마우스에 Transcranial Photobiomodulation 치료에 대 한 프로토콜

요약

Photobiomodulation 치료 다양 한 신경학 상과 정신 장애의 처리를 위한 혁신적인 비 침 투 적인 양식 적임 이며 건강 한 두뇌 기능을 향상 시킬 수 있다. 이 프로토콜은 다른 실험실 설치류에 있는 사용을 위해 적응 시킬 수 있다 transcranial 빛 배달 여 쥐에서 뇌 photobiomodulation를 수행 하는 단계별 가이드를 포함 합니다.

초록

Transcranial photobiomodulation 뇌 생체, 다양 한 신경학 상과 정신 장애, 뇌 기능 및 나이 관련 된 인지에 관한 약화에 메모리 향상을 향상을 위한 잠재적인 혁신적인 비 침 투 적인 치료 방법입니다. 그리고 신경 퇴행 성 질환입니다. 우리 쥐에서 transcranial photobiomodulation 치료 (PBMT)를 위한 실험실 프로토콜을 설명합니다. 세 BALB/c 마우스 (18 개월)는 660 nm 레이저 transcranially, 일단 2 주 동안 매일 처리 됩니다. 레이저 투과율 데이터는 두 피에 빨간 입사광의 약 1% 관통 등 해 마는 대뇌 피 질의 표면에서 1mm 깊이 도달 보여줍니다. 두 가지 방법으로 치료 결과 평가: 반 즈 미로 한 해 마 의존 공간 학습 및 메모리 작업 평가, 테스트 및 측정 hippocampal ATP 수준 생체 인덱스로 사용 되는. 반 즈 작업에서 결과 레이저 치료 세 쥐 나이 일치 하는 컨트롤에 비해 공간 메모리 향상을 보여 줍니다. 생 화 확 적인 분석 뒤 레이저 치료 hippocampal ATP 레벨 증가. 우리는 메모리 성능 향상은 잠재적으로 빨간 레이저 치료에 의해 유도 된 hippocampal 에너지 대사에 개선 인해 공준. 쥐에서 관찰 때문에이 프로토콜 변환 신경 과학, 토끼, 고양이, 개, 또는 원숭이 등에서 자주 사용 하는 다른 종에 적응 될 수 다른 동물 모델에 연장 될 수 있습니다. Transcranial photobiomodulation 나이 관련 된 인지 장애에 유망한 치료 접근 될 수 있는 안전 하 고 비용 효율적인 양식 적임 이다.

서문

PBMT, 또는 저수준 레이저 가벼운 치료 (LLLT), 레이저 또는 발광 다이오드 (Led) 빛 에너지에 의해 생물 학적 조직의 자극에 따라 치료 방법을 참조 하는 일반적인 용어입니다. 거의 모든 PBMT 치료 1100 nm, 1에서 500 까지의 출력 전력 600에서 근처-적외선 (NIR) 빛 파장에서 붉은 색으로 적용 됩니다 mW, 그리고 < 1 >에서 이르기까지 fluence 20 J/c m² (정 외.¹참조).

Transcranial PBMT 외부 광원 (레이저 또는 Led)²를 사용 하 여 머리의 방사선 조사에 의해 실시 하는 비 침 투 적인 빛 전달 방법입니다. 동물 응용 프로그램에 대 한이 방법은 접촉 또는 비접촉 배치의 동물의 머리에 LED 또는 레이저 프로브를 포함합니다. 치료 관심 영역에 따라 가벼운 프로브 (모든 뇌 영역을 다루는)에 대 한 전체 머리 또는 머리, 전 두 엽, 정면, 또는 정수 리 영역 등의 특정 부분에 배치할 수 있습니다. 두 피, 두개골, 그리고 두 라 메이 터를 통해 레드/NIR 빛의 부분 전송 대뇌 피 질의 표면 수준에 도달 하 고 치료 혜택을 생산 하는 충분 한 광자 에너지의 금액을 제공할 수 있습니다. 그 후, 대뇌 피 질의 수준에서 전달 된 빛 fluence 뇌³의 깊은 구조를 도달할 때까지 회색과 흰색 두뇌 문제에 메시지를 전파 것 이다.

빨강 빨강 영역 (600-680 nm)과 초기 NIR 영역 (800-870 nm)에서 스펙트럼 밴드 빛 시 토 크롬 c 산화 효소, 미토 콘 드리 아 호흡 사슬⁴의 터미널 효소의 흡수 스펙트럼에 해당합니다. 그것을 PBMT 레드/적외선 스펙트럼에서 photodissociation 산화 질소 (NO)의 시 토 크롬 c 산화 효소에서 결과적으로 미토 콘 드리 아 전자 전송에 증가 원인과, 궁극적으로, ATP 생성⁵증가 가설입니다. 신경 응용 프로그램 관련의 잠재적인 neurostimulatory 혜택 뇌 방법 다양 한 외상 성 뇌 부상 (TBI)⁶의 설치류 모델을 포함 한 전 임상 연구에서에서 보고 되었습니다 transcranial 방사선을 사용 하 여 PBMT 급성 뇌졸중⁷, Alzheimer의 질병 (광고)⁸, 파 킨 슨 병 (PD)⁹, 우울증¹⁰, 그리고 노화¹¹.

뇌 노화에는 부정적인 영향을 미치는 몇 가지 인지 기능, 학습 및 메모리¹²등 신경 심리적 조건으로 간주 됩니다. 미토 콘 드리 아 ATP 생산 및 신경 생체에 대 한 책임 기본 세포입니다. 미토 콘 드 리아 기능 장애 관련 마¹³등 공간 탐색 메모리에 연결 된 뇌 영역에 적자 나이 관련 된 것으로 알려져 있다. 레드/NIR 두개골 치료 행위 주로 미토 콘 드리 아 생체의 변조, 빛 때문에 해 마에 전달된 빛 복용량을 충분 한 공간 메모리 결과¹⁴의 개선 될 수 있습니다.

현재 프로토콜의 목표는 쥐, 붉은 빛의 낮은 수준을 사용 하의 transcranial PBMT 절차를 보여 줍니다. 필요한 레이저 광선 전송 측정 세 쥐의 머리 조직을 통해 설명 합니다. 또한, 반 즈 미로, 해 마 의존 공간 학습 및 메모리 작업 및 생체 인덱스로 hippocampal ATP 수준으로 사용 됩니다 동물에서 치료 영향의 평가.

프로토콜

모든 절차의 관리 및 건강의 국가 학회 (NIH;의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 실시 했다 게시 번호 85-23, 개정 1985) Tabriz 대학 의료 과학의 지역 윤리 위원회에 의해 승인.

주의:이 프로토콜 클래스 3B 레이저의 응용 프로그램을 포함 하 고 적절 한 교육 및 안전 지침을 준수 해야 합니다. 클래스 3B 레이저 심각 하 게 눈을 손상 시킬 수 있습니다 그리고 피부를 열 수 있습니다. 클래스 3B 레이저 화상 위험을 간주 되지 않습니다. 눈 보호 고글을 착용 해야 합니다 항상 레이저 장치를 운영 하는 경우.

1. 레이저 광선 전송 실험

참고: 여기에서 사용 했다 3 18 개월 남성 BALB/c 마우스에서에서 얻은 Tabriz 대학 의료 과학의 동물 시설. 60 mW 레이저 (660 nm) 원형 빔 모양 직경에서 2.5 m m의 광원으로 사용입니다. 레이저 소스 가우스 강도 프로필 원형 편광 된 빛을 생산 및 연속파 모드에서 운영 됩니다. 10 nW 해상도, 평방 1 cm² 포토 다이오드 활성 영역, 400에서 1100 nm의 스펙트럼 응답 범위와 상업 포토 다이오드 전력 측정기는 샘플을 통해 전송 된 광 전력 측정 하는 데 사용 됩니다.

1. 샘플 준비
   1. 신선한 샘플을 얻기 위해 케 타 민 (100mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 혼합물으로 마우스를 anesthetize 깊이.
   2. 어깨 바로 위에 있는 지점에서 시작 하는 일반가 위 마우스의 머리를 해 부.
   3. 턱의 복 부 측 앞면이 위쪽을 향하도록 머리를 회전 합니다. 슬라이드 각도 해 부가 위 구강을 통해 원활 하 게 악의 접합의 저항을 발견 될 때까지. 모든 큰 근육 연결 mandible 뼈 두개골 하 고 그들을 삭제.
   4. 각된 해 부가 위를 사용 하 여 팔 뼈를 제거 합니다.
   5. 곡선된 겸 자 사용 하 여 두개골을 둘러싼 모든 육체를 삭제 합니다.
   6. 해 부는 두개골의 낮은 부분 그리고, 신중 하 게 걸릴 나머지 두개골 뼈에서 두뇌 곡선된 주걱으로.
   7. 그래서 조직 슬 라이 싱에 적합 것 그대로 뇌 조직의 2 %agarose 젤에 수정.
      참고: 순서 그대로 두개골을 얻을 플러스 샘플 두 피, 뇌 조직의 제거 되어야 한다 어떤 손상도 없이 동물의 머리의 복 부 측에서 머리의 등 쪽 부분에.
2. 절차를 부 러 뜨 리는 두뇌
   1. Vibratome 마운트 블록의 표면에 드롭 superglue (~0.05 mL)의 확산.
   2. 신중 하 게 vibratome는 두뇌의 복 부 표면 올려 놓습니다, 블록을 장착을 agarose 블록을 연결 하 고 그것의 위치를 조정.
   3. 약간 agarose 블록의 위쪽 표면에 vibratome 블레이드 일치 하 고 기본 수준으로 커터 값을 기록 합니다.
   4. 얼음 처럼 차가운 정상적인 염 분 솔루션 vibratome 탱크를 채우십시오.
   5. 만족 스러운 슬라이스를 (예를 들어, 슬라이스 두께 [1mm], 속도 장치 단위에 5 [5], 그리고 진동 주파수 [장치 단위에 5 5]) vibratome 매개 변수를 조정 합니다.
   6. 잘라 두뇌 transversely 조각 1000 µ m 두께.
      참고: 슬라이스는 대뇌 피 질의 표면에 의해 구분 된 뇌 조직의 부분 고 비행기 1000 µ m (지 마) 대뇌 피 질의 표면에 열 등 한.
   7. 광학 유리 표면에 한 방울의 물 (~0.05 mL)을 추가 하 고 그것의 위에 뇌 조각을 넣어. 다음, 물에 두뇌 슬라이스 한 방울을 추가 하 고 신중 하 게 그것의 위에 두 번째 광학 유리를 배치.
      참고: 한 방울의 물 추가 되어야 합니다 샘플 유리 경계에 건조 하는 조직과 거친 표면에서 산란 하는 빛을 방지 하기 위하여.
3. 머리 조직을 통해 빛 전송의 측정
   1. 레이저 장치를 반영 하는 거울, 그리고 파워 미터 단위를 포함 하 여 광학 장비를 설정 합니다.
      주의: 레이저를 켜기 전에 눈 보호 고글에 넣어.
   2. 전원 측정기에 샘플의 부재, 레이저 장치 고는 다이오드의 활성 영역에 수직 빔 지도 대 한 적절 한 거리에 위치 하는 거울에 레이저 빔을 초점.
      참고: 광선 전송 측정 수행 되어야 합니다 (23-25 ° C), 실 온에서 암실에서 머리 조직 추출 된 후 30 분 이내.
   3. 슬라이스된 뇌 조직에서 측정을 수행 합니다.
      1. 파워 미터의 표면에 2 개의 빈 광학 유리를 배치 합니다.
      2. 전송 된 가벼운 힘을 읽고 (내가₀) 파워 미터의에서 화면을 표시 하 고 값을 기록.
      3. 부드럽게 두 광학 유리에 의해 포함 하 고 뇌 샘플 파워 미터의 표면에, 직물의 각각 지역에 빔을 집중, 전송된 전력, 읽기 놓고 값을 기록 합니다.
   4. 두개골 플러스는 두 피에서 측정을 수행 합니다.
      1. 파워 미터의 표면에 빈 광학 유리를 배치 합니다.
      2. 전송 된 가벼운 힘을 읽고 (내가₀) 파워 미터의에서 화면을 표시 하 고 값을 기록.
      3. 가볍게 신선한 두개골을 가진 광학 유리 플러스 파워 미터의 표면에 조직 두 피, 광선 bregma 영역에 일치, 전송된 전력, 읽기 놓고 값을 기록 합니다.
      4. 신호 대 잡음 비율을 최대화 하기 위해 가벼운 전송 측정 최소 3 반복 모든 샘플에 대 한 x.
         참고: bregma 영역에 배치 되는 약 3 m m rostral 귀 앞쪽 기지를 통해 그린 선. 두개골 플러스 두 피 조직의 두께 표준 캘리퍼스에 의해 측정 됩니다.

2. Photobiomodulation 치료 (PBMT)

참고: 45 컷 BALB/c 마우스 15 생쥐의 세 그룹에 할당 된 사용 되었다. 그룹 세 제어 마우스 (18 개월) 받은 가짜-PBMT, 및 PBMT를 받은 세 PBMT 마우스 (18 개월) 가짜-PBMT를 받은 영 제어 마우스 (2 개월) 구성 되어 있었다. 가짜-PBMT 치료 치료는 PBMT와 동일 그룹 하지만 비활성 레이저로 구성 되어 있습니다. 마우스는 Tabriz 대학 의료 과학의 동물 시설에서 가져온 고 12 h 빛과 어두운 photoperiod 12 h 24-25 ° C 및 55% 상대 습도에 신경 과학 연구 센터 (NSRC)의 단위를 들고 동물에 보관 되어 있었다. 음식과 물 광고 libitum제공 했다. 모든 마우스는 치료 전에 적어도 1 주 동안 acclimatized 했다.

1. 레이저 치료 절차
   참고: 660 nm 파장에서 연속파 모드 다이오드 GaAlAs 레이저 transcranial PBMT 치료를 위해 사용 되었다. 레이저 장치는 200 ± 2 mW의 출력 전력과 0.03 c m²의 점 크기와 6.66 W/c m²의 irradiance에서 운영 했다. 각 세션 별로 99.9 J/c m² 의 평균 fluence 15 두 피 표면에 전달 된 방사선의 s. 방사선은 관리 1 x 2 연속적인 주 동안 매일.
   1. 치료 방, 치료 전에 약 20 분 자신의 집 새에 쥐를가지고.
   2. 전기 보호 벽 콘센트에 연결 합니다.
   3. 전기 보호기에 레이저 장치 플러그를 삽입 합니다.
   4. 어떤 표면에 긁힘 방지 하기 위해 투명 한 나일론 필름으로 레이저 프로브 팁을 커버.
   5. 신중 하 게 레이저 소자의 채널에 프로브를 연결 합니다.
   6. 레이저 장치를 켜고 따뜻하게 잠시 기다립니다.
   7. 방사선 시간 및 운영 모드를 포함 하 여 레이저/치료 매개 변수를 조정 합니다.
   8. 모든 샘플의 부재에서 레이저의 평균 전력 레이저 장치에 파워 미터의 활성 영역에 프로브 팁에 연락 하 여 확인 합니다. 값을 기록 합니다.
   9. 교정 과정 (2.1.8 단계)를 반복 하 여 최소 5 배, 읽기 파워 미터에서 사고 능력 화면을 표시 하 고 값을 기록 합니다.
   10. 부드럽게 손의 손바닥에 동물의 목의 등 쪽 피부에 의해 마우스를 보유 하 고 그것의 머리를 고정.
       참고: 현재 프로토콜에 레이저 프로브 ~ 3 m m 귀에의 내부 자료 사이 그려진 선 rostral bregma 영역에 배치 됩니다.
   11. 가볍게 중간, 약 3 m m 선 귀 앞쪽 자료 통해 rostral에 두 피에 직접 프로브 팁을 놓습니다.
       참고 사항: 개최에서 프로브는 복 부의 비행기로 약 45 ° 각도.
   12. 동물의 눈에 직접 방사선을 방지 하기 위해 먼저 머리에 프로브 팁을 문의 하 고, 레이저 장치를 켭니다.
   13. 켜고 레이저 방사선 완료 될 때까지 안정적으로 프로브를 개최.
   14. 치료의 끝 후에 머리에서 레이저 프로브를 철회 하 고 부드럽게 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.
   15. 레이저 장치를 끄고 장치에서 프로브를 분리.
   16. 적합 한 광학 청소기 레이저 프로브를 청소.
   17. 동물 시설에 쥐를 전송 합니다.

3. 행동 작업

1. 오픈 필드 테스트
   1. 평가 운동으로 오픈 필드 테스트 기간 동안 여행 하는 총 거리에 의해 각 마우스의 활동¹⁵설명한.
2. 반 즈 미로 작업
   1. 장치
      참고: 공간 학습 및 메모리 작업 반 즈 미로¹⁶에서 수행 됩니다. 만든 검은 나무 (95 cm 직경에서) 20의 등거리, 원형 플랫폼 이루어져이 neurobehavioral 작업에 사용 되는 장치 플랫폼, 경계에서 3 cm에 있는 5 cm 직경 원형 구멍. 장치 등반에서 동물을 방지 하기 위해 바닥에서 상승 된 50 cm 이다. 움직이는 검은 플라스틱 탈출 상자 (20 cm x 15 cm x 5 cm) 탈출 구멍 아래에 배치 됩니다. 검은 미로 흰 쥐, 테스트를 위해 사용 되 고 추적 시스템 소프트웨어 사용 하는 경우 블랙 매트 미로에서 배치 되어야 합니다.
      1. 밝은 간접 점화를 가진 조용한 방 중앙에 미로 장치를 놓습니다.
      2. 작업 방 문의 외부에 "입력 하지 않으면" 기호를 배치 합니다.
      3. 경계 벽에 시각-공간 신호를 연결 합니다.
      4. 미로 플랫폼 위에 디지털 비디오 카메라를 배치 합니다.
      5. 원치 않는 후 각 큐를 제거 하려면 70% 에탄올과 미로 플랫폼의 표면 청소.
      6. 후 각 큐 역할을 탈출 상자 안쪽에 동물의 홈 장에서 침구의 작은 금액을 추가 합니다.
   2. 적응 세션
      1. 가져올 각 마우스 마우스 길 들 여가를 위해서에서 실험을 시작 하기 전에 작업 공간 약 30 분.
      2. 그것의 감 금에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 1 분 탈출 상자에 동물을 배치.
   3. 교육 세션
      참고: 교육 세션 4 연속적인 일에 각 마우스에 대 한 반복 됩니다.
      1. 부드럽게 탈출 상자에서 마우스를 제거 합니다.
      2. 장소; 경기장의 센터에 마우스 다음, 시작 챔버를 위에 마우스를 놓습니다.
      3. 10 후 시작 챔버를 제거 s, 마우스 3 분 동안 경기장을 탐구 하 고.
      4. 조용히 고 컴퓨터 영역에 넣어 소음 취소 헤드폰으로 이동 합니다.
      5. 플랫폼 수준에서 약 80 dB의 큰 백색 잡음의 구성 된 부정적인 청각 자극을 실행 하 고 마우스를 찍고 시작 합니다.
      6. 백색 잡음을 끄고 마우스 탈출 상자로 들어갈 때 찍고 중지. 1 분에 대 한 상자에 그대로 남아 동물 허용.
      7. 이스케이프 상자에서 마우스를 제거 하 고 다시 그것의 감 금 소에 배치.
      8. 3.4.2 3.4.7 통해 단계를 반복 반복된 실험 사이 3 분 간격으로 하루 4 배.
         참고: 모든 실험, 사이 경기장 표면에서 소변 이나 대변을 제거 하 고 70% 에탄올과 미로 청소.
   4. 프로브 시험 세션
      1. 마지막 훈련 재판, 24 시간 후, 다음 미로 플랫폼에서 탈출 상자를 제거 하 고 3.4.2 3.4.5 통해 단계를 반복 합니다.
      2. 3 분 후 백색 잡음을 해제 하 고 찍고 중지 합니다. 마우스 미로 경기장에서 제거 하 고 다시 그것의 감 금에 그것을 배치.
      3. 모든 동물을 테스트 후 미로 플랫폼 및 시작 챔버 청소. 방에 불을 끄고 문을에서 "입력 하지 않으면" 기호를 제거.
      4. 추가 분석을 위해 외부의 하드 드라이브를 테스트 세션에서 비디오 녹화를 저장 합니다.
      5. 비디오 추적 소프트웨어 프로그램 및 추출 프로브 시험 세션 시 대상 사분면에 소요 되는 훈련 세션의 4 일 동안 대상 구멍을 찾을 수 대기 시간 및 시간을 포함 하 여 녹화 된 동영상에서 매개 변수를 설정 합니다.

4. 생 화 학적 평가

1. 해 마에서 ATP 수준
   1. 깊이와 케 타 민 (체중의 그램 당 100 밀리 그램) 및 xylazine (체중의 그램 당 10 밀리 그램)의 혼합물의 복 주사 각 마우스 anesthetize.
   2. 동물을 목을 벨 하 고 빠르게 두개골에서 뇌 조직의 제거.
   3. 해 마 개 dissect 그리고 조직 균질 화기와 차가운 샘플 버퍼 (키트에 의해 제공) 조직 균질.
   4. 즉시 원심 2000 x g 4 ° c.에 3 분에 homogenate
   5. 깨끗 한 튜브는 상쾌한 전송.
   6. spectrophotometric를 사용 하 여 hippocampal ATP 수준을 평가 방법은 앞에서 설명한¹¹.

결과

통계 분석

양방향 ANOVA;에 의해 반 즈 훈련 세션에서 가져온 데이터의 통계 분석 분석 다른 행동 테스트와 분석 그룹 사이의 hippocampal ATP 레벨의 일방통행 ANOVA, Tukey의 포스트 hoc 테스트 다음에 의해 실행 되었다. 모든 데이터는 의미 ± 표준 편차 (SD)으로 표시 되는 레이저 전송 데이터 제외 ± 표준 오차 (SEM), 의미의 ...

토론

우리 쥐에서 transcranial PBMT 절차 수행을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 특히 설치류에 초점을 맞춘 photobiomodulation 연구를 수행 하는 신경 과학 연구소를 타겟으로하는. 그러나,이 프로토콜 토끼, 고양이, 개, 또는 원숭이 등 신경 과학 분야에서 자주 사용 되는 다른 실험 동물에 적응 될 수 있다.

현재, 증가 관심 transcranial PBMT 레드/적외선 레이저와 Led를 조사 하 고...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100