Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated⁺ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Resumo

Potencialização da capacidade tumor-matança de CD8⁺ T células nos tumores, juntamente com sua infiltração do tumor eficiente, é um elemento-chave de sucesso imunoterapias. Vários estudos têm indicado que células mieloides infiltrante tumor (por exemplo, células supressoras mieloide-derivado (MDSCs) e macrófagos tumor-associado (TAMs)) suprimem a citotoxidade de CD8⁺ T no microambiente do tumor e o direcionamento de células Estas células mieloides regulamentares podem melhorar imunoterapias. Aqui, apresentamos um sistema de ensaio in vitro para avaliar imunes efeitos supressivos de monocítica-MDSCs e TAM sobre a capacidade do tumor-matança de CD8⁺ T células. Para este fim, nós primeiro culto ingênuo esplênica CD8⁺ T células com ativação anticorpos anti-CD3/CD28 na presença ou ausência de células supressoras e em seguida co cultivadas as células T pré-ativado com células de câncer de alvo na presença de um fluorogenic substrato de caspase-3. Fluorescência de substrato em células de câncer foi detectada por microscopia de fluorescência em tempo real como um indicador da apoptose de células T-celular induzida por tumor. Neste ensaio, com sucesso podemos detectar o aumento da apoptose de células de tumor por CD8⁺ T células e sua supressão pela pré-cultura com Prof de fisica ou MDSCs. Este ensaio funcional é útil para investigar CD8⁺ T mecanismos de supressão de células por células mieloides regulamentares e identificando alvos druggable de superá-lo através do rastreio de alto rendimento.

Introdução

É sabido que CD8⁺ T células podem eliminar células tumorais, quando elas exercem sua citotoxicidade completa. Após a ativação do receptor de células T (TCR), CD8⁺ T células proliferam e se diferenciar em células citotóxicas efetoras. O CD8 expandida e ativado⁺ T células secretam grânulos citotóxicos, incluindo perforina e granzymes, que são transferidos para células-alvo e iniciar vários caminhos líticas como caspase-3 mediada por apoptose¹. CD8⁺ T células podem também induzir apoptose de células de tumor activando os receptores em células-alvo, tais como os receptores de fator de necrose tumoral-α (TNF-α), apoptose primeiro sinal ligand (FasL), ou relacionados com TNF ligante de indução de apoptose (pista). Além disso, o CD8 ativado⁺ T células secretam interferon-γ (IFN-γ) que pode suprimir a proliferação de células do tumor e aumentar a sensibilidade das células do tumor para CD8⁺ T células através da regulação de FasL receptor¹. Dado o potencial para CD8⁺ T estabeleceram-se a capacidade de abate de tumor, várias estratégias para aumentar sua citotoxidade (por exemplo, inibidores de ponto de verificação, vacinação de câncer e transferência adoptiva do receptor de antígeno Quimérico (carro) expressando as células T) e mostrados efeitos terapêuticos significativos em determinados tipos de câncer². No entanto, acumular evidências sugere que células de tumor infiltrando imune tais como pilhas de T reguladoras, supressor mieloide-derivado de células (MDSCs) e macrófagos tumor-associado (TAMs) podem suprimir CD8⁺ T funções de pilha e restringir a eficácia de imunoterapias^3,4,5. Para melhorar tais imunoterapias, é importante entender o limite de células imunes como supressores CD8⁺ citotoxidade de células T. A identificação de CD8⁺ célula T mecanismos de repressão, bem como druggable alvos para superá-lo, exigirá o desenvolvimento e a utilização de ensaios in vitro.

O método padrão ouro de medição CD8⁺ citotoxidade de células T é o ensaio de liberação de cromo em que o lançamento da sonda radioativa (⁵¹Cr), da target células que lysed por CD8⁺ T células, determinado⁶. No entanto, este ensaio tem várias desvantagens, incluindo sensibilidade relativamente baixa, fundo elevado, incapacidade para detectar cedo apoptotic eventos, problemas de eliminação perigosos e compatibilidade limitada com manipulação automatizada de líquido e deteção de apoio aplicações de taxa de transferência maiores. Um outro método comum é análises de fluxo cytometric em que a apoptose de células tumorais de alvo é detectado pelo anexina V ligação⁷. Neste ensaio, é possível detectar outros parâmetros tais como a morte de célula de destino usando iodeto de propidium (PI) ou 7-aminoactinomycin D (7-AAD) e ativação de células efetoras, indicada pela expressão CD107a ou CD69, além a apoptose em células alvo⁷ . No entanto, este ensaio requer um grande número de células supressoras, comparados com o ensaio de liberação de cromo. Também exige o desprendimento e a desagregação das células alvo aderentes e isto pode influenciar os resultados. Com efeito, o cromo liberar fluxo cytometric do ou ensaio não são comumente usados para investigar os efeitos de célula supressor sobre as funções de células T. Em vez disso, a medição da proliferação de células T, indicada pela diluição de uma tintura fluorescente (por exemplo, CFSE) pré-carregada em células T é frequentemente usada para avaliar a inibição de CD8⁺ função de células T por células supressoras. Detecção de produção de IFN-γ de culturas de células T é outro método padrão para avaliar os efeitos de células supressoras na ativação de células T^8,9. No entanto, os resultados desses ensaios não necessariamente se correlacionam à célula alvo matando capacidade de CD8⁺ T células.

Apresentamos aqui um ensaio funcional alternativo para avaliar efeitos de células supressoras, particularmente de macrófagos em tumores metastáticos, sobre a citotoxidade de CD8⁺ T células. Este método determina a citotoxidade de CD8⁺ T células, pre-cultivadas com ou sem as células supressoras na presença de anticorpos anti-CD3/CD28 de activação através da detecção de apoptose de células do tumor, indicaram por fluorescência de uma fluorogenic caspase-3 automatizado de substrato⁶ usando microscopia de lapso de tempo (Figura 1). Este protocolo tem várias vantagens em comparação com outros métodos; requer apenas um pequeno número de células, permite a detecção de morte de células do tumor aderentes com alta sensibilidade, pode imagem interação efetor-alvo em tempo real e é passível de rastreio de alto rendimento.

Neste protocolo, macrófagos associada a metástase (mamas) e suas progenitoras monocítica-MDSCs (M-MDSCs) isoladas de tumores metastáticos em camundongos são usados como células supressoras. Em modelos do rato do cancro da mama metastático, uma população distinta de macrófagos caracterizada como F4/80^altaLy6G^–CD11b^altaLy6C^baixa se acumula no pulmão contendo tumores metastáticos. Esta população de macrófagos é raramente encontrada no pulmão normal e assim chamada macrófagos associada a metástase (mamas)¹⁰. Nestes modelos de rato, outro mieloide célula população, definida como F4/80^altaLy6G^–CD11b^altaLy6C^alta, também acumula-se predominantemente no pulmão metastático onde dá origem a mamas¹¹. Baseado em suas características, as CD11b^altaLy6C^alta MAM células progenitoras podem representar MDSCs M¹².

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo ratos foram realizados em conformidade com o licenciado permissão do escritório Home do Reino Unido (P526C60B3). Informações sobre equipamentos e reagentes comerciais estão listados na Tabela de materiais.

1. preparação das células alvo que expressam a proteína fluorescente vermelha em seus núcleos

1. Obter uma linhagem de células de câncer de rato de alvo de uma fonte apropriada.
   Nota: No presente protocolo, são utilizados um derivado altamente metastático do E0771 do mouse tumor mamário células (E0771-LG)¹³ . Parental E0771 células originam-se de camundongos C57BL/6¹⁴.
2. Descongelar e manter um frasco de células E0771-LG com de Dulbecco modificado águias médio (DMEM) incluindo a 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂.
   Nota: É deve confirmar que as células são negativas para o micoplasma. Para este fim, cultura de células de E0771 (ou células a serem testadas) por 2-3 dias, como descrito acima (na ausência de antibióticos e antimicóticos), coletar 500 μL de meio de cultura. Centrifugue o meio a 12.419 x g durante 60 s para eliminar detritos celulares e transferir o sobrenadante para tubos novos. Determinar a contaminação de micoplasma, usando um kit de teste de micoplasma comercialmente disponíveis (consulte a Tabela de materiais) e/ou PCR¹⁵ seguindo as instruções do fabricante.
3. Células de³ E0771-LG semente 5 x 10 por bem em uma placa de 12 e cultura que de células com 10% (v/v) FBS-DMEM durante a noite em uma incubadora a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂.
   Nota: Se a taxa de proliferação das células alvo é baixa (tempo duplicação da população maior que 36 h), o número de células pode ser aumentado para 1 x 10⁴.
4. Substituir o meio com 1 mL de 10% (v/v) FBS-DMEM, incluindo 10 polybrene μg/mL e adicionar 25 μL de particulas de Lentivirus (1 x 10⁶ TU/mL) codificação um nuclear restrita da proteína fluorescente vermelha (mKate2, consulte a Tabela de materiais).
5. Cultura de células para 24h na incubadora a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂.
6. Substituir o meio com 10% (v/v) FBS-DMEM e cultura das células por 24-48 h em uma incubadora a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂.
7. Substitua o meio com 10% (v/v) FBS-DMEM incluindo 1 puromicina μg/mL, quando as células começam a expressar a proteína fluorescente vermelha e cultura das células até que estejam confluente de 80-90%.
   Nota: Concentração de puromicina será diferente entre tipos de células alvo e deve ser otimizada utilizando células transfectadas un.
8. Subcultura o sobrevivente células para passagens de 1-3, com 10% (v/v) FBS-DMEM incluindo 1 puromicina μg/mL e cryopreserve ações em um sistema de armazenamento de fase de vapor de nitrogênio líquido até o uso.

2. isolamento de células de supressor de tumores em ratos

Nota: No presente protocolo, células supressoras (ou seja, mamas e M-MDSCs) são isoladas do pulmão contendo tumores metastáticos estabelecidos pelas células E0771-LG. Condições para a dissociação de tecido e célula classificação devem ser otimizadas para isolar as células de diferentes tecidos.

1. Injete na veia da cauda de syngeneic (C57BL/6), fêmea, 7-10 semanas os ratos, 1 x 10⁶ células de câncer (E0771-LG).
2. Após 14 dias, isolar o pulmão contendo tumores metastáticos e preparar suspensões de célula única dos pulmões perfundidos através de digestão enzimática, como descrito anteriormente,¹¹.
   Nota: No presente protocolo, quatro ratos são injetados com células de câncer e seus pulmões metastáticos são combinados para obter células supressoras do suficiente.
3. Incubar as suspensões de célula única com anticorpos CD16/CD32 anti-rato 30 min no gelo e mancha com anticorpos fluorescentes para CD45, F4/80, CD11b, Ly6C e Ly6G (consulte a Tabela de materiais) para outro 30 min^{10,11 , 13}.
4. Lavar as células coradas com 1 mL de PBS contendo 2% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) e ressuspender o pellet de células com 500-1000 µ l de PBS contendo 2% (p/v) BSA.
5. Adicionar 3 μM de DAPI e classificar M-MDSCs (CD45 DAPI^–++Ly6G de F4/80^–CD11b^altaLy6C^alta) e mamas (CD45 DAPI^–++Ly6G de F4/80^–CD11b^alta Ly6C^baixo) usando um classificador de pilha (complementar a Figura 1).
   Nota: O limite de nível de Ly6C para distinguir mamas (Ly6C^baixo) e M-MDSCs (Ly6C^alta) é baseado de macrófagos alveolares residentes (RMAC). A pureza das células classificadas é medida através de citometria de fluxo com uma pureza esperada de mais de 90%.
6. Ressuspender as células classificadas com 400 μL de DMEM contendo 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, aminoácido não-essencial de 1% (v/v), piruvato de sódio de 1 mM e 50 nM 2-mercaptoetanol (chamado enriquecido-DMEM, E-DMEM).
7. Contar o número de células vivas, usando o método de exclusão azul Trypan¹⁶ e ajustar a 2 x 10⁶ células/mL, com E-DMEM.
8. Manter as células no gelo até o uso.

3. isolamento de CD8⁺ T células do baço de ratos

1. Isole o baço de um rato que é syngeneic para a linhagem de células de câncer alvo (i.e., camundongos C57BL/6 neste protocolo) da seguinte forma:
   1. Eutanásia do animal por inalação de CO₂ .
   2. Coloque o animal em um tabuleiro de dissecação limpo e limpe a pele com álcool etílico 70% (v/v).
   3. Cortar a pele abdominal usando uma tesoura para expor o baço
   4. Isolar o baço, que se encontra inferior ao estômago, e colocá-lo num tubo contendo 5 mL de PBS gelado.
2. Usando o êmbolo interior de uma seringa estéril 5 mL, moa o baço em um coador de célula 100 μm conjunto em um tubo de 50 mL.
3. Passe as células através do filtro com total 10 mL de PBS.
4. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 337 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante.
5. Ressuspender as células em 1 mL de PBS contendo EDTA 2 mM e 0,5% (p/v) BSA (executando o tampão) e filtrar através de um filtro de célula 40 μm.
6. Contar o número de células vivas e ajustar a 1 x 10⁸ células/mL usando o buffer de execução.
   Nota: Manter uma pequena alíquota de células como uma amostra de pré-enriquecimento para uma verificação da pureza.
7. Enriquecer para CD8⁺ T células usando um kit de seleção negativa e um classificador magnético (consulte a Tabela de materiais).
   1. Transferi 1 x 10⁸ (1ml) das células splenocytes para um tubo de fundo redondo de poliestireno 5 mL.
   2. Adicionar 50 μL de anticorpos biotinilado e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
   3. Adicionar 125 µ l de grânulos magnético estreptavidina conjugada e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
   4. Adicionar 1,325 mL de tampão em execução e misture suavemente pipetando.
   5. Colocar o tubo no ímã e incubar a temperatura ambiente por 2,5 min.
   6. Pegue o ímã e despeje a suspensão de eritrócitos enriquecido em um tubo de novo.
8. Ressuspender as células enriquecidas com 200 μL de E-DMEM (i. e., DMEM contendo 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, aminoácido não-essencial de 1% (v/v), piruvato de sódio 1 mM e 50 nM 2-Mercaptoetanol).
9. Contar o número de células vivas e ajustar a 2 x 10⁶ células/mL, com E-DMEM. Manter as células a 37 ° C em uma CO₂ incubadora até o uso.
   Nota: Manter uma pequena alíquota de células como uma amostra de pós-enriquecimento para uma verificação da pureza.
10. Determinar a pureza de CD8⁺ T células por citometria de fluxo, como segue:
    1. Tomar 1 x 10⁴ células de pré-enriquecimento (passo 3.6) ou amostras pós-enriquecimento (passo 3.9) e ajustar o volume total de cada um para 100 μL usando buffer corrente.
    2. Incubar as suspensões de célula única com anticorpos CD16/CD32 anti-rato 30 min no gelo e mancha com anticorpos fluorescentes para CD45, CD3, CD4 e CD8 (consulte a Tabela de materiais) para mais 30 minutos.
    3. Lavar as células coradas com 500 µ l de PBS contendo 2% (p/v) BSA e ressuspender o pellet de células com 500-1000 µ l de PBS contendo 2% (p/v) BSA.
11. Adicionar 3 μM de DAPI e determinar a porcentagem de CD3⁺CD4^–CD8 na CD45 total células^{+ +} população da pilha.

4. ativação e expansão do CD8 isolado⁺ T células

1. Alíquota 1 x 10⁵ células por 50 μL CD8⁺ T células (preparadas no passo 3.9) em poços de uma placa de fundo U 96.
2. Adicionar 1 x 10⁵ células por 50 células supressoras do μL (preparadas na etapa 2.7) ou 50 μL de E-DMEM nos poços.
3. Prepare o meio de ativação que consiste em E-DMEM, fator colônia-estimulando do 4 x 10⁴ U/mL 1 (CSF-1), interleucina-2 U/mL 240 (IL-2), 8 anticorpo de CD3ε de anti-rato μg/mL e 16 anticorpo de CD28 de anti-rato μg/mL.
   Nota: CSF-1 não é necessária para a ativação de células T, mas é essencial para a sobrevivência de células supressoras neste protocolo (ou seja, mamas e M-MDSCs). Assim, ele é mantido na co-cultura de células T com as células cancerosas de alvo para manter a consistência nas condições de cultura. Desde que o CSF-1 é encontrado em concentrações de nano-molar em todos os tecidos e é necessário para a viabilidade de monócitos/macrófagos in vivo é um contexto fisiológico para essas células.
4. Adicionar 50 μL de meio de ativação (passo 4.3) e 50 μL de E-DMEM com ou sem reagentes para ser testado.
5. Colocar a placa em uma incubadora a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂ e cultura das células por 4 dias.

5. instalação de co-cultura de alvo células com CD8 pré-activated⁺ T células

1. Adicionar 30 μL de matriz diluídos reduzido crescimento fator solúvel membrana basal de 1: 100 (Tabela de materiais) em poços da placa de 96 poços de fundo plano apropriado para microscopia e incubar a 37 ° C numa incubadora de CO₂ pelo menos 1 h.
2. Prepare-se nas células-alvo (ou seja, as células E0771-LG expressando a proteína fluorescente vermelha nuclear restrita).
   1. Incube as celulas alvo com 1 mL de tripsina/EDTA de 0,05% à temperatura ambiente por 1 min e colher as células pipetando suave.
   2. Adicionar 9 mL de DMEM, incluindo 10% (v/v) FBS e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 337 x g por 5 min.
   3. Ressuspender as células com 500 μL de E-DMEM e contar o número de células vivas.
      Nota: Antes de contar as células alvo, filtre as células através de um filtro de célula 40μm para produzir a suspensão de célula única.
   4. Ajustar a densidade de 2 x 10⁴ células/mL (= 1 x 10³ células por 50 μL) adicionando E-DMEM e manter as células no gelo.
3. Preparar células efetoras (i.e., pré-activated CD8⁺ T células).
   1. Ressuspender as células em um poço da placa de 96 poços (etapa 4.5) completamente por pipetagem e transferência o CD8 flutuante⁺ T células em um novo tubo de 1,5 mL.
      Nota: Mamas e M-MDSCs firmemente aderem ao poço e não são desanexados o pipetando.
   2. Para coletar as células restantes, adicionar 200 µ l de PBS no poço e transferir para o tubo na etapa 5.3.1.
   3. Lavar as células com 1 mL de E-DMEM uma vez (centrifugar 337 x g) por 5 min, Aspire e descartar o sobrenadante) e ressuspendê-los com 100 μL de E-DMEM.
   4. Contar o número de células vivas (usando o método de exclusão trypan azul), ajustar a densidade de 1,6 x 10⁵ células/mL (= 4 x 10³ 25 células/μL) e manter as células no gelo.
4. Aspire a matriz de membrana basal de cada poço da placa na etapa 5.1.
5. Adicione 1 x 10³ células/50 μL de células alvo (etapa 5.2.4) em cada poço e misture bem.
   Nota: Para evitar efeitos de borda devido a evaporação do meio, só os interiores 60 poços de 96 o bom prato deve ser usado para análise.
6. Adicione 25 μL de E-DMEM incluindo 4 x 10³ U/mL IL-2 e substrato de caspase-3 fluorogenic 10 μM (consulte a Tabela de materiais).
7. Adicionar 4 x 10³ células/25 μL de CD8⁺ T células (passo 5.3.4) em poços de apropriado e misture bem.
   Nota: A presença de muitas células em um poço dificulta a análise. Neste modelo, um efetor de 4:1: relação de destino (célula total número 5 x 10³ células/poço) era ideal, mas uma proporção de 8:1 era suboptimal. Poços, contendo os seguintes quatro controles são necessários para ajudar com a análise dos dados: atingir células usado para os poços de co-cultura (1 x 10³ células/poço) médio com e sem substrato de caspase-3, a densidade de células efetoras (1 x 10³ células / Bem) no meio com e sem substrato de caspase-3.
8. Adicione 200 µ l de PBS ou água esterilizada em todos os poços vazios (particularmente poços na periferia da placa) para reduzir a evaporação do meio de poços experimentais.
9. Coloque a placa em um microscópio de fluorescência de lapso de tempo que é mantido a 37 ° C, umidade de 95% e 5% de CO₂.
   Nota: Agitar a placa em forma de cruz para distribuir de maneira uniforme todas as células e então deixar a placa permanecer à temperatura ambiente em uma superfície plana para 10-20 min antes de transferir para a incubadora.

6. imagem latente das células

Nota: As configurações de aquisição de imagem detalhada pode variar com o microscópio e fluorophores usado; os seguintes parâmetros de aquisição geral devem ser empregados para obter melhores resultados.

1. Usando uma rotina de autofocus apropriado no microscópio, adquira imagens cobrindo pelo menos 25% da superfície total em cada poço experimental da placa de 96 poços.
2. Definir o microscópio para adquirir imagens de contraste de fase, bem como um canal fluorescente apropriado para a nuclear restrita vermelha proteína fluorescente (mKate2) e um canal de apropriado para o fluorogenic verde fluorescente ativado caspase-3 de substrato (com excitação em 488 nm) (Figura 2).
3. Capture imagens em poços experimentais em contraste de fase e os 2 canais fluorescentes cada 1 a 3 h pelo menos 72 h.

7. análise de imagem usando software de análise de imagem

Nota: As configurações de análise de imagem detalhada pode variar com o software utilizado (consulte Tabela de materiais); os seguintes procedimentos de análise geral devem ser empregados para obter melhores resultados.

1. Determinar se espectral un-mistura é necessária para separar o sinal fluorescente emitido por núcleos de células alvo do que emitida por núcleos apoptotic e se necessário, criar um protocolo de análise para realizar isso;
   1. Vista um controle bem contendo apenas nas células-alvo (mkate2-rotulado) em meio sem substrato de caspase-3 no canal verde fluorescente.
   2. Observar se a fluorescência verde está sendo emitida pelos núcleos do vermelhos (núcleos aparecem verdes)
   3. Se a fluorescência verde é aparente nos núcleos, acessar o controle de misturar espectral no software da imagem latente e aumentar o percentual de vermelho removido do verde até o sinal verde desaparece (em nossa experiência, este é geralmente 6-7% para mKate2 brilhante fluorescência).
   4. Se a fluorescência verde não é apreciada em qualquer núcleos, sem desagregação espectral é necessário.
      Nota: Este teste espectral de correção errados pode também ser efectuada usando um poço de células alvo em meio contendo substrato de caspase-3. No entanto, geralmente há um nível muito baixo de espontânea apoptose em células alvo (menos de 10%), resultando em alguns núcleos de células alvo emitindo fluorescência verde devido à ativação de caspase-3, ao invés de fluorescência sangramento através de. Sangria de fluorescência verdadeiro através de é evidente nestas condições quando fluorescência verde é apreciada em todos os núcleos.
   5. Visualize um controle bem contendo células efetoras única (núcleos unlabeled) em meio sem substrato de caspase-3 no canal vermelho e verde, individualmente.
   6. Observe se a fluorescência verde ou vermelha está sendo emitida por núcleos. Se nem vermelha, nem verde fluorescência é aparente nos canais individuais sem desagregação espectral é necessário.
      Nota: na nossa experiência, o mouse CD8⁺ T células não são autofluorescente e, assim, sem desagregação espectral é necessário para estas células. Este teste de correção de misturar espectral também pode ser realizada usando um poço de células efetoras em meio contendo substrato de caspase-3. No entanto, geralmente há algum nível de apoptose espontânea resultando em núcleos de células efetoras emitindo fluorescência verde devido à ativação de caspase-3. Sangria de fluorescência verdadeiro através de é evidente nestas condições quando fluorescência verde é apreciada em todos os núcleos.
2. Use um método de subtração de fundo de fluorescência (por exemplo, TopHat), com os parâmetros relevantes para o exemplo, para resolver os objetos fluorescentes em ambos os canais fluorescentes.
   Nota: No canal verde usamos TopHat (raio de núcleos = 10,0 limiar de fluorescência µm, verde = 0,7 unidades de calibração verde). No canal vermelho, usamos TopHat (raio de núcleos = 10,0 limiar de fluorescência µm, vermelho = 0,5 unidades de calibração vermelho).
3. Use parâmetros apropriados para borda de divisão para resolver individuais núcleos fluorescentes.
   Nota: Nós não usamos borda dividindo no canal de fluorescência verde ou vermelho.
4. Use imagens no canal vermelho dos poços contendo apenas nas células-alvo (com substrato de caspase) para determinar o tamanho mínimo dos núcleos de alvo.
   Nota: Usamos 80 µm².
5. Use imagens em canal verde dos poços contendo apenas células efetoras (com substrato de caspase) para determinar o tamanho médio dos núcleos de effector apoptotic.
   Nota: O único núcleos de effector apoptotic variou de 40 a 80 µm² nesses experimentos.
6. Instituir um procedimento de análise para contar o número de núcleos de células alvo fluorescente usando uma restrição de tamanho mínimo adequado (por exemplo, a área mínima, diâmetro mínimo) (Figura 2, máscara de deteção do alvo).
   Nota: Usamos uma área mínima de núcleos (fluorescência vermelha) = 80 µm².
7. Instituir um procedimento de análise para contar o número de núcleos apoptotic que são maiores que o tamanho médio dos núcleos de effector apoptotic (Figura 2, máscara de tamanho restrito apoptose).
   Nota: O filtro de tamanho foi definido como 80 µm² (ou seja, somente áreas de fluorescência verde maior que este tamanho foram contadas, excluindo assim os núcleos de effector apoptotic único ). Usar estes parâmetros aumenta a precisão da análise na contagem do núcleo de células apoptóticas alvo , embora alguns agregados de células efetoras de apoptotic podem ser contados.
8. Instituir um procedimento de análise para contar o número de apoptose nas células-alvo através da contagem de núcleos onde vermelho fluorescente sinal (da etapa 7,6) e restrições de tamanho verde fluorescente (da etapa 7,7) significativamente co localizar (Figura 2, R Máscara de sobreposição/g).
   Nota: Uma localização co adequada pode variar de 30% a 100% do tamanho médio dos núcleos de alvo. Filtro de tamanho de sobreposição foi definido para 40 µm².
9. Determine o número de núcleos de células apoptóticas alvo, bem como o número de núcleos de células alvo dos poços para cada condição experimental ao longo de todo tempo.

8. análise de dados usando cálculo e software de gráficos

1. O número de núcleos de células alvo apoptotic obtido na etapa 7,9 ao longo do tempo todo para os poços experimentais do gráfico. Se vários poços foram usados para cada condição experimental, apresente graficamente os resultados como média ± desvio padrão.
2. Calcule a fração de apoptotic da população de células-alvo, dividindo o número de células apoptóticas em cada poço pelo número de células-alvo em cada poço em cada ponto de tempo.
3. Gráfico dos resultados obtidos na etapa 8.2.
4. Determine a área sob a curva (AUC) de cada curva. A fração de apoptotic pico da população para cada curva também pode ser determinada bem como o ponto de tempo em que o pico ocorre, se desejado. Determine se o AUC determinada para as condições experimentais são significativamente diferentes, utilizando testes estatísticos adequados.
   Nota: O teste t não pareado com correção de Welch foi aplicado aos resultados AUC.

Resultados

Este método é baseado na simples co-cultura de células de câncer de alvo com efetoras CD8⁺ T células que têm sido pre-cultivadas com ou sem células supressoras na presença de activação anticorpos anti-CD3/CD28. Ele detecta o CD8⁺ câncer de células T-induzida apoptose celular ao longo do tempo seguindo co-cultura, permitindo assim a avaliação dos efeitos de células supressoras na citotoxicidade de CD8⁺ T células.

Normalmente, as células cancerosas aumentam fluorescência verde em seus núcleos na sequência de ativação de um biossensor de caspase nuclear-direcionamento quando estas células fazem contato com CD8⁺ T células que são pre-ativado por anticorpos na ausência de supressor células ( Figura 3; Filme complementar 1). Fluorescência verde de caspase substrato foi detectável pelo menos 15 h depois de apoptose foi iniciado. Alguns apoptose espontânea de efetoras CD8⁺ T células também foi observada ao longo do tempo, mesmo se essas células foram cultivadas em isolamento (Figura 4-; Filme complementar 2). No entanto, tamanhos de núcleos de CD8⁺ T células são menores do que as das células cancerosas e, portanto, células apoptóticas 'efetoras' podem ser excluídas da apoptose celular 'destino' conta por um tamanho restrição imagem método de análise (Figura 2 e Figura 4). Embora algumas células cancerosas do alvo mostram uma pequena forma arredondada sem fluorescência verde, isso não afeta a análise como essas células estão passando por mitose, ao invés de apoptose (complementar 3 de filme) e, portanto, estão excluídas do apoptotic 'destino' contagens de células por uma máscara de sobreposição vermelho/verde (complementar a Figura 2). Apoptose espontânea das células cancerosas de destino é ocasionalmente encontrado nem na cultura única (complementar Movie 3). No entanto, a cultura co de câncer alvo células com CD8 pré-activated⁺ T células apoptosis da pilha tumor aumento acima dos níveis de apoptose espontânea em monocultura das células cancerosas (Figura 4). Geralmente, quando se utiliza uma óptima relação alvo de células de câncer de células efetoras, um pico no número de células de câncer de alvo de apoptotic pode ser observado (Figura 5A). Este pico é mais distinto quando os dados é expressa como a fração de apoptotic da populacao de celula alvo (Figura 5B). Neste experimento o basal apoptose de células tumorais de alvo atingiu um pico de 24 h (com fração de apoptotic = 0,08), mas o CD8⁺ apoptose induzida por células T atingiu um nível máximo às 17h (com fração de apoptotic = 0,66).

Encontramos mais que CD8⁺ T células pré-incubadas com mamas ou M-MDSCs poderiam fazer contato com as células cancerosas do alvo mas este contato parecia resultar em menos instâncias da apoptose de células de câncer comparado com CD8⁺ T células pré-ativado sem células supressoras (Figura 3 e Figura 4; Filme complementar 4 e complementar filme 5). Embora o CD8⁺ T células pré-incubadas com as células mieloides ocasionalmente induzida apoptose de células de câncer, havia também alguns proliferação das células cancerosas de destino que não tem sido estimulado a sofrer apoptose durante o tempo da experimento (6 complementar do filme). Consistente com esses achados, a fração de pico de células de câncer de apoptotic cultivadas com CD8⁺ T células pré-incubados com células mieloides (fração apoptotic = 0,38 às 23h para MDSC-E e 0,25 a 20 h para MAM-E) foi significativamente menor do que as células cancerosas cultivadas com CD8⁺ T células que não foram previamente incubadas com as células supressoras (Figura 6).

Figura 1: um esquema mostrando o procedimento experimental. CD8 esplênica ingênuo⁺ T células são cultivadas com os anticorpos anti-CD3/CD28 ativando com ou sem metástase-associado macrófagos (mamas) ou supressor monocítica mieloide derivada de células (M-MDSCs). Após 4 dias, flutuando CD8⁺ T células são coletadas e co cultivadas com células de câncer alvo na presença de fluorogenic caspase-3 de substrato. Apoptose de células de câncer são detectadas sob microscopia de fluorescência em tempo real. Imagens mostradas foram adquiridas utilizando uma plataforma de célula de imagem ao vivo (consulte a Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: identificação de apoptose nas células-alvo distintas de células efetoras de apoptotic. Top de linha: imagem aquisição no canal vermelho permite a identificação dos núcleos de células alvo por máscara de deteção do alvo (máscara de análise-de-rosa). Fila do meio: imagens adquiridas em canal verde indicam células efetoras e alvo de apoptotic. Máscara de apoptose restrito Asize (análise teal máscara; superior a 80 µm²) permite único apoptotic células efetoras ser excluídas da análise. Linha inferior: composto de imagens vermelho mesclado e verdes canais com imagem de contraste de fase (à esquerda) ou vermelho/verde sobreposição de máscara (à direita). Identificação de fluorescência verde co localizada, tamanho restrito com fluorescência vermelha (máscara de análise amarelo), permite a detecção mais precisa de apoptotic núcleos alvo (seta amarela), excluindo os agregados de células efetoras de apoptotic (branco pontas de seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Interação entre CD8⁺ T células e células cancerosas. Alambiques de filmes de lapso de tempo representativos das células alvo E0771-LG_NLR (T) co cultivadas com efetoras CD8⁺ T células (E) na proporção de 4:1. o efetor/alvo. MDSC-E e MAM-E indicam células efetoras pré-incubados com M-MDSCs e mamas, respectivamente. São mostradas imagens compostas (incluindo imagens de canais verde, vermelho e contraste de fase). Pontas de seta seguem as mesmas células através dos campos diferentes e pontos de tempo. Setas de amarelo: um alvo que associa efetores e sofre apoptose, branco setas: um alvo que associa efetores, mas não sofre apoptose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: deteção das células cancerosas de apoptotic. Representante campos extraídos de lapso de tempo filmes a 18 h após a imagem. Imagens compostas (esquerda; canais de verde, vermelho e contraste de fase) e imagens de red canal sem (médio) ou com sobreposição (à direita) vermelho/verde máscara (amarelo) são mostrados. Pontos amarelos na coluna da direita representam as células cancerosas apoptotic. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: CD8⁺ induzida por células T câncer apoptosis da pilha. (A) número de células cancerosas de apoptotic cultivadas com effector C8⁺ T células em diferentes efetores à relação de destino (E:T). (B) Apoptotic fração da populacao de celula alvo. Dados são meios ± SD. quer dizer área sob a curva (AUC) também é mostrada. Unpaired t-teste com correção de Welch foi usado para analisar o AUC. * P < 0,0001 comparado com E:T = 0:1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Efeitos de células mieloides tumor infiltrando na citotoxicidade de CD8⁺ T células. (A) número de células de câncer de apoptotic (alvo: T) cultivadas com C8⁺ T células (efetor: E) a 4:1 da relação E:T. CD8⁺ T células pre-foram cultivadas na ausência (círculo preto) ou presença de células supressoras monocítica-mieloide derivados (MDSC-e: azul círculo) ou macrófagos associada a metástase (MAM-e: círculo vermelho). Dados são meios ± SD. (B) Apoptotic fração da populacao de celula alvo. Dados são meios ± SD. dizer AUC também é mostrado. Unpaired t-teste com correção de Welch foi usado para analisar o AUC. * P < 0,0001 comparado ao T apenas, ^#P < 0,0001 comparado a I + g. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Figura 1. Retenção de estratégia para isolar as células supressoras do pulmão metastático. (A) representante ponto parcelas para isolar as células supressoras de mieloide-derivado monocítica (M-MDSCs) e macrófagos associada a metástase (mamas). O limite de nível de Ly6C para distinguir mamas (Ly6C^baixo) e M-MDSCs (Ly6C^alta) é baseado de macrófagos alveolares residentes (RMAC). (B) pureza das M-MDSCs classificadas (CD45⁺Ly6G^–CD11b⁺Ly6C^alta) e mamas (CD45⁺Ly6G^–CD11b +Ly6C^baixo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar Figura 2. Imagens representativas de células mitóticas alvo. Alambiques de filmes de lapso de tempo representativos da mono-cultura de células alvo E0771-LG_NLR. Top: imagens compostas incluindo imagens de canais verde, vermelho e contraste de fase. Fundo: imagens compostas (canais vermelho e verdes) com máscara de sobreposição vermelho/verde. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar Figura 3. Efeitos de células mieloides tumor infiltrando na proliferação de CD8⁺ células T. (A) representante histogramas mostrando a diluição de rotulagem fluorescente com CFSE em CD8⁺ T células. CD8 esplênica ingênuo⁺ T células foram isoladas, conforme descrito no protocolo-3 e rotuladas com 5 µM de CFSE a 37 ° C por 15 min. As pilhas de T etiquetadas foram cultivadas na presença de IL-2 e anti-CD3/CD28 activando anticorpos com ou sem pilhas myeloid, conforme descrito no protocolo n º 4. Após 4 dias, fluorescência verde em células T foi detectada pelo citômetro de fluxo. (B) índice de divisão de CD8⁺ T células calculada como descrito anteriormente,¹⁷. Dados são meios ± SEM. * P < 0,01 comparado ao controle, ^#P < 0.05 em comparação com αCD3/CD28 AB. clique aqui para baixar este arquivo.

Filme complementar 1. Filme de figuras 3 e 4; I + g. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar filme 2. Filme de figuras 3 e 4; Efetor (E). Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar filme 3. Filme de figuras 3 e 4; Alvo (T). Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme complementar 4. Filme de figuras 3 e 4; MDSC-E + T. Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme complementar 5. Filme de figuras 3 e 4; MAM-E + T. Clique aqui para baixar este arquivo.

Complementar filme 6. Filme de figuras 3 e 4; MAM-E + T (proliferação). Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este método baseia-se em duas etapas distintas co-cultura: co cultivo CD8⁺ T células com potencial células supressoras e cultivo co o CD8 'pré-condicionado'⁺ T células com células de tumor do alvo (Figura 1). O primeiro passo de co-cultura é bastante semelhante de CD8⁺ T normalmente usados para determinar o efeito de células supressoras na CD8 de ensaios de proliferação de células⁺ função de célula T. No entanto, proliferação de células T não sempre se correlaciona com sua citotoxicidade. Por exemplo, nós encontramos aquele co-cultura com M-MDSCs ou mamas aumentou ao invés de reduzida proliferação de CD8⁺ T células na presença de CD3/CD28 activando anticorpos (complementar a Figura 3), Considerando que estas pre-condicionado CD8⁺ Células T demonstraram redução citotoxicidade contra células de câncer de alvo (Figura 4, Figura 5, Figura 6). Esses resultados destacam a importância da avaliação da atividade funcional, evidenciada pelo alvo câncer apoptosis da pilha, oferecidos por este CD8⁺ ensaio de citotoxicidade de células T.

Neste ensaio, nós identificamos que CD8⁺ T células requer aproximadamente 15 h de co-cultura para induzir apoptose máxima de células de tumor mamário de rato E0771-LG (Figura 5). Este atraso pode ser devido a defasagem entre o contato inicial de células efetoras com alvos e acompanhamento formação sinapse imunológica, bem como o tempo necessário para induzir sinais apoptotic em alvos como medido pela ativação de caspase-3 (complementar 1 filme ). Também identificamos que o número de células tumorais de apoptotic alcançado um platô após 24 h, que é provavelmente devido à eliminação de alvos por células T e/ou perda de sinal fluorescente de células mortas. Esta capacidade para identificar o tempo de pico apoptose é uma das principais vantagens deste teste, desde que a determinação de um ponto de tempo ideal é importante para comparações adequadas entre diferentes condições. No nosso caso, por exemplo, a diferença de citotoxicidade entre controle CD8⁺ T células e CD8 MDSC/MAM-educado⁺ T células era muito maior a 15-18 h em comparação com 72 h (Figura 5), e, portanto, um ponto de extremidade experimento usando um período de incubação de 72 h produziria resultados enganosos.

Esse método também permite a visualização da interação em tempo real células efetoras-ao-alvo, que proporcionaria maiores insights sobre o mecanismo subjacente a citotoxicidade limitada de CD8⁺ T células pré-incubados com células supressoras. Por exemplo, observamos que CD8⁺ T células pré-incubadas com M-MDSCs ou mamas encontrada e interagiu com células de tumor do alvo, mas não sempre induz a apoptose (complementar Movie 4, complementar filme 5, 6 complementar do filme). Embora nós não quantificar esse evento, seria viável e interessante para quantificar e comparar a proporção de encontros e seu tempo de interação em correlação com a indução de apoptose. Outra grande vantagem é que este método exige um pequeno número de células (por exemplo, 1 x 10³ do alvo) e 4 x 10³ de células efetoras por bem. Na verdade, este protocolo pode ser ainda mais miniaturizado para o formato de placa 384 se desejado. Portanto, este ensaio é apropriado para experiências e rastreio de alto rendimento onde celulares são limitados, tais como em vitro testes usando células preciosas derivado em vivo ou ex vivo amostras.

Por outro lado, uma limitação do ensaio atual é a presença de um número significativo de células efetoras morto em algumas condições. A fim de aumentar a precisão na distinção entre apoptose de células cancerosas de destino dos efetoras CD8⁺ T células, os núcleos das células são rotuladas de destino e uma restrição de tamanho (o que exclui as células efetoras) é aplicada para análise de dados no presente de núcleos ensaio (Figura 2). No entanto, existem alguns casos onde a sobreposição de agregados de apoptotic (verde) CD8⁺ T células em apoptose não alvo as células cancerosas, que podem confundir os resultados. Essa limitação poderia ser atenuada pelo uso de uma coluna de remoção de células mortas na prévia de células efetoras à cultura co com pilhas do tumor do alvo, assumindo um número suficiente de células efetoras está disponível. Com sistemas mais complexos de microscopia, também pode ser possível reduzir o sinal positivo falso de rotulagem a CD8 efetoras⁺ T células com um fluoróforo distinto dos núcleos de célula de destino e o substrato de caspase-3 fluorogenic.

Até agora, este protocolo tem sido utilizado para investigar a ativação de específico de antígeno de CD8⁺ T células. Embora MDSCs e TAMs no microambiente do tumor suprimem funções de células T através de mecanismos de antígeno específico, MDSCs nos tecidos linfoides periféricos suprimem respostas de células T em um antígeno específico maneira¹⁸. Para investigar as funções imunológicas supressivas tais tipos de células, um ensaio de proliferação in vitro usando CD8⁺ T células de OT-1 ratos transgénicos é comumente usado. Neste ensaio, as células de OT-1 T (expressando o receptor de célula T específica de ovalbumina (OVA)) são co cultivadas com supressor MDSCs na presença de peptídeos de óvulos, que é aplicável para a primeira cultura no nosso ensaio de citotoxicidade (i. e., em células a ativação de T a presença ou ausência de supressores). Também é possível manipular as células de câncer de alvo para expressar os óvulos, que podem induzir a matança de célula de câncer antígeno-específicas por pilhas de T de OT-1. Portanto, o ensaio também permitirá a investigação do MAM/MDSC-mediada supressão da ativação da pilha de T antígeno-específicas. Também é possível aplicar o ensaio para investigar as células humanas, como ativação de anticorpos contra humanos CD3 e CD28 é comercialmente disponível, e um protocolo para isolar TAMs humanas de amostras clínicas tem sido estabelecido¹⁹.

Coletivamente, este ensaio é bastante versátil e pode ser usado para examinar a citotoxicidade de outros tipos de células imunes. Atualmente, em nossos laboratórios, está sendo estendido para examinar a citotoxicidade celular dependente de antígeno sob diferentes condições e é também está sendo desenvolvido para alto throughput screening.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm