פרוטוקול לטיפול Photobiomodulation טראנס בעכברים

Summary

טיפול Photobiomodulation יכול גם לשפר את תפקוד המוח בריא, והיא מודאליות לא פולשנית חדשניות לטיפול במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות, פסיכיאטרית. פרוטוקול זה כולל מדריך צעד אחר צעד כדי ביצוע המוח photobiomodulation בעכברים על ידי משלוח אור טראנס, אשר ניתן להתאים לשימוש בחולדות מעבדה אחרות.

Abstract

Photobiomodulation טראנס היא פוטנציאל חדשני לא פולשנית גישה טיפולית לשיפור ביואנרגיה המוח, תפקוד המוח במגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות, פסיכיאטרית, שיפור זיכרון הקשורות לגיל ירידה קוגניטיבית מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול מעבדה לטיפול photobiomodulation טראנס (PBMT) בעכברים. BALB/c בגילאי עכברים (בן 18 חודשים) מטופלים עם 660 ננומטר לייזר transcranially, פעם ביום למשך שבועיים. לייזר להדמיה הנתונים מראה כי כ- 1% התקרית אור אדום על הקרקפת מגיע לעומק 1 מ מ מעל פני השטח קורטיקלית, חודרת של ההיפוקמפוס הגבי. תוצאות הטיפול הם מוערך על ידי שתי שיטות: בארנס מבוך, בדיקה, אשר ההיפוקמפוס תלויי מרחבי למידה וזיכרון פעילות הערכה, של מדידת רמות ATP בהיפוקמפוס, אשר משמש ליצירת אינדקס ביואנרגיה. תוצאות הפעילות בארנס מראים שיפור של הזיכרון המרחבי שטופלו לייזר בגילאי עכברים בהשוואה עם פקדים מתאימים-גיל. אנליזה ביוכימית לאחר טיפול לייזר מציין גדל רמות ATP בהיפוקמפוס. אנחנו בקביעתו כי שיפור ביצועי זיכרון הוא פוטנציאל עקב שיפור חילוף החומרים האנרגיה בהיפוקמפוס המושרה על ידי טיפול לייזר אדום. אפשרות להאריך התצפיות בעכברים אחרים מודלים בבעלי חיים מאז פרוטוקול זה יכול פוטנציאלית להיות מותאם מינים אחרים נעשה שימוש תכוף ב- neuroscience translational, כמו ארנב, החתול, הכלב או קוף. Photobiomodulation טראנס הוא חסכוני ובטוח מודאליות אשר עשוי להיות גישה טיפולית מבטיח ב פגיעה קוגניטיבית הקשורות לגיל.

Introduction

PBMT, או טיפול באור לייזר ברמה נמוכה (תראפיה), הוא מונח כללי המתייחס משיטות טיפול המבוסס על הגירוי של רקמות ביולוגיות של אנרגיית האור לייזרים או דיודות פולטות אור (נוריות). כמעט כל הטיפולים PBMT עם אדום-סגול (ניר) אור באורכי גל מ 600 חלות 1100 nm, כוח פלט בין 1 ל 500 mW, ואת הכשרון החל < 1 > J/cm 20² (ראה צ'ונג ואח¹).

טראנס PBMT היא שיטה לא פולשנית משלוח אור זה מבוצע על ידי הקרנה של הראש באמצעות של ממקור אור חיצוני (לייזר או נוריות)². עבור יישומים בעלי חיים, שיטה זו כוללת קשר או אסטמה של השמה של המכשיר LED או לייזר על הראש של החיה. תלוי באזור טיפולית עניין, מכשיר בדיקה קלה ניתן להציב על הראש כולו (עבור מכסה את כל התחומים המוח) או על חלק מסוים של הראש, כגון האזור הקדם חזיתית, חזיתית או הקודקוד. השידור חלקית של אור אדום/ניר דרך הקרקפת, הגולגולת, הדורה יכול להגיע אל פני השטח קורטיקלית ולספק כמות הפוטונים אנרגיה מספקת להפיק יתרונות טיפולית. לאחר מכן, הכשרון אור ונמסרו ברמת בקליפת המוח להיות מופצות בנושא המוח אפור ולבן עד שהוא מגיע המבנים עמוק יותר של המוח³.

אור הלהקות ספקטרלי האדום מרחיקת אדום אזור (600-680 ננומטר) ואזור מוקדם ניר (800 870 ננומטר) מקביל ספקטרום הבליעה של ציטוכרום c אוקסידאז, האנזים מסוף של שרשרת הנשימה מיטוכונדריאלי⁴. זה זה שיערו כי PBMT בספקטרום אדום/ניר גורם פוטוליזה של תחמוצת החנקן (NO) של ציטוכרום c אוקסידאז, וכתוצאה מכך העלאות תחבורה אלקטרון מיטוכונדריאלי והגדילה, בסופו של דבר, ATP דור⁵. לגבי יישומים עצביים, היתרונות neurostimulatory הפוטנציאליים של המוח PBMT באמצעות הקרנה טראנס שיטות דווחו במגוון רחב של מחקרים פרה, כולל דגמים מכרסם של מוח טראומטית (TBI) פגיעה⁶, קו חריפה⁷, מחלת אלצהיימר (AD)⁸, מחלת פרקינסון (PD)⁹, דיכאון¹⁰והזדקנות¹¹.

הזדקנות המוח נחשב מצב שתלמידים המשפיעה לרעה על תפקודים קוגניטיביים מסוימים, כגון למידה וזיכרון¹². המיטוכונדריה הם organelles הראשי אחראי על ייצור ATP, ביואנרגיה עצביים. תפקוד מיטוכונדריאלי ידוע להיות מזוהה עם גירעונות הקשורות לגיל באזורי המוח הקשורים ניווט מרחבי זיכרון, כמו ההיפוקמפוס ה¹³. כי הטיפול הגולגולת האדומה/ניר אור בעיקר מעשים על-ידי אפנון של ביואנרגיה מיטוכונדריאלי, ונמסרו אור מינון ההיפוקמפוס יכול לגרום לשיפור הזיכרון המרחבי תוצאות¹⁴.

המטרה של פרוטוקול הנוכחית היא כדי להדגים את הפרוצדורה PBMT טראנס בעכברים, באמצעות רמות נמוכות של אור אדום. המדידות אור לייזר הנדרשים דרך הרקמות ראש של עכברים בגילאי מתוארים. בנוסף, מבוך בארנס, כמו למידה מרחבית ההיפוקמפוס תלויי זיכרון המשימות ואת רמות ATP בהיפוקמפוס, בתור אינדקס ביואנרגיה, משמשים עבור הערכה של ההשפעה טיפול בבעלי חיים.

Protocol

כל הנהלים בוצעו בהתאם המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות (NIH; פרסום מס 85-23, תוקן 1985) ואושרו על-ידי ועדת האתיקה האזורי של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה.

התראה: פרוטוקול זה כולל את היישום של מכשירים לייזר Class 3B, דורשים הכשרה מתאימה תוך היצמדות להנחיות הבטיחות. Class 3B לייזרים יכול לגרום נזק חמור בעיניים וחום בעור. Class 3B לייזרים לא נחשב סיכון כוויות. חובה לחבוש משקפי הגנה העין בכל עת בהפעלה את מכשיר הלייזר.

1. לייזר אור ניסויים

הערה: להשתמש כאן שלושה בת 18 חודש זכר BALB/c עכברים התקבלו מהמתקן בעלי חיים של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה. לייזר mW 60 (660 ננומטר) עם קרן מעגלית הצורה של 2.5 מ מ קוטר משמש מקור האור. מקור הלייזר מייצר אור מקוטב באופן מעגלי עם פרופיל בעוצמה לפי עקומת גאוס ומופעל במצב מתמשך wave. מד כוח פוטודיודה מסחרי עם רזולוציה nW 10, אזור פעיל של² פוטודיודה 1 ס מ מרובע טווח התגובה ספקטרלי מ- 400 1100 nm משמש כדי למדוד את השלטון אור משודרים באמצעות הדגימות.

1. הכנת הדוגמא
   1. על מנת לקבל דגימות טריות, עמוק עזים ומתנגד את העכבר עם תערובת של קטאמין (100 מ ג/ק ג) חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג).
   2. לנתח את הראש של העכבר במספריים רגילים, החל מהנקודה הממוקמת מעל הכתפיים.
   3. לסובב את הראש כך הצד הבטני של הלסת פונה למעלה. החלק בזווית חיתוך מספריים בצורה חלקה דרך חלל הפה עד ההתנגדות של הצומת הלסת הוא הבחין. לחתוך כל השרירים גדול מקשר את עצם הלסת התחתונה לגולגולת וזורקים אותם.
   4. הסר את העצמות הפלטינית, באמצעות מספריים בזווית לנתיחה.
   5. להתעלם כל בשר המקיפים את הגולגולת, באמצעות מלקחיים מעוקל.
   6. לנתח את החלק התחתון של הגולגולת, לאחר מכן, לקחת בזהירות את מוחי העצם הגולגולת הנותרים, עם מרית מעוקל.
   7. לתקן את רקמת המוח ללא פגע ג'ל agarose 2% כך הרקמה תהיה מתאימה עם פרוסות.
      הערה: על מנת להשיג של הגולגולת שלם וגם הקרקפת מדגם רקמת המוח יש להסיר מן הצד הבטני של הראש של החיה ללא כל נזק לחלק הגבי של הראש.
2. המוח עם פרוסות הליך
   1. מורחים טיפה של דבק מגע (~0.05 מ"ל) על פני הרחוב הרכבה vibratome.
   2. בזהירות לצרף את הבלוק agarose vibratome הרכבה בלוק כך השטח הגחוני של המוח היא עם הפנים, והתאם את מיקומו.
   3. מעט להתאים את הלהב vibratome השטח העליון של הרחוב agarose ולהקליט את הערך קאטר כרמת העיקרי.
   4. למלא את מיכל vibratome עם תמיסת מלח רגיל קר כקרח.
   5. להתאים את הפרמטרים vibratome (למשל, עובי הפרוסה [1 מ מ מהירות [מתוך 5 ביחידה התקן], תדר הרטט [מתוך 5 ביחידה התקן]) כדי להשיג עם פרוסות משביע רצון.
   6. לחתוך את המוח באופן רוחבי פרוסה עם עובי 1,000 מיקרומטר.
      הערה: הפרוסה הוא החלק של רקמת המוח לפי השטח קורטיקלית וממוקמים מטוס נחות השטח בקליפת המוח (ההיפוקמפוס הגבי) 1,000 מיקרומטר.
   7. להוסיף טיפה של מים (~0.05 מ"ל) על משטח זכוכית אופטית ולשים את המוח הפרוסה על גבי זה. לאחר מכן, להוסיף טיפה של מים on המוח פרוסה, בזהירות המקום הזכוכית אופטי השני מעליו.
      הערה: ירידה של מים יש להוסיף לגבולות זכוכית לדוגמה כדי למנוע רקמות ייבוש ואור פיזור משטחים קשים.
3. מדידה של העברת האור דרך הרקמות, ראש
   1. להגדיר את ציוד אופטי, כולל את מכשיר הלייזר, המשקף מראות ויחידת מד הכוח.
      התראה: לשים משקפי מגן עיניים לפני הפעלת הלייזר.
   2. בהיעדר מדגם במד חשמל, להדליק את מכשיר הלייזר ולהתמקד קרן הלייזר על המראה הממוקמת במרחק נאות להדרכת בניצב אזור פעיל של פוטודיודה הקורה.
      הערה: מדידות אור חייב להתבצע בתוך חדר חשוך בטמפרטורת החדר (23-25 ° C), בתוך 30 דקות לאחר הרקמות ראש חולצו.
   3. בצע מדידות רקמת המוח הפרוס.
      1. במקום שתי כוסות אופטי ריק על פני השטח של מד הכוח.
      2. לקרוא את הכוח אור המשודרת (אני₀) מ של מד הכוח להציג מסך ולהקליט את הערך.
      3. בעדינות למקם את הדגימה במוח, אשר הוא הקיף על ידי שתי כוסות אופטי, על פני השטח של מד הכוח, ממקדים את הקרן על שטח בהתאמה של הרקמה, לקרוא את הכוח המשודרת ולהקליט את הערך.
   4. בצע מדידות הגולגולת וגם הקרקפת.
      1. במקום כוס אופטי ריק על פני השטח של מד הכוח.
      2. לקרוא את הכוח אור המשודרת (אני₀) מ של מד הכוח להציג מסך ולהקליט את הערך.
      3. בקלילות מקום של זכוכית אופטית עם הגולגולת טריים בתוספת בקרקפת רקמות על פני השטח של מד הכוח, להתאים אלומת האור על אזור bregma, לקרוא את הכוח המשודרת ולהקליט את הערך.
      4. על מנת למקסם את יחס אות לרעש, חזור על המדידה אור לפחות 3 x עבור כל הדגימות.
         הערה: אזור bregma נמצא במחלקה כ 3 מ מ rostral ל קו שצויר באמצעות הבסיס הקדמי של האוזניים. העובי של הרקמה הגולגולת וגם הקרקפת נמדד על ידי caliper סטנדרטי.

2. טיפול Photobiomodulation (PBMT)

הערה: 45 עכברים BALB/c זכר שהוקצו שלוש קבוצות של 15 עכברים שימשו. הקבוצות חוברו של עכברים צעירים-control (בן חודשיים) שקיבלו המזויפים-PBMT, בגילאי-בקרת עכברים (בן 18 חודשים) אשר קיבל המזויפים-PBMT ועכברים בגילאי-PBMT (בן 18 חודשים) אשר קיבל PBMT. הטיפול המזויפים-PBMT כללה טיפול זהה PBMT הקבוצה, אבל עם לייזר לא פעיל. עכברים התקבלו מהמתקן בעלי חיים של תבריז האוניברסיטה למדעי הרפואה, שוכנו החיה מחזיק יחידה של מרכז מחקר מדעי המח (NSRC)-לחות יחסית 24-25 ° C ו- 55%, עם 12 שעות אור, photoperiod כהה 12 שעות. מזון ומים נמסרו ad libitum. כל העכברים היו התאקלם במשך לפחות שבוע לפני טיפול.

1. נוהל טיפול לייזר
   הערה: GaAlAs דיודת לייזר עם מצב מתמשך wave-660 ננומטר גל שימש לטיפול PBMT טראנס. מכשיר הלייזר הופעל כוח פלט של 200 mW ± 2, אחידות irradiance של 6.66 W/cm², עם נקודה בגודל של ס מ 0.03 נקודות². הכשרון הממוצע של J/cm 99.9² לכל כל מושב נמסרו על פני הקרקפת 15 s של הקרנה. ההקרנות היה מנוהל 1 x מדי יום במשך שבועיים רצופים.
   1. להביא את העכברים בכלובים שלהם הביתה לחדר הטיפולים, כ 20 דקות לפני תחילת הטיפול.
   2. להתחבר עם מגן חשמלי בקיר.
   3. הכנס את התקע מכשיר לייזר לתוך מגן חשמלי.
   4. מכסים את קצה המכשיר לייזר עם סרט ניילון שקוף כדי למנוע כל גירוד אל פני השטח.
   5. בזהירות לחבר את המכשיר הערוץ של מכשיר הלייזר.
   6. הפעל את מכשיר הלייזר ולאחר המתן מספר שניות על זה כדי להתחמם.
   7. כוונן את הפרמטרים לייזר/טיפול, כולל מצב זמן ותפעול הקרנה.
   8. בהיעדר דוגמיות, לקבוע את עוצמת הלייזר הממוצע על-ידי פנייה אל קצהו של החללית אל אזור פעיל של מד צריכת החשמל במכשיר לייזר. להקליט את הערך.
   9. חזור על התהליך כיול (שלב 2.1.8 תגובה על) לפחות 5 x, לקרוא סמכויות התקרית של מד הכוח להציג מסך, ולהקליט את הערכים.
   10. בעדינות להחזיק עכבר בעור הגבי הצוואר של החיה בכף יד, לשתק את ראשו.
       הערה: בפרוטוקול הנוכחי, הלייזר מושם על אזור bregma, אשר הוא ~ 3 מ"מ rostral לקו הנמתחים בין הבסיס הפנימי של האוזניים.
   11. בקלילות המקום קצה המכשיר ישירות על הקרקפת בקו האמצע, כ 3 מ מ rostral ל קו שצויר באמצעות הבסיס הקדמי של האוזניים.
       הערה: להחזיק את המכשיר בבית כ 45° זווית למטוס של הבטן.
   12. כדי להימנע הקרנה ישירה לעיניים של החיה, פנה הטיפ של המכשיר על הראש, ולאחר מכן, הפעל את מכשיר הלייזר.
   13. הפעל את הלייזר ולאחר stably להחזיק את המכשיר עד להשלמת ההקרנות.
   14. לאחר תום הטיפול, לסגת הלייזר מהראש ולחזור בעדינות את העכבר בכלוב.
   15. כבה את מכשיר הלייזר ונתק החללית מההתקן.
   16. ניקוי המכשיר לייזר עם שואב האבק אופטי המתאים.
   17. להעביר את העכברים המתקן בעלי חיים.

3. משימות התנהגותית

1. מבחן בשדה פתוח
   1. להעריך את גינקולוגיות הפעילות של כל העכבר על ידי המרחק הכולל נסע במהלך מבחן בשדה פתוח, כפי שתואר לעיל¹⁵.
2. פעילות מבוך בארנס
   1. המנגנון.
      הערה: מרחבי למידה וזיכרון הפעילות מתבצעת בתוך מבוך בארנס¹⁶. המנגנון המשמש עבור משימה זו neurobehavioral מורכב משטח עגול עשוי מעץ שחור (95 ס מ קוטר) עם 20 קו מקביל, 5 ס מ קוטר חורים עגולים הממוקמים על הרציף, 3 ס מ מסביב. המנגנון הוא מוגבה 50 ס מ מן הרצפה כדי למנוע את החיה יטפס למטה. תיבה מטלטלין לברוח פלסטיק שחור (20 ס"מ על 15 ס"מ x 5 ס מ) ממוקמת תחת החור לברוח. מבוך שחור משמש לבדיקת עכברים לבנים, שטיח שחור צריך להיות ממוקם תחת במבוך כאשר תוכנת מערכת מעקב.
      1. מקם את המנגנון מבוך במרכז חדר שקט עם תאורה בהירה תקורה.
      2. במקום שלט "לא להכנס" על החלק החיצוני של הדלת של חדר פעילות.
      3. לצרף רמזים חזותי מרחבי קירות המתחם.
      4. הצב מצלמת וידאו דיגיטלית מעל הרציף מבוך.
      5. לנקות את השטח של פלטפורמת מבוך עם 70% אתנול להסיר רמזים חוש הריח לא רצויים.
      6. להוסיף כמות קטנה של מצעים מהכלוב בבית של החיה בתוך תיבת לברוח כדי לשמש את הסימן חוש הריח.
   2. הסתגלות הפעלה
      1. להביא כל עכבר פעילות החדר כ-30 דקות לפני תחילת הניסוי, על מנת העכבר כדי להפוך בלתי.
      2. להסיר את העכבר מכלובה ומניחים בעדינות את החיה בתיבת ' לברוח ' 1 דקות.
   3. אימון
      הערה: האימון עצמו חוזר על עצמו עבור כל עכבר על 4 ימים רצופים.
      1. הסר בעדינות את העכבר מהתיבה לברוח.
      2. הנח את העכבר במרכז הזירה; אז, במקום תא התחל על העכבר.
      3. להסיר תא התחל לאחר 10 s, ולאפשר את העכבר כדי לחקור את הזירה למשך 3 דקות.
      4. בשקט להעביר המחשב ואל במקום על האוזניות אוטמות הרעש.
      5. לעורר גירוי שמיעתי שלילי בהיקף של רעש לבן חזק של 80 dB ברמת פלטפורמה ולהתחיל לצלם את העכבר.
      6. כבה את הרעש הלבן ואת להפסיק לצלם כאשר העכבר נכנס בתיבת לברוח. לאפשר את החיה להישאר ללא הפרעה בתיבה עבור 1 דקות.
      7. להסיר את העכבר מהתיבה לברוח ולמקם אותו בחזרה לתוך הכלוב שלה.
      8. חזור על שלבים 3.4.2 דרך 3.4.7 4 x ליום, עם מרווחי זמן 3 דקות בין מבחנים חוזרים ונשנים.
         הערה: בין כל המבחנים, מסיר שתן או צואה מהמשטח ארנה ולנקות את המבוך עם 70% אתנול.
   4. מפגש ניסיון בדיקה
      1. בעקבות שעבר הכשרה המשפט, 24 שעות מאוחר יותר, הסר את תיבת לברוח פלטפורמה מבוך וחזור על שלבים 3.4.2 דרך ' ר 3.4.5.
      2. לאחר 3 דקות, לכבות את רעש לבן, להפסיק לצלם. להסיר את העכבר מן הזירה מבוך ולמקם אותו בחזרה לתוך הכלוב שלה.
      3. לאחר כל החיות נבדקו, לנקות את הפלטפורמה מבוך ואת תא התחל. לכבות את האורות בחדר ולהסיר את השלט "אין להזין" מהדלת.
      4. אחסן את הקלטות וידאו מהפעלות בדיקה על כונן קשיח חיצוני לצורך ניתוח נוסף.
      5. להגדיר את מעקב וידאו תוכנה ולחלץ הפרמטרים של ריבית מן קטעי וידאו מוקלט, כולל את זמן השהיה כדי למצוא את החור המטרה במהלך 4 ימי הדרכות וזמן בילה ברביע היעד במהלך הפעלת המשפט בדיקה.

4. הערכת הביוכימי

1. רמות ATP בהיפוקמפוס
   1. עמוק עזים ומתנגד לכל עכבר עם זריקה בקרום הבטן של תערובת של קטאמין (100 מ ג לגרם של משקל הגוף) חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ ג לגרם של משקל הגוף).
   2. לערוף את החיה, במהירות להסיר את רקמת מוח הגולגולת.
   3. שווייץ ההיפוקמפוס, homogenize הרקמה במאגר לדוגמה קרה כקרח (שסופק על-ידי ערכת) עם מהמגן רקמות.
   4. מיד centrifuge את homogenate ב x 2,000 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.
   5. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי.
   6. להעריך את רמות ATP בהיפוקמפוס, באמצעות spectrophotometric את השיטה כפי שתואר לעיל¹¹.

תוצאות

ניתוחים סטטיסטיים

ניתוח סטטיסטי של נתונים המתקבלים בארנס ההדרכות נותחה על ידי ANOVA דו-כיווני; מבחנים התנהגותיים האחר ו ניתוח של רמות ATP בהיפוקמפוס בקרב קבוצות בוצעו על ידי חד-כיווני אנובה, ואחריו מבחן לאחר הוק של Tukey. כל הנתונים בא?...

Discussion

אנו מתארים פרוטוקול לביצוע הליך PBMT טראנס בעכברים. פרוטוקול זה מכוון במיוחד למעבדות מדעי המוח לבצע מחקר photobiomodulation התמקדו מכרסמים. עם זאת, ניתן להתאים פרוטוקול זה חיות מעבדה אחרות נפוצים בתחום מדעי המוח, כמו ארנב, החתול, הכלב או קוף.

כיום, יש עניין גדל בחקירת טראנס PBMT עם לייזרי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100