נמוך (אוכלוסייה הכפלת זמן גדול מ- 36 h), ניתן להגדיל את מספר התאים עונה 1 פרק 104.
  4. להחליף את המדיום 1 מ"ל של 10% (v/v) FBS-DMEM כולל 10 polybrene μg/מ"ל ולהוסיף μL 25 lentiviral חלקיקים (1 x 106 טו/mL) קידוד גרעינית מוגבלת חלבון פלואורסצנטי אדום (mKate2, עיין בטבלה של חומרים).
  5. התרבות התאים במשך 24 שעות ביממה באינקובטור 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
  6. להחליף את המדיום עם 10% (v/v) FBS-DMEM, התרבות התאים במשך 24-48 שעות באינקובטור 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
  7. החלף את המדיום עם 10% (v/v) FBS-DMEM כולל puromycin μg/mL 1 כאשר התאים להתחיל חלבון פלואורסצנטי אדום ו התרבות התאים עד 80-90% confluent.
    הערה: ריכוז של puromycin יהיה שונה בין סוגי תאים המטרה, צריך ניתן למטב באמצעות תאים transfected האו ם.
  8. תת-תרבות ההישרדות תאים עבור פסקאות 1-3 עם 10% (v/v) FBS-DMEM כולל 1 puromycin μg/mL, cryopreserve מניות בבמערכת אחסון בחנקן נוזלי אדי שלב עד השימוש.

2. בידוד תאי משתיק קול מן הגידולים בעכברים

הערה: ב פרוטוקול זה, תאים משתיק קול (קרי, MAMs ו- M-MDSCs) הם בודדו אותנו מהמתרחש הריאה המכיל גידולים גרורות נוסדה על ידי תאים E0771-LG. צריך להיות מוטבת תנאים רקמות דיסוציאציה, מיון תא כדי לבודד את התאים ברקמות שונות.

  1. מזריקים תאים סרטניים6 עונה 1 פרק 10 (E0771-LG) לתוך וריד הזנב syngeneic (C57BL/6), נקבה, שבוע 7-10 עכברים.
  2. אחרי 14 יום לבודד את הריאה המכיל גידולים גרורות והכן תא בודד המתלים מהריאות perfused באמצעות עיכול אנזימטי כפי שתואר לעיל11.
    הערה: ב פרוטוקול זה, ארבעה עכברים מוזרקים עם תאי סרטן, גרורות בריאות משולבים כדי להשיג מספיק תאים משתיק קול.
  3. דגירה של המתלים תא בודד עם העכבר נגד נוגדן CD16/CD32 במשך 30 דקות על קרח, כתם עם נוגדנים פלורסנט CD45 F4/80, CD11b, Ly6C, Ly6G (עיין טבלה של חומרים) במשך 30 דקות עוד10,11 , 13.
  4. לשטוף את התאים מוכתם פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS המכיל 2% (w/v) אלבומין שור (BSA), וכן להשעות מחדש בגדר תא עם 500-1000 μL ל- PBS המכיל 2% (w/v) BSA.
  5. להוסיף 3 μM של דאפי ומיין את M-MDSCs (דאפי–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bגבוהLy6Cגבוה), MAMs (דאפי–CD45+F4/80+Ly6G–CD11bגבוהה Ly6Cנמוך) באמצעות סדרן התא (משלים איור 1).
    הערה: סף Ly6C רמת להבחין MAMs (Ly6Cנמוכה) ו- M-MDSCs (Ly6Cגבוהה) מבוססת על זו של תושב מכתשי מקרופאגים (RMAC). הטוהר של תאים ממוינים נמדד באמצעות cytometry זרימה עם טוהר הצפוי של יותר מ- 90%.
  6. Resuspend של תאים ממוינים עם 400 μL של DMEM המכיל 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 1% (v/v) ללא-חומצות אמינו חיוניות, 1 מ מ נתרן פירובט, ו- 50 ננומטר מרקפטואתנול (נקרא מועשר-DMEM, E-DMEM).
  7. לספור את מספר תאים חיים באמצעות ה Trypan בשיטה של הדרה כחול16 ולהתאים את 2 x 106 תאים למ"ל עם E-DMEM.
  8. לשמור את התאים על הקרח עד השימוש.

3. בידוד של CD8+ T תאים מן הטחול של עכברים

  1. לבודד את הטחול של עכבר זה syngeneic אל קו התא סרטן היעד (קרי, עכברים C57BL/6 של פרוטוקול זה) כדלקמן:
    1. להרדימו באמצעות אינהלציה2 CO.
    2. במקום החיה על קרש חיתוך נקי, לנגב את העור עם אתנול 70% (v/v).
    3. לחתוך את העור בבטן באמצעות מספריים כדי לחשוף את הטחול
    4. לבודד את הטחול, אשר ממוקם לנחותים הקיבה, ולמקם אותו לתוך צינור המכיל 5 מ של PBS קר כקרח.
  2. באמצעות הבוכנה הפנימי של מזרק 5 מ ל סטרילי, לטחון הטחול על מסננת תא 100 μm על שפופרת 50 מ.
  3. עוברים את התאים המסנן באמצעות הכולל 10 מ"ל ל- PBS.
  4. Centrifuge התליה תא ב x 337 g למשך 5 דקות ולאחר וארוקן את תגובת שיקוע.
  5. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS המכילה EDTA 2 מ מ ו- 0.5% (w/v) BSA (מפעיל מאגר), לסנן דרך מסננת תא 40 μm.
  6. לספור את מספר תאים חיים ולהתאים את עונה 1 פרק 108 תאים למ"ל באמצעות המאגר המצטבר.
    הערה: שמור קטן aliquot של תאים כמדגם העשרה מראש לבדיקת טוהר.
  7. להעשיר עבור CD8+ T תאים באמצעות ערכת שלילית הבחירה של סדרן מגנטי (עיין טבלה של חומרים).
    1. להעביר עונה 1 פרק 10-8 (1 מ"ל) של התאים splenocytes צינור עגול-התחתון פוליסטירן מ.
    2. הוסף μL 50 biotinylated נוגדנים, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    3. הוסף μL 125 של streptavidin מצומדת beads מגנטי, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    4. להוסיף 1.325 מ"ל של הפעלת מאגר ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
    5. למקם את הצינור לתוך המגנט, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2.5 דקות.
    6. לאסוף את המגנט, ויוצקים התליה תא מועשר לתוך צינור חדש.
  8. Resuspend התאים מועשר עם 200 μL של E-DMEM (כלומר., DMEM המכיל 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) פניצילין/סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 1% (v/v) ללא-חומצות אמינו חיוניות, פירובט נתרן 1 מ"מ ו- 50 ננומטר מרקפטואתנול).
  9. לספור את מספר תאים חיים והתאימו 2 x 106 תאים/מ עם E-DMEM. שמור התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO2 מגשים עד השימוש.
    הערה: שמור קטן aliquot של תאים כמדגם העשרה שלאחר לבדיקת טוהר.
  10. לקבוע את הטוהר של CD8+ T תאים על-ידי cytometry זרימה כדלקמן:
    1. עונה 1 פרק 104 תאים טרום העשרה (שלב 3.6) או פוסט-העשרה (שלב 3.9) דוגמאות ולהתאים את הנפח הכולל של כל אחד כדי μL 100 באמצעות מאגר הפעלה.
    2. דגירה של המתלים תא בודד עם העכבר נגד נוגדן CD16/CD32 במשך 30 דקות על קרח, כתם עם נוגדנים פלורסנט CD45, CD3, CD4 ו CD8 (עיין טבלה של חומרים) למשך עוד 30 דקות.
    3. לשטוף את התאים ויטראז'ים עם μL 500 ל- PBS המכיל 2% (w/v) BSA, מחדש להשעות בגדר תא עם 500-1000 μL ל- PBS המכיל 2% (w/v) BSA.
  11. להוסיף 3 μM של דאפי, וכן לקבוע את אחוזי CD3+CD4–CD8+ תאי CD45 הכולל+ תא האוכלוסייה.

4. הפעלת והרחבה של CD8 מבודד+ T תאים

  1. 50 μL aliquot5 1 x 10 תאי CD8+ T תאים (להכין בשלב 3.9) לתוך בארות של צלחת U-התחתון 96-ובכן.
  2. להוסיף 1 x 105 תאים לכל 50 תאים משתיק קול μL (להכין בשלב 2.7) או μL 50 של E-DMEM לתוך הבארות.
  3. מכינים הפעלה בינונית המורכבת של E-DMEM, 4 x 104 U/mL המושבה-מגרה פקטור 1 (CSF-1), U/mL 240 interleukin-2 (il-2), 8 μg/mL העכבר אנטי CD3ε נוגדנים 16 μg/mL אנטי-העכבר CD28 נוגדן.
    הערה: CSF-1 אינה נדרשת עבור הפעלת תא T, אך היא חיונית להישרדות של תאים משתיק קול פרוטוקול זה (קרי, MAMs ו- M-MDSCs). לכן, זה נשמר תרבות משותפת של תאי T עם היעד תאים סרטניים כדי לשמור על עקביות בתנאים תרבות. מאז CSF-1 נמצא בריכוזים ננו-טוחנת ברקמות כל והוא נדרש עבור מונוציט/מקרופאג הכדאיות ויוו, זה הקשר פיזיולוגיים עבור תאים אלה.
  4. להוסיף 50 μL של הפעלה בינונית (שלב 4.3) ו- 50 μL של E-DMEM עם או בלי ריאגנטים להיבדק.
  5. להכניס את הצלחת בתוך אינקובטור 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2 , התרבות התאים במשך 4 ימים.

5. ההתקנה של תרבות משותפת של היעד תאים עם מראש הופעל CD8+ T תאים

  1. להוסיף 30 μL של מטריקס מדולל קרום מסיסים פקטורי גדילה-מופחתת המרתף בטחונות (טבלה של חומרים) לתוך הבארות של צלחת 96-ובכן התחתון שטוח מתאים מיקרוסקופ, דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה2 CO במשך לפחות שעה.
  2. להכין את היעד תאים (קרי, E0771-LG תאים המבטאים גרעינית מוגבלת חלבון פלואורסצנטי אדום).
    1. דגירה תאי היעד עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה, לקצור את התאים על ידי עדין pipetting.
    2. הוסף 9 מ של DMEM כולל 10% (v/v) FBS, centrifuge התליה תא ב x 337 g למשך 5 דקות.
    3. מחדש להשעות את התאים עם 500 μL של E-DMEM, לספור את מספר תאים חיים.
      הערה: לפני ספירת תאי היעד, התאים לסנן דרך מסננת תא 40 µm לייצר תא בודד ההשעיה.
    4. להתאים את צפיפות 2 x 104 תאים/מ ל (= 1 x 103 תאים לכל 50 μL) על-ידי הוספת E-DMEM, ולשמור את התאים על קרח.
  3. להכין אפקטור תאים (קרי, מראש הופעל CD8+ T תאים).
    1. Resuspend התאים טוב של 96-ובכן צלחת (שלב 4.5) ביסודיות על ידי pipetting, העברה CD8 צף+ T תאים לתוך צינור 1.5 mL החדש.
      הערה: MAMs M-MDSCs בחוזקה לדבוק היטב, לא מנותק מאת pipetting.
    2. כדי לאסוף את התאים הנותרים, להוסיף μL 200 ל- PBS לתוך הבאר, להעביר לתוך הצינור בשלב 5.3.1.
    3. לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של E-DMEM פעם אחת (צנטריפוגה ב 337 x g) במשך 5 דקות, תשאף ולמחוק תגובת שיקוע), ו resuspend אותם עם μL 100 של E-DMEM.
    4. לספור את מספר תאים חיים (באמצעות השיטה הדרה trypan blue), להתאים את הצפיפות ל 1.6 x 105 תאים/mL (= 4 x 103 תאים/25 μL) ולשמור את התאים על קרח.
  4. האחות המטריקס קרום המרתף מכל קידוח של הצלחת בשלב 5.1.
  5. להוסיף 1 x 103 תאים/50 μL של התאים היעד (שלב 5.2.4) לבאר כל ומערבבים היטב.
    הערה: כדי להימנע אפקטי קצוות עקב התאדות בינוני, רק את בארות 60 הפנימי 96 טוב צלחת אמור לשמש לניתוח.
  6. להוסיף 25 μL של E-DMEM כולל 4 x 103 il-2 U/mL and 10 μM fluorogenic קספאז-3 המצע (עיין טבלה של חומרים).
  7. להוסיף 4 x 103 תאים/25 μL של CD8+ T תאים (שלב 5.3.4) לתוך המתאים בארות ומערבבים היטב.
    הערה: הנוכחות של תאים רבים מדי בבאר מקשה על הניתוח. במודל זה, אפקטור 4:1: יחס היעד (cell סך הכל מספר 5 x 103 תאים/טוב) היה אופטימלי, אבל יחס 8:1 היה שיוצרת. וולס המכיל ארבעה הפקדים הבאים נחוצים לסייע עם ניתוח נתונים: היעד תאים על הצפיפות בשביל הבארות תרבות משותפת (1 x 103 תאים/טוב) בשימוש בינוני עם ובלי המצע קספאז-3, אפקטור תאים (1 x 103 תאים / טוב) בינוני עם ובלי המצע קספאז-3.
  8. להוסיף 200 μL של PBS או במים סטריליים לתוך כל ריק ווילס (במיוחד בארות בפריפריה של הצלחת) כדי להקטין התאדות של מדיום מבארות ניסיוני.
  9. הגדר את הצלחת לתוך המיקרוסקופ זריחה זמן לשגות המתוחזק 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
    הערה: לנער את הצלחת בדפוס-קרוס להפיץ באופן שווה את כל התאים ולאחר מכן אפשר את הצלחת להישאר בטמפרטורת החדר על משטח שטוח למשך 10-20 דקות לפני העברת החממה.

6. הדמיה של תאים

הערה: תמונה מפורטת רכישה ההגדרות ישתנו עם מיקרוסקופ, fluorophores להשתמש; הפרמטרים הבאים כללי הרכישה צריך להיות מועסק לקבלת תוצאות אופטימליות.

  1. שימוש ברוטינת פוקוס אוטומטי המתאים על המיקרוסקופ, לרכוש תמונות המכסה לפחות 25% על פני השטח הכולל כל היטב ניסיוני של צלחת 96-ובכן.
  2. הגדר המיקרוסקופ כדי לרכוש תמונות חדות שלב, כמו גם ערוץ פלורסנט מתאים גרעינית מוגבלת אדום חלבון פלואורסצנטי (mKate2) ומופעל ערוץ פלורסנט מתאים fluorogenic ירוק המצע קספאז-3 (עם עירור-488 ננומטר) (איור 2).
  3. לכידת תמונות בבארות ניסיוני שלב ניגוד ו 2 ערוצים פלורסנט h כל 1 עד 3 לפחות 72 h.

7. ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה

הערה: תמונה מפורטת ניתוח ההגדרות ישתנו עם התוכנה ששימשה (עיין טבלה של חומרים); ההליכים הבאים ניתוח כללי צריך להיות מועסק לקבלת תוצאות אופטימליות.

  1. לקבוע אם ספקטרלי ערבוב בלתי נדרש להפריד את האות פלורסנט הנפלטים על ידי גרעין תא היעד מ הנפלטת גרעינים אפופטוטיים להיפגע, אם נדרש, להגדיר את פרוטוקול ניתוח לבצע זאת;
    1. תצוגת פקד טוב המכיל תאים היעד בלבד (עם התווית mkate2) בינוני ללא סובסטרט קספאז-3 בערוץ ניאון ירוק.
    2. שים לב אם קרינה פלואורסצנטית ירוק הנפלטת על ידי גרעינים אדום (גרעינים מופיעים ירוק)
    3. אם ירוק הוא לכאורה בהגרעינים, לגשת אל פקד unmixing ספקטרלי תוכנת הדמיה, להגדיל את האחוז של אדום יוסר ירוק עד האות הירוק נעלם (מניסיוננו, בדרך כלל 6-7% עבור mKate2 בהיר קרינה פלואורסצנטית).
    4. אם קרינה פלואורסצנטית הירוק אינה ניכרת כל הגרעינים, unmixing ספקטרלי לא הכרחי.
      הערה: מבחן תיקון unmixing ספקטרלי זה יכול גם להתבצע תוך שימוש טוב של התאים היעד בינוני המכיל המצע קספאז-3. עם זאת, יש בדרך כלל רמה נמוכה מאוד של ספונטנית אפופטוזיס בתאים היעד (פחות מ 10%), וכתוצאה מכך כמה גרעינים תא היעד פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק עקב הפעלה של קספאז-3 מאשר קרינה פלואורסצנטית בליד. קרינה פלואורסצנטית נכון בליד ניכרת בתנאים אלה כאשר ירוק הוא ניכרת כל הגרעינים.
    5. הצג פקד טוב המכיל תאים אפקטור בלבד (ללא תווית גרעין האטום) בינוני ללא סובסטרט קספאז-3 בערוץ אדום וירוק בנפרד.
    6. שים לב אם קרינה פלואורסצנטית ירוקים או אדומים הנפלטת על ידי הגרעינים. אם אדום וגם ירוק הוא ניכרת והערוצים unmixing ספקטרלי לא הכרחי.
      הערה: לפי הניסיון שלנו, העכבר CD8+ T תאים אינם אוטומטית-פלורסנט, ולכן אין unmixing ספקטרלי הוא הכרחי עבור תאים אלה. מבחן תיקון unmixing ספקטרלי זה יכול גם להתבצע תוך שימוש טוב של תאים אפקטור בינוני המכיל המצע קספאז-3. עם זאת, יש בדרך כלל רמה מסוימת של אפופטוזיס ספונטנית וכתוצאה מכך גרעין התא אפקטור פולטות קרינה פלואורסצנטית ירוק עקב הפעלה של קספאז-3. קרינה פלואורסצנטית נכון בליד ניכרת בתנאים אלה כאשר ירוק הוא ניכרת כל הגרעינים.
  2. להשתמש בשיטה חיסור רקע זריחה (למשל, TopHat), עם פרמטרים רלוונטיים עבור המדגם, כדי לפתור את האובייקטים פלורסנט בשני ערוצים פלורסנט.
    הערה: בערוץ ירוק השתמשנו TopHat (רדיוס גרעין האטום = סף פלורסצנטיות מיקרומטר, ירוק 10.0 = 0.7 יחידות כיול ירוק). בערוץ אדום השתמשנו TopHat (רדיוס גרעין האטום = סף פלורסצנטיות מיקרומטר, אדום 10.0 = יחידות כיול האדומים 0.5).
  3. השתמש פרמטרים מתאימים עבור פיצול-קצה לפתרון גרעינים בודדים פלורסנט.
    הערה: אנחנו לא השתמש קצה פיצול בערוץ פלורסצנטיות ירוק או אדום.
  4. להשתמש בתמונות בערוץ אדום מן הבארות המכיל רק היעד תאים (עם סובסטרט קספאז) כדי לקבוע את הגודל המינימלי של גרעינים היעד.
    הערה: השתמשנו מיקרומטר 802.
  5. להשתמש בתמונות בערוץ ירוק מן הבארות המכיל רק אפקטור תאים (עם סובסטרט קספאז) כדי לקבוע את הגודל הממוצע של גרעינים אפקטור אפופטוטיים להיפגע.
    הערה: מוות בודד אפקטור גרעינים נע בין 40-80 מיקרומטר2 בניסויים אלה.
  6. להגדיר את הליך ניתוח כדי לספור את מספר היעד פלורסנט תא גרעינים באמצעות של הגבלת גודל מינימלי המתאים (למשל, האזור המזערי, קוטר מינימלי) (איור 2, מסיכת זיהוי המטרה).
    הערה: השתמשנו אזור גרעינים מינימלי (פלואורסצנטי אדום) = מיקרומטר 802.
  7. להגדיר את הליך ניתוח כדי לספור את מספר גרעינים אפופטוטיים להיפגע אשר גדול מהגודל הממוצע של מוות אפקטור גרעינים (איור 2, גודל אפופטוזיס מוגבלת מסכה).
    הערה: גודל המסנן הוגדר מיקרומטר 802 (קרי, היחידה תחומי גדול מהגודל הזה ירוק פלורסצנטיות נספרו, ובכך לא כולל הגרעינים אפקטור אפופטוטיים להיפגע יחיד ). באמצעות פרמטרים אלה מגדיל את הדיוק של הניתוח ב ספירת גרעיני תא היעד אפופטוטיים להיפגע למרות אולי ניתן לספור כמה אגרגטים של תאים אפקטור אפופטוטיים להיפגע.
  8. להגדיר את הליך ניתוח כדי לספור את מספר התאים היעד אפופטוטיים להיפגע על ידי ספירת גרעיני איפה אות ניאון אדום (מתוך שלב 7.6) ו בעל הגבלת גודל אות ניאון ירוק (מתוך שלב 7.7) באופן משמעותי משותף לשפה (איור 2, R /G חפיפה מסכה).
    הערה: לוקליזציה שיתוף המתאימים עשויים לנוע בין 30% ל- 100% של גודל אכזרי של גרעינים היעד. חפיפה בגודל המסנן הוגדר מיקרומטר 402.
  9. קובעים מספר גרעינים תא היעד אפופטוטיים להיפגע, כמו גם את מספר היעד גרעין התא בבארות עבור כל תנאי ניסיוני במשך כל הזמן.

8. ניתוח נתונים באמצעות חישוב, ותוכנה גראפית

  1. גרף מספר אפופטוטיים להיפגע גרעינים של תא היעד שהושג בשלב 7.9 במרוצת כל הזמן בשביל הבארות ניסיוני. אם מספר בארות שימשו עבור כל תנאי הניסוי, בצורה גרפית להציג את התוצאות אומר ± סטיית התקן.
  2. לחשב את השבר מוות של אוכלוסיית היעד תאים על-ידי חלוקת המספר בתאים אפופטוטיים להיפגע מכל קידוח מספר התאים היעד כל היטב בכל נקודה בזמן.
  3. גרף התוצאות המתקבלות בשלב 8.2.
  4. קובעים את האזור מתחת העקומה (AUC) עבור כל עקומה. השבר אפופטוטיים להיפגע שיא של האוכלוסייה עבור כל עקומה עשוי גם להיקבע כמו גם נקודת הזמן בו מתרחש השיא, אם רצונך בכך. לקבוע אם חאן אל שנקבע לתנאי הניסוי הם שונים באופן משמעותי באמצעות בדיקות סטטיסטיות המתאים.
    הערה: מבחן t אינטראקצית עם התיקון של וולש הוחל על התוצאות חאן.

תוצאות

שיטה זו מבוססת על תרבות משותפת פשוטה של היעד תאים סרטניים עם אפקטור CD8+ T תאים, כי יש כבר מראש תרבותי עם או בלי משתיק קול תאים בנוכחות נוגדנים הפעלת אנטי-CD3/CD28. הוא מזהה CD8+ סרטן תא T-induced אפופטוזיס תא לאורך זמן בעקבות תרבות משותפת, ובכך מאפשר הערכת ההשפעות של תאים משתיק קול על cytotoxicity של CD8+ T תאים.

בדרך כלל, תאים סרטניים להגדיל פלורסצנטיות ירוק בגרעין שלהם בעקבות ההפעלה של ביוסנסור קספאז גרעיני פילוח כאשר תאים אלה ליצור קשר עם CD8+ T תאים זה מראש מופעלים על ידי נוגדנים בהיעדר (תאים משתיק קול איור 3; הסרט משלים 1). קרינה פלואורסצנטית ירוק מן המצע קספאז היה לזיהוי לפחות 15 h אחרי אפופטוזיס יזמו. כמה אפופטוזיס ספונטנית של אפקטור CD8+ T תאים נצפתה גם לאורך זמן גם אם תאים אלה היו תרבותי בבידוד (איור 4; הסרט משלים 2). עם זאת, הגרעינים הגדלים של CD8+ T תאים קטנים מאלה של תאים סרטניים, ובכך בתאים אפופטוטיים להיפגע 'אפקטור"יכול לא ייכללו מוות התא 'יעד' נחשב על ידי מהווה גודל התמונה ניתוח שיטת הגבלה (איור 2 , איור 4). למרות כמה תאים סרטניים המטרה להראות צורה מעוגלת קטן ללא קרינה פלואורסצנטית ירוק, זה אינו משפיע על הניתוח כפי תאים אלו עוברים מיטוזה ולא אפופטוזיס (3 הסרט משלים), ולכן אינם נכללים מוות 'יעד' תא מונה על ידי מסיכת חפיפה אדום/ירוק (משלים איור 2). אפופטוזיס ספונטנית של היעד תאים סרטניים מעת לעת מתגלות אפילו בתרבות יחיד (3 הסרט משלים). עם זאת, התרבות שיתוף של היעד סרטן תאים עם מראש הופעל CD8+ T תאים אפופטוזיס תא הגידול גדל מעל הרמות של אפופטוזיס ספונטנית מונוקולטורה של תאים סרטניים (איור 4). באופן כללי, בעת שימוש יחס מיטבי של היעד תאים סרטניים לתאי אפקטור, לשיא במספר של מוות לחסל תאי סרטן יכול להיות שנצפו (איור 5A). שיא זה הוא ברור יותר כאשר הנתונים מבוטאת השבר מוות של האוכלוסייה תא המטרה (איור 5B). בניסוי זה אפופטוזיס הבזליים של היעד תאים סרטניים לשיאה ב- 24 שעות (אפופטוטיים להיפגע שברים = 0.08), אבל CD8+ תא T-induced אפופטוזיס להגיע לרמה המקסימלית ב 17 h (אפופטוטיים להיפגע שברים = 0.66).

עוד מצאנו כי CD8+ T תאים מודגרות מראש עם MAMs או M-MDSCs יכול להפוך קשר עם היעד תאים סרטניים אך קשר זה נראה את התוצאה פחות מקרים של סרטן תאים אפופטוזיס בהשוואה CD8+ T תאים מופעל מראש ללא משתיק קול תאים (איור 3 ו 4 איור; הסרט משלים 4 וסרטים משלים 5). למרות CD8+ T תאים טרום מודגרות עם התאים מיאלואידית מדי פעם המושרה סרטן התא אפופטוזיס, היה שם גם כמה התפשטות של תאים סרטניים המטרה זה לא כבר עוררו במנגנוני במהלך הזמן הניסוי (6 הסרט משלים). השבר שיא של תאים סרטניים מוות בקנה אחד עם הממצאים הללו, תרבותי עם CD8+ T תאים טרום מודגרות עם התאים מיאלואידית (אפופטוטיים להיפגע שבר = 0.38 ב 23 h עבור MDSC-E ו- 0.25-20 h עבור אמא-E) היה נמוך באופן משמעותי מזה של תאים סרטניים בתרבית עם CD8+ T תאים אשר לא היו incubated מראש עם משתיק קול התאים (איור 6).

figure-results-3382
איור 1: ערכת מציג את הליך ניסיוני. CD8 הטחול תמים+ T תאים מתורבתים עם אנטי-CD3/CD28 הפעלת נוגדנים עם או ללא גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAMs) או monocytic מיאלואידית-נגזר משתיק קול תאים (M-MDSCs). אחרי ארבעה ימים, צף CD8+ T תאים נאספים וכוח תרבותי משותף עם היעד תאים סרטניים בנוכחות סובסטרט קספאז-3 fluorogenic. תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע מזוהים תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות בזמן אמת. הראו תמונות נרכשו באמצעות פלטפורמה הדמיה תא חי (עיין טבלה של חומרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4184
איור 2: זיהוי של מוות התאים היעד נפרדות מתאי אפקטור אפופטוטיים להיפגע. תמונה: שורה עליונה רכישה ב ערוץ הצבע האדום מאפשר הזיהוי של גרעיני תא היעד על-ידי היעד איתור מסכת (ניתוח ורוד מסיכה). בשורה האמצעית: תמונות שרכש את הערוץ הירוק לציין אפקטור אפופטוטיים להיפגע ותאי המטרה. מסכת אפופטוזיס מוגבלת Asize (ניתוח טיל מסיכה; גדול מ מיקרומטר 802) מאפשר מוות בודד אפקטור תאים ייכללו הניתוח. שורה תחתונה: הפרדות צבע תמונות אדום הממוזג, ערוצי ירוק עם שלב חדות תמונה (משמאל) או אדום/ירוק חפיפה מסכה (מימין). זיהוי של שותף מקומי, בעל הגבלת גודל פלורסצנטיות ירוק עם פלואורסצנטי אדום (מסיכה ניתוח צהוב), מאפשר זיהוי מדויק יותר של מוות היעד גרעינים (חץ צהוב) על-ידי להוציא אגרגטים של מוות אפקטור תאים (לבן ראשי חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5205
איור 3: האינטראקציה בין CD8+ T תאים ותאים סרטניים. צילומי סטילס מתוך סרטים זמן לשגות נציג של התאים היעד E0771-LG_NLR (T) ותרבותית משותפת עם אפקטור CD8+ T תאים (E) ביחס 4:1 אפקטור/יעד. MDSC-E ואמא-E מציינים אפקטור תאים טרום מודגרות עם M-MDSCs ו- MAMs בהתאמה. מוצגות תמונות ללא הפרדות צבע (כולל תמונות מערוצים ניגודיות, אדום וירוק שלב). ראשי חץ עוקבים אותם התאים דרך שדות שונים נקודות זמן. ראשי חץ צהוב: יעד זה משייך effectors ועוברים ראשי חץ אפופטוזיס, לבן: יעד זה משייך effectors אבל לא עוברים אפופטוזיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6041
איור 4: זיהוי של תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע. שדות נציג שחולצו מן זמן לשגות סרטים ב- 18 h לאחר דימות. תמונות ללא הפרדות צבע (שמאל; ערוצי שלב ניגודיות, אדום וירוק) ותמונות מאדום לתקשר ללא (באמצע) או עם חפיפה (מימין) אדום/ירוק מוצגים מסכת (צהוב). נקודות צהובות בעמודה השמאלית מייצגים מוות תאים סרטניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6654
איור 5: CD8+ תא T-induced סרטן התא אפופטוזיס. (א) מספר מוות תאים סרטניים בתרבית עם אפקטור C8+ T תאים ב אפקטור שונה היעד יחס (E:T)-מוות (B) שבר מאוכלוסיית תא היעד. הנתונים הם אמצעי ± SD. אומר אזור תחת עקומת (AUC) מוצג גם. אינטראקצית t-test עם התיקון של וולש שימש כדי לנתח את חאן אל. * P < 0.0001 בהשוואה E:T = 0:1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7342
איור 6: ההשפעות של גידולים הסתננות התאים מיאלואידית על cytotoxicity של CD8+ T תאים. (א) מספר תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע (המטרה: T) תרבותי עם C8+ T תאים (אפקטור: E)-4:1 של יחס E:T. CD8+ T תאים היו מראש תרבותי היעדרות (עיגול שחור) או נוכחות של תאים monocytic מיאלואידית-נגזר משתיק קול (MDSC-e: כחול מעגל) או גרורות-הקשורים מקרופאגים (MAM-e: עיגול אדום). הנתונים הם אמצעי ± SD. (B) מוות שבר מאוכלוסיית תא היעד. הנתונים הם אמצעי ± SD. מתכוון חאן אל מוצג גם. אינטראקצית t-test עם התיקון של וולש שימש כדי לנתח את חאן אל. * P < 0.0001 בהשוואה ל- T בלבד, #P < 0.0001 בהשוואה ל- E + טי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1. אסטרטגיה חסימה כדי לבודד תאים מדכא סרטן ריאות גרורתי. (A) נקודה נציג מתווה לבודד תאים משתיק קול מיאלואידית נגזר monocytic (M-MDSCs) ו מקרופאגים הקשורים גרורות (MAMs). סף Ly6C רמת להבחין MAMs (Ly6Cנמוכה) ו- M-MDSCs (Ly6Cגבוהה) מבוססת על זו של תושב מכתשי מקרופאגים (RMAC). (B) טוהר ממוינות M-MDSCs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cגבוהה), MAMs (CD45+Ly6G–CD11b+Ly6Cנמוך). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלים באיור 2. תמונות נציג של התאים mitotic היעד. צילומי סטילס מתוך סרטים זמן לשגות נציג של המטרה E0771-LG_NLR מונו-תרבית תאים. העליון: תמונות ללא הפרדות צבע, כולל תמונות מערוצים ניגודיות, אדום וירוק שלב. למטה: תמונות ללא הפרדות צבע (אדום וירוק ערוצים) עם אדום/ירוק חפיפה מסכה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלים איור 3. ההשפעות של גידולים הסתננות התאים מיאלואידית על התפשטות של CD8+ תאי T. (א) נציג היסטוגרמות מציג דילול של תיוג פלורסנט עם CFSE ב CD8+ T תאים. CD8 הטחול תמים+ T תאים היו מבודדים כפי שמתואר פרוטוקול-3 ומוענקת 5 מיקרומטר של CFSE ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. תאי T שכותרתו היו בתרבית בנוכחות il-2 ו anti-CD3/CD28 הפעלת נוגדנים עם או בלי התאים מיאלואידית כפי שמתואר פרוטוקול 4. אחרי ארבעה ימים, זריחה ירוק בתאי T זוהה על ידי זרימה cytometer. (B) חטיבת אינדקס של CD8+ T תאים מחושבים כפי שתואר לעיל17. הנתונים הם אמצעי ± ב- SEM * P < 0.01 בהשוואה לשלוט, #P < 0.05 בהשוואה לαcd3/CD28 השתמשנו אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 1. סרט של דמויות 3 ו- 4; E + טי אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 2. סרט של דמויות 3 ו- 4; אפקטור (E). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 3. סרט של דמויות 3 ו- 4; היעד (T). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 4. סרט של דמויות 3 ו- 4; MDSC-E + טי אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 5. סרט של דמויות 3 ו- 4; אמא-E + טי אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 6. סרט של דמויות 3 ו- 4; אמא-E + T (הפצה). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

שיטה זו מבוססת על שני שלבים נפרדים תרבות משותפת: שיתוף culturing CD8+ T תאים עם פוטנציאל תאים משתיק קול, שיתוף culturing CD8 'מיזוג מראש' של+ T תאים עם היעד תאים סרטניים (איור 1). השלב הראשון של תרבות משותפת הוא די דומה לזה של CD8+ T תא מבחני אי ההפצה הנפוץ כדי לקבוע את ההשפעה של תאים משתיק קול על CD8+ תא T פונקציה. עם זאת, תא T התפשטות לא תמיד לתאם עם cytotoxicity שלהם. לדוגמה, מצאנו את תרבות משותפת עם M-MDSCs או MAMs גדל ולא התפשטות מופחתת של CD8+ T תאים בנוכחות CD3/CD28 הפעלת נוגדנים (משלים איור 3), ואילו אלה מראש ממוזגים CD8+ תאי T הפגינו מופחת cytotoxicity נגד היעד תאים סרטניים (איור 4, איור 5, איור 6). תוצאות אלה להדגיש את חשיבות הערכת פעילות פונקציונלית, שמעידים היעד סרטן התא אפופטוזיס, המוצעים על ידי זה CD8+ assay cytotoxicity תא T.

ב הזה assay, זיהינו את CD8+ T תאים דורש כ 15 h של תרבות משותפת כדי לגרום אפופטוזיס המרבי של תאים סרטניים החלב E0771-LG העכבר (איור 5). עיכוב זה עשוי לנבוע ההשהיה בין הקשר הראשוני של תאים אפקטור עם מטרות הנלווה היווצרות סינפסה המערכת החיסונית, כמו גם משך הזמן הנדרש כדי לגרום מוות אותות שהמטרות כפי שנמדד על-ידי הפעלה של קספאז-3 (1 הסרט משלים ). גם זיהינו מספר תאים סרטניים אפופטוטיים להיפגע הגיעו מישור לאחר 24 שעות, אשר ככל הנראה בשל חיסול של מטרות על-ידי תאי T ו/או אובדן אות פלואורסצנט תאים מתים. יכולת זו כדי לזהות את שעת שיא אפופטוזיס הוא אחד היתרונות של זה וזמינותו מאז קביעת נקודת זמן אופטימלי חשוב להשוואות המתאים בין מצבים שונים. במקרה שלנו, לדוגמה, ההבדל cytotoxicity בין שליטה CD8+ T תאים ו CD8 MDSC/אמא-משכילים+ T תאים היה הרבה יותר גדול ב- 15-18 h לעומת 72 h (איור 5), ובכך נקודת קצה הניסוי באמצעות תקופת הדגירה 72 h יניב תוצאות מטעות.

בנוסף, שיטה זו מאפשרת הדמיה של אינטראקציה בזמן אמת תא אפקטור-כדי-היעד, אשר יספק תובנות המנגנון שבבסיס cytotoxicity מוגבלת של CD8+ T תאים טרום מודגרות עם משתיק קול תאים. לדוגמה, הבחנו כי CD8+ T תאים מודגרות מראש עם M-MDSCs או MAMs נתקל, לבוא במגע עם היעד תאים סרטניים אך לא תמיד לגרום אפופטוזיס (משלים סרט 4, השלמה 5 סרט, 6 הסרט משלים). אמנם אנחנו לא לכמת את האירוע הזה, זה יהיה ריאלי ומעניין לכמת ולהשוות את הפרופורציה של מפגשים וזמן האינטראקציה שלהם מתאם עם אפופטוזיס. יתרון מרכזי נוסף הוא כי שיטה זו דורשת מספר קטן של תאים (למשל, עונה 1 פרק 103 של יעד) ו- 4 x 103 תאים אפקטור לכל טוב. למעשה, פרוטוקול זה יכול להיות עוד יותר מיניאטורי עבור התבנית צלחת 384-ובכן אם רצונך בכך. לכן, וזמינותו הזה מתאים תפוקה גבוהה ההקרנה וניסויים איפה מספרי הטלפון הנייד מוגבלים כגון במבחנה בדיקה באמצעות תאים יקר נגזר מויוו או ex-vivo דגימות.

מצד שני, מגבלה של וזמינותו הנוכחית היא הנוכחות של מספר משמעותי של תאים אפקטור מת, בתנאים מסוימים. על מנת להגביר את הדיוק בהבחנה אפופטוזיס של היעד תאים סרטניים מזו של אפקטור CD8+ T תאים, את הגרעינים של היעד תאים מסומנים ו של גרעין האטום. הגבלת גודל (שתואמות אפקטור תאים) מוחל לניתוח נתונים זה assay (איור 2). עם זאת, קיימים בכמה מקרים שבהם כיסוי של אגרגטים של מוות (ירוק) CD8+ T תאים אל הלא-מוות היעד תאים סרטניים, אשר עשויים לבלבל את התוצאות. מגבלה זו יכולה להיות חמאני השימוש עמודה להסרת תאים מתים על אפקטור תאים לפני תרבות משותפת עם היעד תאים סרטניים, בהנחה מספר מספיק של תאים אפקטור הינם זמינים. עם מערכות מיקרוסקופ מורכב יותר, ייתכן גם שתהיה אפשרות להפחית את הסימן חיובי כוזב על-ידי תיוג של אפקטור CD8+ T תאים עם נבדל האטום תא היעד לבין המצע קספאז-3 fluorogenic fluorophore.

עד כה, פרוטוקול זה יש כבר מנוצל כדי לחקור את ההפעלה שאינם ספציפיים אנטיגן של CD8+ T תאים. למרות MDSCs, תאמי ב microenvironment הגידול לדכא את תא T פונקציות באמצעות מנגנונים שאינם ספציפיים אנטיגן, MDSCs הלימפה ברקמות היקפיים לדכא את תא T תגובות באופן ספציפי אנטיגן18. לחקור פונקציות החיסונית המדכא של סוגי תאים כאלה, וזמינותו התפשטות במבחנה באמצעות CD8+ T תאים מחלון OT-1 העכברים הטרנסגניים הוא נפוץ. ב הזה assay, תאי T OT-1 (לבטא אובלבומין (פשוט) תא T ספציפי קולטן) שיתוף מתורבתים עם משתיק קול MDSCs בנוכחות ביצית פפטידים, אשר ישימה עבור התרבות הראשונה ב- assay cytotoxicity שלנו (כלומר., הפעלה של T תאים ב נוכחות או היעדרות של מדכאי). . זה גם ריאלי לתמרן היעד תאים סרטניים לבטא ביצית, אשר יכול לגרום סרטן אנטיגן ספציפי הרג תא על-ידי תאי T OT-1. לכן, וזמינותו יאפשר גם חקירה של הדיכוי אמא/MDSC-מתווכת של הפעלת תא T אנטיגן ספציפי. . זה גם ניתן להחיל וזמינותו לחקור תאים אנושיים, כמו הפעלת נוגדנים נגד CD3 ואנושי CD28 זמינים מסחרית, פרוטוקול כדי לבודד תאמי האנושי מדגימות קליניים כבר הוקמה19...

באופן קולקטיבי, assay הזה הוא תכליתי מאוד והוא יכול לשמש כדי לבחון את cytotoxicity של סוגי תאים חיסוניים אחרים. כיום, במעבדות שלנו, זה להיות מורחב לבחון תלויי-אנטיגן תא cytotoxicity בתנאים שונים, הוא גם מפותח עבור תפוקה גבוהה ההקרנה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים טרסט (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), בריטניה), את MRC (מר/N022556/1 (JWP, TK), בריטניה). הסוכנים, DDS להכיר התמיכה הלאומית פנוטיפי הקרנת מרכז Phenomics גילוי יוזמה, סרטן מחקר בבריטניה (NOC)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin EDTA (1X)Gibco25300-054
12-Well Cell Culture PlateFreiner Bio-One665-180
1x PBSGibco14190-094
2-mercaptethanolSigmaM6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom TubeFALCON352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )Costar3799Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)Nunc165305Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 AntibodyBIO-RADMCA497A647Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 AntibodyBiolegend100730Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 AntibodyBiolegend102111Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e AntibodyBiolegend100314Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 AntibodyBiolegend100236Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C AntibodyBiolegend128026Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum AlbminSigmaA1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)FALCON352360To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)FALCON352340To filter the lung digestion
DAPIBiolegend422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s MediumGibco41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation KitStemCell Technologies19853
Fetal Bovine SerumGibco10270-106
FITC anti-mouse CD4 AntibodyBiolegend100406Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-UseGibcoA1596-01Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus ReagentEssen BioScience4476Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOMEssen BioScienceDetector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018AEssen BioScienceAnalysis software
L-Glutamine (100X)GibcoA2916801
Lung Dissociation KitMiltenyi130-095-927Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-318
Non-essential amino acid (100X)Gibco11140-035
NucView488Biotium10403Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G AntibodyBiolegend127607Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b AntibodyBiolegend101216Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen StrepGibco15140-122Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 AntibodyBiolegend103132Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)SigmaH9268
PuromycinGibcoA11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)Biolegend420301
Recombinant murine IL-2Peprotech212-12Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)Gibco11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) AntibodyBiolegend101320
 : Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)
 : Green channel excitation: 440 - 480 nm
 : Green channel emission: 504 - 544 nm
 : Red channel excitation: 565-605 nm
 : Red channel emission: 625 - 705 nm

References

  1. Barry, M., Bleackley, R. C. Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death. Nature Reviews in Immunology. 2, 401-409 (2002).
  2. Durgeau, A., Virk, Y., Corgnac, S., Mami-Chouaib, F. Recent advances in targeting CD8 T-cell immunity for more effective cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9. , 14(2018).
  3. Tanaka, A., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy. Cell Research. 27, 109-118 (2017).
  4. Fleming, V., et al. Targeting myeloid-derived suppressor cells to bypass tumor-induced immunosuppression. Frontiers in Immunology. 9, 398(2018).
  5. Cassetta, L., Kitamura, T. Macrophage targeting: opening new possibilities for cancer immunotherapy. Immunology. 155, 285-293 (2018).
  6. Chahroudi, A., Silvestri, G., Feinberg, M. B. Measuring T cell-mediated cytotoxicity using fluorogenic caspase substrates. Methods. 31, 120-126 (2003).
  7. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9, 601-616 (2010).
  8. Azimi, M., et al. Identification, isolation, and functional assay of regulatory T Cells. Immunological Investigation. 45, 584-602 (2016).
  9. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of MDSC: assays, problems and potential solutions. Cancer Immunology Immunotherapy. , (2018).
  10. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4, e6562(2009).
  11. Kitamura, T., et al. Monocytes differentiate to immune suppressive precursors of metastasis-associated macrophages in mouse models of metastatic breast cancer. Frontiers in Immunology. 8, 2004(2018).
  12. Bronte, V., et al. Recommendations for myeloid-derived suppressor cell nomenclature and characterization standards. Nature Communications. 7, 12150(2016).
  13. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. Journal of Experimental Medicine. 212, 1043-1059 (2015).
  14. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. AnticancerResearch. 25, 3905-3915 (2005).
  15. Choppa, P. C., et al. Multiplex PCR for the detection of Mycoplasma fermentans, M. hominisandM. penetransin cell cultures and blood samples of patients with chronic fatigue syndrome. Molecular and Cellular Probes. 12, 301-308 (1998).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology. , Appendix 3:Appendix 3B (2001).
  17. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68, 1489-1498 (2016).
  18. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune system. Nature Reviews in Immunology. 9, 162-174 (2009).
  19. Cassetta, L., et al. Isolation of mouse and human tumor-associated macrophages. Advances in Experimental Medicine and Biology. 899. 899, 211-229 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143CD8 Tcytotoxicity

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved