실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

요약

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한⁺ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

초록

CD8의 종양-죽이 능력의 potentiation⁺ T 세포 종양 그들의 효율적인 종양 침투 함께 성공적인 immunotherapies의 핵심 요소입니다. 여러 연구 결과 종양 침투 골수성 세포 (예: 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs) 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam))의 CD8 세포 독성 억제 표명⁺ T 세포 종양 microenvironment 및 그 대상 이러한 규제 골수성 세포 immunotherapies를 개선할 수 있습니다. 여기, 선물이 CD8의 종양 살해 능력에 monocytic MDSCs와 Tam의 면역 진압 효과 평가 하는 체 외 분석 결과 시스템⁺ T 세포. 이 위해, 우리는 먼저 순진한 교양 비장 CD8⁺ T 억제기 세포의 유무에서 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 세포 그리고 다음 공동 대상 암 세포는 fluorogenic의 존재를 미리 활성화 된 T 세포 배양 caspase 3 기판입니다. 암 세포에 기판에서 형광 T 세포 유도 된 종양 세포 apoptosis의 지표로 서 실시간 형광 현미경 검사 법에 의해 발견 되었다. 이 분석 결과에서 우리가 성공적으로 CD8에 의해 종양 세포 apoptosis의 증가 검색할 수 있습니다⁺ T 세포와 Tam 또는 MDSCs 사전 문화에 의해 그것의 억제. 이 기능 분석 결과 조사 CD8 유용⁺ T 억제 메커니즘 규제 골수성 세포 및 높은 처리량 검열을 통해 그것을 극복 하기 위해 식별 druggable 대상에 셀.

서문

그것은 알려져 그 CD8⁺ T 그들은 그들의 전체 세포 독성을 발휘 하는 때 세포 종양 세포를 제거할 수 있습니다. T 세포 수용 체 (TCR) CD8의 활성화 후⁺ T 세포 증식과 세포 독성 효과 기 세포로 분화. 확장 되 고 활성화 된 CD8⁺ T 세포를 perforin 등 대상 셀으로 전송 됩니다 caspase 3 apoptosis¹중재와 같은 다양 한 용균성 경로 시작 하는 granzymes 세포 독성과 립 분 비. CD8⁺ T 세포 수 또한 유도 종양 세포 apoptosis 종양 괴 사 인자-α (TNF-α)에 대 한 수용 체 등 대상 세포에 수용 체를 활성화 하 여 첫 번째 apoptosis 신호 ligand (FasL), 또는 apoptosis 유도 ligand TNF 관련 (흔적). 또한, 활성화 된 CD8⁺ T 세포 분 비 인터페론-γ (IFN-γ) 종양 세포 증식을 억제 하 고 CD8 종양 세포의 감도 증가 시킬 수 있는⁺ T 세포를 통해 업 레 귤 레이 션 FasL 수용 체¹의. CD8에 대 한 잠재력을 감안할 때⁺ T 종양 살해 능력, 그들의 세포 독성 (예를 들어, 검사점 억제제, 암 예방 접종, 그리고 공상 항 원 수용 체 (자동차) 표현 하는 T 세포의 입양 전송)를 강화 하는 몇 가지 전략 설립 되었습니다 그리고 특정 유형의 암²에 표시 된 중요 한 치료 효과. 그러나, 규정 하는 T 세포와 같은 세포 종양 침투 면역, 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs), 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) CD8 억제 수 있습니다 제안 증거를 축적⁺ T 세포 기능 및 효능을 제한 immunotherapies^3,,45. 이러한 immunotherapies을 개선 하기 위해, 그것은 어떻게 면역 억압 셀 제한 CD8 이해 해야⁺ 세포 독성 T 세포. CD8 식별⁺ T 세포 억제 메커니즘 뿐만 아니라 druggable 목표, 그것을 극복 하기 위해 개발 및 생체 외 분석 실험의 활용이 필요 합니다.

CD8 측정 하는 표준 방법은⁺ 세포 독성 T 세포는 크롬 릴리스 분석 결과는 대상에서 방사성 조사 (⁵¹Cr)의 릴리스 세포 CD8에 의해 lysed는⁺ T 세포, 결정⁶. 그러나,이 분석 결과 상대적으로 낮은 감도, 높은 배경, 초기 apoptotic 이벤트, 유해 처리 문제, 그리고 자동된 액체 처리와 검색을 지원 하기 위해 제한 된 호환성을 감지 하는 무 능력을 포함 하 여 몇 가지 단점이 있다 더 높은 처리량 응용 프로그램입니다. 또 다른 일반적인 방법은 흐름 cytometric 분석 대상 종양 세포의 apoptosis annexin V⁷을 바인딩 하 여 감지 합니다. 이 분석 결과에서 그것은 목표 세포 죽음 propidium 요오드 화물 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAD)와 이펙터 세포 활성화 대상 셀^{7에에서 apoptosis 이외에 CD107a 또는 CD69 식으로 표시를 사용 하 여 같은 다른 매개 변수를 검색할 수} . 그러나,이 분석 결과 크롬 방출 분석 결과에 비해 억압 세포의 많은 수를 요구 한다. 그것은 또한 분리 및 부착 대상 셀의 피의 요구 하 고이 결과 편견 수 있습니다. 실제로 크롬 릴리스 분석 결과 또는 흐름 cytometric 분석 결과 T 세포 기능에 억압 셀 효과 조사 하기 위해 일반적으로 사용 되지 않습니다. 대신, T 세포에 미리 로드 되는 형광 염료 (예를 들어, CFSE)의 희석으로 표시 하는 T 세포 확산의 측정 자주는 CD8의 억제 평가⁺ 억제기 세포 T 세포 기능. 경작된 한 T 세포에서 IFN-γ 생산의 T 세포 활성화^8,9에 억압 셀의 효과 평가 하기 다른 표준 방법입니다. 그러나, 이러한 분석에서 결과 않습니다 반드시 연관 되지 죽이 CD8의 능력 목표 셀⁺ T 세포.

우리는 여기에 CD8 세포 독성 억제 세포, 특히 전이성 종양에서 세포의 효과 평가 하는 대체 기능 분석 결과 제시⁺ T 세포. 이 방법은 결정의 CD8 세포 독성⁺ T 세포, 종양 세포 apoptosis를 감지 하 여 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체 존재 유무를 교양 사전 fluorogenic caspase 3에서 형광으로 표시 기판⁶ 을 사용 하 여 자동 시간 경과 현미경 (그림 1). 이 프로토콜은; 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 그것은 셀 수가 적은 필요, 높은 감도와 부착 종양 세포 죽음의 탐지를 가능 하 게, 실시간 이펙터 대상 상호 작용 이미지 수 이며 높은 처리량 검열 의무가.

이 프로토콜에 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)와 그들의 조상 monocytic-MDSCs (M MDSCs) 생쥐에서 전이성 종양에서 고립 된 억압 셀으로 사용 됩니다. 전이성 유방암의 마우스 모델에서 대 식 세포의 뚜렷한 인구 특징 F4/80^높은Ly6G^-CD11b^높은Ly6C^낮은 축적 전이성 종양을 포함 하는 폐에. 이 대 식 세포 인구 정상적인 폐에서 자주 발견 이며 따라서 라는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)¹⁰. 이 마우스 모델에서 다른 골수성 세포 인구, 정의 F4/80^높은Ly6G^-CD11b^높은Ly6C^높은, 또한 축적 주로 어디 그것을 생겨나게 MAMs¹¹전이성 폐에서. 그들의 특성을 바탕으로, CD11b^높은Ly6C^높은 어머니 조상 세포 M-MDSCs¹²를 나타낼 수 있습니다.

프로토콜

관련 된 생쥐에 실시 했다 모든 절차 허가 영국 홈 오피스 (P526C60B3)에서 허가. 상업적인 시 약 및 장비에 대 한 정보 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.

1. 그들의 핵에 빨간색 형광 단백질을 표현 하는 대상 셀의 준비

1. 적절 한 소스에서 대상 마우스 암 세포 라인을 얻을.
   참고:이 프로토콜에서 E0771 마우스 유 방 종양 세포 (E0771-LG)¹³ 의 높은 전이성 파생 사용 됩니다. 보호자 E0771 셀 C57BL/6 마우스¹⁴에서 시작 됩니다.
2. 해 동 고와 Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM) 37 ° C, 습도 95%, 5% CO₂에서 셀 문화 인큐베이터에서 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하 여 E0771-LG 셀의 유리병을 유지 합니다.
   참고: 그것은 확인 되어야 한다 세포는 mycoplasma에 대 한 부정적. 이 위해, 2-3 일 문화 매체의 수집 500 μ (없을 경우에 항생제와 antimycotics), 위에서 설명한 대로 E0771 셀 (또는 셀 테스트) 문화. 12,419 x g 60에 매체 원심 세포 파편을 제거 하 고 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하는 s. Mycoplasma 오염 상용 mycoplasma 테스트 키트를 사용 하 여 결정 ( 테이블의 자료를 참조) 또는 PCR¹⁵ 제조업체의 지침에 따라.
3. 12 잘 플레이트, 그리고 문화에서 37 ° C, 습도 95%, 5% CO₂배양 기에서 하룻밤 사이 10% (v/v) FBS DMEM 셀에 잘 당 씨앗 5 x 10³ E0771-LG 셀.
   참고: 대상 셀의 확산 속도가 낮은 경우 (인구 36 h 보다 큰 시간을 두 배로), 1 x 10⁴셀의 수를 늘릴 수 있습니다.
4. 10% (v/v) FBS DMEM 10 μ g/mL polybrene를 포함 하 여 1 mL와 매체를 대체 하 고 추가 25 μ lentiviral 입자 (1 x 10⁶ 화/mL)의 빨간 형광 단백질을 제한 핵 인코딩 (mKate2, 테이블의 자료를 참조).
5. 37 ° C, 습도 95%와 5% CO₂배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 문화.
6. 10% (v/v) FBS DMEM 매체를 대체 하 고 37 ° C, 습도 95%와 5% CO₂배양 기에서 24-48 h에 대 한 셀을 문화.
7. 10% (v/v) FBS DMEM 셀 시작 빨간 형광 단백질을 표현 하 고 그들은 80-90% 합칠 때까지 셀 문화 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 매체를 바꿉니다.
   참고: puromycin의 농도 목표 세포 유형 사이 다른 되며 취소 transfected 세포를 사용 하 여 최적화 합니다.
8. Subculture에 살아남은 10% (v/v) FBS DMEM 1 μ g/mL puromycin를 포함 하 여 1-3 구절에 대 한 세포 및 사용까지 주식 액체 질소 증기 위상 스토리지 시스템에 cryopreserve.

2. 마우스에서 종양의 억제 세포의 고립

참고:이 프로토콜에서 억압 셀 (즉, MAMs M MDSCs) E0771-LG 셀에 의해 설립 하는 전이성 종양을 포함 하는 폐에서 격리 됩니다. 조직 분리와 세포 분류는 다른 조직에서 세포를 분리 최적화 되어야 합니다.

1. 1 x 10⁶ 암 세포 (E0771-LG) syngeneic (C57BL/6), 여성, 7-10 주 오래 된 쥐의 꼬리 정 맥에 주사.
2. 14 일 후 전이성 종양을 포함 하는 폐를 분리 하 고 앞에서 설명한¹¹으로 효소 소화를 통해 perfused 폐에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.
   참고:이 프로토콜에서 4 개의 마우스는 주입 암 세포 그리고 그들의 전이성 폐 충분 한 억제기 세포를 얻기 위해 결합 됩니다.
3. 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분^10,11 CD45, F4/80, CD11b, Ly6C, 및 Ly6G ( 테이블의 자료를 참조)에 형광 성 항 체와 얼룩 ^{, 13}.
4. 포함 하는 2% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA), PBS의 1 mL를 한번 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단.
5. DAPI의 3 μ M를 추가 및 정렬 M MDSCs (DAPI^-CD45⁺F4/80⁺Ly6G^-CD11b^높은Ly6C^높은)와 MAMs (DAPI^-CD45⁺⁺Ly6G F4/80^-CD11b^높은 Ly6C^낮은) 셀 정렬 (보충 그림 1)를 사용 하 여.
   참고: MAMs (Ly6C^낮은)와 M-MDSCs (Ly6C^높은) 구별을 Ly6C 수준 임계값 기반 거주 치경 대 식 세포 (RMAC)의. 정렬된 셀의 순도 90% 이상의 예상된 순수성을 가진 cytometry 통해 측정 됩니다.
6. 20% (v/v) FBS, 1% (v/v) 페니실린/스, 2 m L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, m 및 50 nM 2-mercaptoethanol (농축 DMEM, E DMEM 라는) 포함 된 DMEM의 400 μ와 정렬된 셀 resuspend
7. Trypan 블루 제외 방법¹⁶ 를 사용 하 여 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 10⁶ 셀/E DMEM mL를 조정 합니다.
8. 사용까지 얼음에 셀을 계속.

3. 절연 CD8의⁺ T에서 쥐의 비장 세포

1. 다음과 같이 대상 암 세포 라인 (즉, 이 프로토콜에 C57BL/6 쥐)에 syngeneic은 마우스에서 비장 격리:
   1. CO₂ 흡입 하 여 동물을 안락사.
   2. 깨끗 한 절 개 보드에 동물을 놓고 70% (v/v) 에탄올과 피부를 닦아.
   3. 가 위를 사용 하 여 비장을 노출 하는 복 부 피부를 잘라
   4. 비장, 위장에 열 등 한 위치, 분리 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 튜브에 배치.
2. 살 균 5 mL 주사기의 내부 플런저를 사용 하 여 100 μ 셀 거르는 50 mL 튜브에 설정에 비장 갈기.
3. PBS의 총 10 mL를 사용 하 여 필터를 통해 세포를 전달 합니다.
4. 337 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음.
5. 1 ml의 PBS 2 mM EDTA와 0.5% (w/v) BSA (버퍼를 실행 하는)를 포함 하는 셀 펠 릿 resuspend 고 40 μ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링 합니다.
6. 라이브 셀 수를 계산 하 고 1 x 10⁸ 셀/ml 실행 버퍼를 사용 하 여 조정 합니다.
   참고: 작은 유지 순도 검사에 대 한 사전 농축 샘플 셀의 aliquot.
7. CD8을 풍요롭게⁺ T 세포의 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 자기 정렬 ( 테이블의 자료를 참조).
   1. Splenocytes 셀의 5 mL 폴리스 티 렌 라운드 하단 튜브 1 x 10⁸ (1 mL)을 전송.
   2. Biotinylated 항 체의 50 μ를 추가 하 고 10 분 동안 실내 온도에 품 어.
   3. 활용 하는 streptavidin 자석 구슬의 125 μ를 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   4. 버퍼, 실행의 1.325 mL을 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합.
   5. 자석에 튜브를 배치 하 고 2.5 분 동안 실 온에서 품 어.
   6. 자석를 선택 하 고 새 튜브로 풍부한 세포 현 탁 액을 붓는 다.
8. 200 μ E DMEM의 풍부한 셀 resuspend (즉,., 20% (v/v) FBS, 포함 된 DMEM 1% (v/v) 페니실린/스, 2 mM L-글루타민, 1% (v/v) 비 필수 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate, 및 50 nM 2-mercaptoethanol).
9. 라이브 셀의 수를 계산 하 고 2 x 10⁶ 셀/E DMEM mL를 조정 합니다. 셀 37 ° C에서 CO에₂ 인큐베이터까지 계속 사용.
   참고: 작은 유지 순도 검사 후 농축 샘플 셀의 aliquot.
10. CD8의 순도 결정⁺ T 세포 cytometry에 의해 다음과 같이:
    1. 사전 농축 (단계 3.6)에서 1 x 10⁴ 의 세포 또는 후 농축 (단계 3.9) 샘플을가지고 고 실행 버퍼를 사용 하 여 100 μ를 각각의 총 볼륨을 조정.
    2. 얼음에 30 분 동안 반대로 마우스 CD16/CD32 항 체와 단일 셀 정지 품 어 하 고 또 다른 30 분을 CD45, CD3, CD4, CD8 ( 테이블의 자료를 참조) 형광 항 체와 얼룩.
    3. 2% (w/v) BSA를 포함 하는 PBS의 500 μ와 스테인드 셀을 세척 하 고 다시 2% (w/v) BSA 포함 하는 PBS의 500-1000 μ와 셀 펠 릿을 일시 중단.
11. DAPI의 3 μ M을 추가 하 고 c d 3의 비율을 결정⁺CD4^-CD8 총 CD45에 셀^{+ +} 세포 인구.

4. 활성화 및 격리 된 CD8의 확장⁺ T 세포

1. 50 μ 당 aliquot 1 x 10⁵ 세포 CD8⁺ T U-하단 96 잘 접시의 우물으로 (단계 3.9에서에서 준비) 세포.
2. (단계 2.7에서에서 준비) 50 μ 억제기 세포 당 1 x 10⁵ 셀 추가 또는 우물에의 전자 DMEM 50 μ.
3. E-DMEM, 4 × 10⁴ U/mL 식민지 자극 요소 (CSF-1) 1, 240 U/mL interleukin-2 (일리노이-2), 8 μ g/mL 반대로 마우스 CD3ε 항 체, 및 16 μ g/mL 반대로 마우스 CD28 항 체의 구성 된 정품 인증 매체를 준비 합니다.
   참고: CSF-1 T 세포 활성화를 위해 필요 하지 않습니다 하지만이 프로토콜 (MAMs 및 M MDSCs) 억제기 세포의 생존을 위해 필수적 이다. 따라서, 그것은 문화 조건에 일관성을 유지 하기 위해 대상 암 세포와 T 세포의 공동 문화에 그대로 유지 됩니다. CSF-1 나노-모 랄 농도 모든 조직에서 발견 되 고 monocyte/대 식 세포 생존 vivo에서, 필요 때문이이 셀에 대 한 생리 적 맥락 이다.
4. 50 μ 활성화 중간 (단계 4.3)의 추가 함께 또는 테스트 시 약 없이 전자 DMEM의 50 μ.
5. 37 ° C, 습도 95%, 5% CO₂ 에서 인큐베이터에 접시를 놓고 4 일 셀 문화.

5. 설치 대상의 공동 문화의와 전 활성화 한 CD8 세포⁺ T 세포

1. 1: 100 희석된 증가율 감소 성 지하실 멤브레인 매트릭스 (자료 테이블)의 30 μ 플랫 바닥 96 잘 접시 현미경 검사 법, 적합의 우물에 추가 하 고 적어도 1 시간에 대 한 CO₂ 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
2. 대상 셀 (즉, E0771-LG 제한 핵 빨간 형광 단백질을 표현)을 준비 합니다.
   1. 1 분 동안 실 온에서 0.05 %trypsin / EDTA의 1 mL와 대상 셀을 품 어 그리고 부드러운 pipetting으로 세포를 수확.
   2. DMEM 10% (v/v) FBS를 포함 하 여 9 mL을 추가 하 고 5 분 동안 337 x g 에 세포 현 탁 액을 원심.
   3. 다시 E-DMEM의 500 μ 셀을 일시 중지 및 라이브 셀 수 있습니다.
      참고: 계산 하기 전에 대상 셀 필터링 셀 단일 세포 현 탁 액을 생산 하는 40μm 셀 스 트레이너를 통해.
   4. E-DMEM을 추가 하 여 2 × 10⁴ 셀/mL (= 당 50 μ 1 x 10³ 셀)를 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속.
3. 효과 기 세포를 준비 (즉, 전 활성화 CD8⁺ T 세포).
   1. Resuspend⁺ T pipetting, 전송 부동 CD8 철저 하 여 96 잘 접시 (4.5 단계)의에 셀 새로운 1.5 mL 튜브에 세포.
      참고: MAMs M MDSCs 단단히 잘 준수와 pipetting에 의해 분리 되지.
   2. 남아 있는 세포를 수집 하려면 우물에 PBS의 200 μ를 추가 하 고 단계 5.3.1에서에서 튜브로 전송 합니다.
   3. 셀 E DMEM 한번 (337 x g에서 원심 분리기)의 1 mL을 5 분, 발음 그리고 세척 상쾌한 삭제), E-DMEM의 100 μ와 resuspend 및.
   4. (Trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여) 라이브 셀의 수를 계산, 1.6 x 10⁵ 셀/mL (= 4 x 10³ 셀/25 μ), 밀도 조정 하 고 얼음에 셀을 계속.
4. 5.1 단계에서 격판덮개의 각 우물에서 지하실 멤브레인 매트릭스 발음
5. 각 잘으로 대상 셀 (5.2.4 단계)의 1 x 10³ 셀/50 μ를 추가 하 고 잘 혼합.
   참고: 잘 매체, 96의 내부 60 우물만의 증발 때문에 지 효과 피하기 위해 접시는 분석을 위해 사용 될 해야 합니다.
6. 25 μ E DMEM 4 x 10³ U/mL 일리노이-2와 10 μ M fluorogenic caspase 3 기판 ( 테이블의 자료를 참조)를 포함 하 여의 추가 합니다.
7. 4 x 10³ 셀/25 μ CD8의 추가⁺ T 세포 (단계 5.3.4)에 우물에 적절 한와 섞어 잘.
   참고: 잘에서 너무 많은 세포의 존재 때문에 분석 더 어렵다. 이 모델, 4:1 이펙터: 대상 비율 (총 셀 번호 5 x 10³ 셀/잘) 최적 이었지만 8:1 비율 차선. 웰 스는 다음과 같은 네 개의 컨트롤을 포함 하는 데이터 분석을 원조 하는 데 필요한: 셀 공동 문화 웰 스 (1 x 10³ 셀/잘) 매체와 caspase 3 기판 없이 사용 밀도에서 이펙터 (1 x 10³ 셀을 대상 / 잘)와 caspase 3 기판 없이 매체에.
8. 실험적인 우물에서 매체의 증발을 줄이기 위해 모든 빈 우물 (접시의 주변에서 특히 우물)에 PBS 또는 살 균 물 200 μ를 추가 합니다.
9. 37 ° C, 습도 95%, 5% CO₂에서 유지 되는 시간 경과 형광 현미경으로 접시를 설정 합니다.
   참고: 균등 모든 셀, 크로스-패턴에 접시를 흔들어 고 인큐베이터에 전송 하기 전에 10-20 분에 대 한 평평한 표면에 실내 온도에 유지 하는 접시.

6. 셀의 이미징

참고: 자세한 이미지 수집 설정 현미경 및 사용; fluorophores 달라 집니다. 다음 일반 인수 매개 변수는 최적의 결과 대 한 고용 한다.

1. 현미경에 적합 한 자동 루틴을 사용 하 여, 96 잘 접시의 각 실험 잘에서 총 면적의 적어도 25%를 덮고 이미지 획득.
2. 현미경 단계 대조로 형광 채널 제한 핵 빨간 형광 성 단백질 (mKate2)에 대 한 적합 한 이미지를 설정 하 고 녹색 fluorogenic에 대 한 적합 한 형광 채널 활성화 (caspase 3 기판 여기에서 488 nm) (그림 2).
3. 단계 대조에 적어도 72 h에 대 한 모든 1 ~ 3 h 2 형광 채널 실험 우물에서 이미지를 캡처하십시오.

7. 이미지 분석 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여

참고: 자세한 이미지 분석 설정을 사용 하는 소프트웨어와 함께 달라 집니다 ( 테이블의 자료를 참조); 최적의 결과 대 한 다음과 같은 일반적인 분석 절차를 채택 한다.

1. 스펙트럼 확인 취소 혼합 분리 형광 신호에서 대상 셀 핵에서 방출 되는 apoptotic 핵에서 방출 되 고 필요한 경우이; 분석 프로토콜을 설정 하는 데 필요한
   1. 보기 컨트롤 잘만 대상 세포 (mkate2 표시 된) 녹색 형광 채널에서 caspase 3 기판 없이 매체에 포함 된.
   2. 녹색 형광 적색 핵 (핵 표시 녹색)에 의해 방출 되는 여부 관찰
   3. 핵에서 녹색 형광 이면 액세스 이미징 소프트웨어에 스펙트럼 unmixing 제어 및 녹색에서 녹색 신호 사라질 때까지 제거 하는 빨간색의 비율 증가 (우리의 경험에서는, 이것은 일반적으로 밝은 mKate2에 대 한 6-7% 형광)입니다.
   4. 녹색 형광 어떤 핵에서 명백 하지 않으면 아무 스펙트럼 unmixing은 필요 합니다.
      참고:이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 또한 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 대상 셀의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 통해 형광 보다는 caspase 3 출혈의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 몇 가지 대상 셀 핵 인 대상 세포 (10% 미만), 자발적인 apoptosis의 매우 낮은 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다.
   5. 빨강 및 녹색 채널에 caspase 3 기판 없이 매체에 잘만 효과 기 세포 (핵 레이블 없음)를 포함 하는 컨트롤을 개별적으로 볼.
   6. 녹색 또는 빨간색 형광 핵에 의해 방출 되는 여부를 관찰 합니다. 빨간색도 녹색 형광은 개별 채널에 아무 스펙트럼 unmixing 경우 필요.
      참고: 우리의 경험, CD8 마우스에서⁺ T 세포는 자동 형광 이며 따라서 아무 스펙트럼 unmixing이 세포에 필요한. 이 스펙트럼 unmixing 보정 테스트 매체 포함 된 caspase 3 기판에에서 효과 기 세포의 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 자발적인 apoptosis caspase 3의 활성화 때문에 녹색 형광을 방출 하는 이펙터 세포 핵에 결과의 몇 가지 수준이 이다. 통해 진정한 형광 흘릴 때 녹색 형광은 모든 핵에서 이러한 조건 하에서 분명 하다.
2. 형광 두 채널에 형광 개체를 해결 하려면 샘플에 대 한 관련 매개 변수 형광 배경 빼기 메서드 (예: TopHat)를 사용 합니다.
   참고: 녹색 채널에 우리 사용 TopHat (핵 반지름 = 10.0 µ m, 녹색 형광 임계값 = 0.7 녹색 교정 단위). 빨강 채널에서 TopHat 사용 (핵 반지름 = 10.0 µ m, 빨간색 형광 임계값 = 0.5 레드 보정 단위).
3. 가장자리-분할에 대 한 적절 한 매개 변수를 사용 하 여 개별 형광 핵 해결.
   참고: 우리가 가장자리에 녹색 또는 빨간색 형광 채널 분할을 사용 하지 않았다.
4. 이미지를 사용 하 여 대상 핵의 최소 크기를 결정 (caspase 기판)와 대상 셀만 포함 하는 우물에서 빨강 채널에서.
   참고: 우리는 80 µ m²를 사용합니다.
5. Apoptotic 이펙터 핵의 평균 크기를 결정 (caspase 기판)와 이펙터 셀만 포함 하는 우물에서 녹색 채널에서 이미지를 사용 합니다.
   참고: 단일 apoptotic 이펙터 핵이이 실험에서 40-80 µ m² 에서 배열 했다.
6. (예를 들어, 최소 공간, 최소 직경) 적절 한 최소 크기 제한을 사용 하 여 형광 대상 세포 핵의 수를 계산 하는 분석 절차 설정 (그림 2, 대상 검출 마스크).
   참고: 우리가 사용 하는 최소 핵 지역 (레드 형광) = 80 µ m².
7. Apoptotic 핵 apoptotic 이펙터 핵 (그림 2, 크기 제한 apoptosis 마스크)의 평균 크기 보다 큰 수를 계산 하는 분석 절차를 설정 합니다.
   참고: 크기 필터 80 µ m² 로 설정 (즉, 유일한 지역 녹색 형광이이 크기 보다 큰의 세어 졌다, 따라서 단일 apoptotic 이펙터 핵을 제외). 이러한 매개 변수를 사용 하 여 apoptotic 효과 기 세포의 일부 집계 계산 될 수 있지만 apoptotic 대상 셀 핵 계산에서 분석의 정확도 증가 한다.
8. 분석 절차를 설정 apoptotic 대상 셀 의 수를 계산 하는 핵을 계산 하 여 어디 (에서 단계 7.6) 빨간 형광 신호 및 (단계 7.7)에서 녹색 형광 신호 크기 제한 크게 공동 지역화 (그림 2, R /G 중복 마스크)입니다.
   참고: 적절 한 공동 지역화 대상 핵의 평균 크기의 100%를 30%에서 범위 수 있습니다. 오버랩 크기 필터 40 µ m²로 설정 되었습니다.
9. 전체 시간에 걸쳐 apoptotic 대상 세포 핵의 수 뿐만 아니라 각 실험 조건에 대 한 우물에 대상 세포 핵의 수를 결정 합니다.

8. 데이터 분석 사용 하 여 계산 하 고 그래프 소프트웨어

1. Apoptotic 대상 셀 핵 실험 웰 스에 대 한 전체 시간에 걸쳐 단계 7.9에서에서 얻은 수 그래프. 각 실험 조건에 대해 여러 우물 사용, 그래픽 결과 ± 표준 편차 의미를 제시.
2. 각 잘 각 잘 각 시간 지점에서 대상 셀의 수에 의해 apoptotic 세포의 수를 분할 하 여 대상 셀의 인구는의 apoptotic 분수를 계산 합니다.
3. 8.2 단계에서 얻은 결과 그래프.
4. 각 곡선 (AUC) 곡선 아래의 영역을 결정 합니다. 원하는 경우 각 곡선의 모집단의 피크 apoptotic 분수 또한 피크 발생 시간 포인트 뿐만 아니라 결정 될 수 있습니다. 실험 조건에 대 한 결정 AUC 크게 다른 적절 한 통계적 테스트를 사용 하 여 여부를 결정 합니다.
   참고: 웰 치의 보정으로 짝이 없는 t-검정 AUC 결과에 적용 되었습니다.

결과

이 메서드는 대상 암 세포 effector CD8⁺ T의 간단한 공동 문화 기반 셀 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체의 존재 유무에 관계 없이 미리 배양 되어 있다. CD8 검색⁺ 공동 문화에 따라의 CD8 세포 독성에 억압 셀의 효과의 평가 활성화 시간이 지남에 T 세포 이용한 암 세포 apoptosis⁺ T 세포.

일반적으로, 암 세포 증가 그들의 핵에서 녹색 형광 핵 타겟팅 caspase 바이오 센서의 활성화에 따라 때 이러한 세포 CD8 접촉⁺ T 세포 항 체 억제 세포 (부재에서 여 전 활성화 그림 3; 보충 영화 1)입니다. Caspase 기판에서 녹색 형광 apoptosis 시작 된 후 적어도 15 h에 대 한 감지 했다. ⁺ T effector CD8의 몇 가지 자발적인 apoptosis이이 세포 분리 (그림 4; 경작 했다 경우에 세포도 시간이 지남에 따라 관찰 되었다 보충 영화 2). 그러나, 핵 크기 CD8의⁺ T 세포는 암 세포 보다 작은 및 따라서 apoptotic '이펙터' 셀에서에서 제외할 수 있습니다 '대상' 셀 계산 apoptotic 메서드에서 크기 제한 이미지 분석 (그림 2 및 그림 4). 비록 일부 대상 암 세포 표시 없이 녹색 형광 작은 둥근된 모양,이 영향을 주지 않습니다 분석 이러한 세포 apoptosis (보충 영화 3), 보다는 오히려 유사 분열을 겪고 있다 고 따라서 apoptotic '대상'에서 제외 됩니다. 셀 레드/그린 오버랩 마스크 (보충 그림 2)에 의해 계산 됩니다. 대상 암 세포의 자발적인 apoptosis는 단일 문화 (보충 영화 3)에 가끔 발견 된다. 그러나, 대상 암 공동 문화와 전 활성화 한 CD8 세포⁺ T 세포가 암 세포 (그림 4)의 단에 자발적인 apoptosis 수준 이상의 증가 된 종양 세포 apoptosis. 일반적으로, 효과 기 세포를 대상 암 세포의 최적 비율을 사용 하 여, 피크 apoptotic 대상 암 세포의 수를 관찰할 수 있습니다 (그림 5A). 이 피크는 더 뚜렷한 데이터 (그림 5B) 타깃 셀의 apoptotic 분수로 표현 되는 때입니다. 이 실험에서 대상 종양 세포의 기저 apoptosis 24 h에 정점 (apoptotic 분수 = 0.08), CD8 하지만⁺ T 세포 유도 된 apoptosis 17 h에서 최대 수준에 도달 (apoptotic 분수 = 0.66).

우리 더 발견 CD8⁺ T 셀 MAMs 또는 M-MDSCs incubated 미리 만들 수 있는 대상 암 세포와 접촉 하지만이 연락처 CD8에 비해 암 세포 apoptosis의 적은 경우에 발생 하는 듯⁺ T 세포는 전 하지 않고 활성화 억제 세포 (그림 3 및 그림 4; 보충 영화 4와 보충 영화 5). 비록는 CD8⁺ T 전 골수성 세포와 때때로 incubated 세포 암 세포 apoptosis 유도, 거기 또한 apoptosis의 시간 과정을 자극 하지 대상 암 세포의 일부 확산은 실험 (보충 영화 6)입니다. 이러한 결과와 일치, 피크 분수 apoptotic 세포의 CD8과 교양⁺ T 세포 전 골수성 세포와 인 큐베이 팅 (apoptotic 분수 MDSC와 20 h 0.25 맘-e 23 h 0.38 =) 암 세포의 그것 보다 훨씬 낮은 CD8와 교양⁺ T 세포 억제기 세포 (그림 6)와 함께 미리 incubated 되지 않은.

그림 1: 실험 절차를 보여주는 계획. 순진한 비장 CD8⁺ T 세포 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 없이 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 교양 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포 (M-MDSCs). 4 일 후, CD8 부동⁺ T 세포를 수집 하 여 fluorogenic caspase 3 기판의 암 세포를 대상으로 공동 경작. Apoptotic 암 세포 실시간 형광 현미경에서 검출 된다. 표시 된 이미지는 라이브 셀 이미징 플랫폼을 사용 하 여 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: apoptotic 대상 셀 apoptotic effector 세포에서 별개의 식별. 빨강 채널에서 상위 행: 이미지 수집 대상 검출 마스크 (핑크 분석 마스크) 대상 세포 핵의 식별 수 있습니다. 가운데 행: 이미지 녹색 채널에 인수 apoptotic 이펙터 및 대상 셀을 나타냅니다. Asize 제한 된 apoptosis 마스크 (청록 분석 마스크; 보다 큰 80 µ m²) 단일 apoptotic 효과 기 세포는 분석에서 제외 될 수. 아래쪽 행: 합성 이미지 병합 된 레드와 위상 대비 이미지 (왼쪽)와 빨강/녹색 녹색 채널 중첩 마스크 (오른쪽). 빨간 형광 (노란색 분석 마스크)와 함께 공동 지역화, 크기 제한 녹색 형광의 식별 apoptotic 효과 기 세포 (흰색의 집계를 제외 하 여 대상 핵 (노란색 화살표) apoptotic의 더 정확한 탐지를 허용 화살촉)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

CD8 사이 상호 작용 그림 3:⁺ T 세포와 암 세포. E0771 LG_NLR 대상 세포 (T) 공동 effector CD8과 교양의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸⁺ T 세포 (E) 이펙터/대상 4:1 비율에. MDSC와 맘 E effector 세포 미리 incubated M MDSCs와 MAMs 각각 나타냅니다. 복합 이미지 (를 포함 하 여 단계 대조, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지)이 표시 됩니다. 화살촉은 다른 필드와 시간 포인트를 통해 동일한 셀 추적 하 고 있다. 노란색 화살표: 이펙터와 연결 하 고 apoptosis, 흰색 화살표를 겪 습 대상: 이펙터 연결 하지만 apoptosis를 받아야 되지 않습니다 대상. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: apoptotic 세포의 탐지. 대표적인 필드 이미징 후 18 h에서 시간 경과 영화에서 추출. 복합 이미지 (왼쪽; 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널) 및 빨강에서 이미지 (가운데) 없이 채널 또는 레드/그린 (오른쪽) 중복 마스크 (노란색) 표시 됩니다. 오른쪽 열에 노란색 점 apoptotic 세포를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: CD8⁺ T 세포 이용한 암 세포 apoptosis. (A) 수 이펙터 C8와 교양된 apoptotic 세포의⁺ T 세포 대상 비율 (E:T) 다른 이펙터에. 타깃 셀의 (B) Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 평균 영역 (AUC) 곡선 아래 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P < E:T에 비해 0.0001 = 0:1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 효과 종양 침투 골수성 세포의 CD8 세포 독성에⁺ T 세포. Apoptotic 세포의 (A) 수 (대상: T) C8와 교양⁺ T 세포 (effector: E) E:T 비율의 4: 1에. CD8⁺ T 세포 미리 부재 (검은 원) 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포의 존재에 교양 있었다 (MDSC e: 블루 원) 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (맘-e: 빨간색 동그라미). 데이터는 타깃 셀의 ± sd (B). Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 의미 AUC도 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P < 0.0001 T에 비해, ^#P < E + 토니에 비해 0.0001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1입니다. 전이성 폐암에서 억압 셀을 제어 전략. (A) 대표 점 monocytic 파생 골수성 억압 셀 (M MDSCs) 및 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 분리 플롯. Ly6C 레벨 MAMs (Ly6C^낮은)와 M-MDSCs (Ly6C^높은) 구별을 임계값은 주민 치경 대 식 세포 (RMAC)의 기반으로 합니다. 정렬 된 M-MDSCs의 (B) 순도 (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^높은)와 MAMs (CD45⁺Ly6G^-CD11b⁺Ly6C^낮은). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 2입니다. Mitotic 대상 셀의 대표 이미지입니다. E0771 LG_NLR 대상 셀 모노 문화의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸. 상위: 복합 이미지 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지를 포함 한. 하단: 복합 이미지 (빨강과 녹색 채널) 빨강/녹색 중복 마스크. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 3입니다. CD8의 확산에 골수성 세포 종양 침투의 효과⁺ T 셀. (A) 대표 히스토그램에 CD8 CFSE와 형광 라벨의 희석을 보여주는⁺ T 세포. 순진한 비장 CD8⁺ T 세포 격리 프로토콜-3에 설명 된 대로 되었고 CFSE의 15 분 동안 37 ° C에서 5 µ M으로 표시. 레이블이 T 세포의 존재에 일리노이-2 교양 및 안티-CD3/CD28 프로토콜 4에 설명 된 대로 또는 골수성 세포 없이 항 체를 활성화 했다. 4 일 후, T 세포에서 녹색 형광 교류 cytometer에서 검색 되었습니다. (B) CD8의 분할 인덱스⁺ T 세포는 앞에서 설명한¹⁷로 계산. 데이터는 의미 ± SEM. * P < 0.01 제어, ^#P에 비해 < αCD3/CD28 Ab.에 비해 0.05 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 1입니다. 그림 3과 4;의 영화 E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 2입니다. 그림 3과 4;의 영화 이펙터 (E)입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 3입니다. 그림 3과 4;의 영화 대상 (T)입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 4입니다. 그림 3과 4;의 영화 MDSC E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 5입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 영화 6입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T (확산). 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 메서드는 두 별도 공동 문화 단계에 따라: 잠재적인 억압 셀⁺ T 세포 CD8 공동 경작 하 고 대상 종양 세포 (그림 1)⁺ T 세포 '사전 조건된' CD8 공동 경작. 첫 번째 공동 문화 단계는 매우 비슷합니다 CD8에 대 한⁺ T 세포 확산 분석 실험 일반적으로 CD8에 억압 셀의 효과 결정 하는 데 사용⁺ T 세포 기능. 그러나, T 세포 확산 그들의 세포 독성와 항상 연결 되지 않습니다. 예를 들어 우리 M-MDSCs 또는 MAMs 공동 문화 발견 CD8의 감소 확산 보다 증가 반면 이러한 사전 CD8 단련 CD3/CD28 항 체 (보충 그림 3), 활성화의⁺ T 세포⁺ T 세포 증명 대상 암 세포 (그림 4, 그림 5, 그림 6)에 대 한 세포 독성을 감소. 대상 암 세포 apoptosis,이 CD8에 의해 제공에 의해 입증 기능 활동의 평가의 중요성을 강조 하는이 결과⁺ T 세포 세포 독성 분석 실험.

이 분석 결과에서 그 CD8 확인 했습니다⁺ T 세포 E0771-LG 마우스 유 방 종양 세포 (그림 5)의 최대 apoptosis를 유도 하기 위하여 공동 문화의 약 15 h 필요. 이 지연 caspase 3 (보충 영화 1의 활성화에 의해 측정 대상에 apoptotic 신호를 유도 하는 데 필요한 시간 뿐만 아니라 목표와 함께 면역 시 냅 스 형성, 효과 기 세포의 초기 접촉 사이 지연 때문일 수도 있습니다. ). 우리는 또한 apoptotic 종양 세포의 수는 T 세포에 의해 대상의 제거 및 죽은 세포에서 형광 신호의 손실 때문에 아마 이다 24 h 후 고원에 도달을 발견. 피크 apoptosis의 시간을 식별 하기 위해이 기능은 최적의 시간 포인트의 결정에 중요 하므로 다른 조건 사이 적절 한 비교가 분석이 결과의 주요 장점 중 하나입니다. 우리의 경우 예를 들어⁺ T 제어 CD8 세포 독성에 차이가 세포와 CD8 MDSC/맘 교육⁺ T 세포에서 15-18 h 72 h (그림 5)에 비해 훨씬 더 큰 되었고 따라서 끝점 72 h 잠복기를 사용 하 여 실험 잘못 된 결과 얻을 것 이다.

이 메서드는 또한 CD8의 제한 된 세포 독성을 기본 메커니즘에 대 한 더 큰 통찰력을 제공 하는 실시간 이펙터 목표 셀 상호 작용의 시각화를 통해⁺ T 세포 중 억제기 세포 incubated. 예를 들어 우리가 관찰 CD8⁺ T 세포 중 M-MDSCs 또는 MAMs incubated 발생 및 대상 종양 세포와 상호 작용 하지만 항상 apoptosis (보충 영화 4, 보충 영화 5, 보충 영화 6) 유도 하지 않았다. 비록 우리가이 이벤트를 계량 하지 않았다, 그것은 가능 하 고 계량 하 여 남과 apoptosis 유도 상관 관계에서 그들의 상호 작용 시간의 비율을 비교 흥미로운 것입니다. 또 다른 주요 장점은이 방법은 적은 수의 셀 (예: 1 x 10³ 대상)과 4 x 10³ 잘 당 효과 기 세포의 요구. 사실,이 프로토콜 수 수 더 소형화 384-잘 플레이트 형식에 대 한 원하는 경우. 따라서,이 분석 결과 어디 셀 숫자는 제한 또는 vivo 샘플 ex vivo에서에서 파생 된 생체 외에서 귀중 한 셀을 사용 하 여 테스트와 같은 높은 처리량 검열 그리고 실험에 적합 합니다.

다른 한편으로, 현재 분석 결과의 제한 일부 조건에서 죽은 효과 기 세포의 중요 한 숫자의 존재 이다. 대상 암 세포의 apoptosis effector CD8의 구별에 정확도 증가 하기 위하여⁺ T 세포, 셀 표시 대상의 핵과 핵 크기 제한 (그 이펙터 셀 제외)이 데이터 분석에 대 한 적용 분석 결과 (그림 2)입니다. 그러나, 오버레이 (녹색) apoptotic CD8의 집계의⁺ T 결과 혼동 수 있습니다 비-apoptotic 대상 암 세포에 세포 경우가 있습니다. 이 제한 effector 세포 전에 공동 대상 종양 세포, 효과 기 세포의 충분 한 숫자를 사용할 수 있습니다 가정 문화에서 죽은 세포 제거 열 사용 하 여 완화 될 수 있습니다. 더 복잡 한 현미경 시스템, 또한 수 있습니다 라벨 effector CD8 거짓 긍정적인 신호를 줄이기 위해 대상 셀 핵 및 fluorogenic caspase 3 기판에서 fluorophore와⁺ T 세포.

이 프로토콜은 CD8 항 일반적인 활성화 조사 이용 되어 지금까지⁺ T 세포. 비록 MDSCs 및 종양 microenvironment에서 Tam 항 원 비 관련 메커니즘을 통해 T 세포 기능을 억제, 주변 림프 조직에서 MDSCs 억제 T 세포 응답 항 원 특정 방식으로¹⁸. CD8를 사용 하 여 생체 외에서 확산 분석 결과 같은 종류의 세포, 면역 진압 기능 조사 OT-1에서⁺ T 세포 유전자 변형 쥐를 일반적으로 사용 됩니다. 이 분석 결과에서 OT-1 T 세포 (ovalbumin (OVA) 특정 T 세포 수용 체를 표현 하는) 공동 교양 억압 MDSCs OVA 펩 티 드, 앞으로 우리의 세포 독성 분석 결과에서 첫 번째 문화에 대 한 적용 (즉,., T의 활성화 세포 존재 또는 진압의 부재)입니다. 그것은 또한 OVA, OT-1 T 세포 항 원 특정 암 세포 살해를 일으킬 수 있는 표현 대상 암 세포 조작 가능. 따라서, 분석 결과 또한 항 원 특정 T 세포 활성화의 어머니/MDSC 중재 억제의 조사를 하면 수 있습니다. 그것은 또한 인간의 세포에 대 한 인간의 CD3 CD28 항 체 활성화는 상용, 고 임상 샘플에서 인간의 Tam을 프로토콜 설립된¹⁹되었습니다 조사를 분석 결과 적용 하.

공동으로,이 분석 결과 매우 다양 한 이며 다른 면역 세포 유형의 세포 독성 검사를 사용할 수 있습니다. 현재, 우리의 실험실에서 다양 한 조건에서 항 원-종속 셀 세포 독성 검사를 확장 하 고 심사도 높은 처리량에 대 한 개발 되 고 키를 누릅니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin EDTA (1X)	Gibco	25300-054
12-Well Cell Culture Plate	Freiner Bio-One	665-180
1x PBS	Gibco	14190-094
2-mercaptethanol	Sigma	M6250-10ML
5mL Plystyrene Round-Bottom Tube	FALCON	352054
96-Well Cell Culture Plate (Round Bottom )	Costar	3799	Co-culture of CD8+T cells with sorted myeloid cells
96-well plate (Flat bottom)	Nunc	165305	Co-culture of CD8+T cells with target cells for cytotoxicity assay
AF647 anti-mouse F4/80 Antibody	BIO-RAD	MCA497A647	Clone: CIA3-1, Lot#: 1707, 2 μL/1x10^6 cells
AlexaFluor700 anti-mouse CD8 Antibody	Biolegend	100730	Clone: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 μL/1x10^6 cells
anti-mouse CD28 Antibody	Biolegend	102111	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 37.51, Lot#: B256340
anti-mouse CD3e Antibody	Biolegend	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC anti-mouse CD3 Antibody	Biolegend	100236	Clone: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 μL/1x10^6 cells
APC/Cy7 anti-mouse Ly6C Antibody	Biolegend	128026	Clone: HK1.4, Lot#: B248351, 1 μL/1x10^6 cells
Bovine Serum Albmin	Sigma	A1470-100G
Cell Strainer (100μm Nylon)	FALCON	352360	To smash the spleen
Cell Strainer (40μm Nylon)	FALCON	352340	To filter the lung digestion
DAPI	Biolegend	422801
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium	Gibco	41966-029
EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit	StemCell Technologies	19853
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
FITC anti-mouse CD4 Antibody	Biolegend	100406	Clone: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 μL/1x10^6 cells
Geltrex Ready-to-Use	Gibco	A1596-01	Coating the 96-well plates for cytotoxicity assay
IncuCyte NucLight Red Lentivirus Reagent	Essen BioScience	4476	Lenti viral particules encoding mKate2
IncuCyte ZOOM	Essen BioScience		Detector (fluorescence microscope)
IncuCyte ZOOM 2018A	Essen BioScience		Analysis software
L-Glutamine (100X)	Gibco	A2916801
Lung Dissociation Kit	Miltenyi	130-095-927	Preparation of single cell suspension from the tumor-bearing lung
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	LT07-318
Non-essential amino acid (100X)	Gibco	11140-035
NucView488	Biotium	10403	Fluoregenic caspase-3 substrate
PE anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127607	Clone: 1A8, Lot#: B258704, 0.5 μL/1x10^6 cells
PE/Cy7 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101216	Clone: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 μL/1x10^6 cells
Pen Strep	Gibco	15140-122	Penicillin Streptomycin for primary culture of cells
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 Antibody	Biolegend	103132	Clone: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 μL/1x10^6 cells
Polybrene (Hexadimethrine bromide)	Sigma	H9268
Puromycin	Gibco	A11138-03
RBC Lysis Buffer (10X)	Biolegend	420301
Recombinant murine IL-2	Peprotech	212-12	Activation of isolated CD8+ T cells
Sodium pyruvate (100X)	Gibco	11360-070
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) Antibody	Biolegend	101320
			: Nikon 10X objective (resolution 1.22 µm)  : Green channel excitation: 440 - 480 nm  : Green channel emission: 504 - 544 nm  : Red channel excitation: 565-605 nm  : Red channel emission: 625 - 705 nm