Протокол для транскраниальной терапии фотомодуляции мышей

Резюме

Фотомодуляция терапия является инновационным неинвазивной механизм для лечения широкого спектра неврологических и психиатрических расстройств и также может улучшить функцию здорового мозга. Этот протокол включает в себя пошаговое руководство для выполнения фотомодуляции мозга мышей, транскраниальная света доставки, которые могут быть адаптированы для использования в других лабораторных грызунов.

Аннотация

Транскраниальная фотомодуляции является потенциальным инновационные неинвазивной терапевтический подход для улучшения мозга биоэнергетики, функции мозга в широком диапазоне неврологических и психиатрических расстройств и улучшения памяти в возрастных когнитивными и нейродегенеративных заболеваний. Мы описываем Лаборатория протокол для транскраниальной фотомодуляции терапии (PBMT) у мышей. Возрасте от мышей BALB/c (18 месяцев), рассматриваются с 660 нм лазер transcranially, один раз в день в течение 2 недель. Лазерная пропускание данных показывает, что примерно 1% падающего красный свет на волосистой части головы достигает 1 мм глубина от поверхности коры, проникая спинной гиппокампа. Результаты лечения проводится двумя методами: Барнс лабиринт тест, который является задача гиппокамп зависимых пространственного обучения и памяти оценки, и измерения гиппокампа уровнях ATP, которых используется в качестве индекса биоэнергетики. Результаты от Барнс задачи показывают повышение пространственной памяти в лазерное лечение возрасте мышей при сравнении с соответствием возраст элементов управления. Биохимический анализ после лазерного лечения показывает увеличение гиппокампа уровнях ATP. Мы постулат, что повышение производительности памяти потенциально связано улучшение гиппокампа энергии метаболизма, вызванных красным лазером. Замечания в мышей может быть продлен до других животных моделей, поскольку этот протокол потенциально могут быть адаптированы для других видов, часто используемых в Поступательное неврологии, как кролик, кошка, собака или обезьяна. Транскраниальная фотомодуляции является безопасной и экономически модальность, которая может быть многообещающим терапевтический подход в когнитивных нарушений, связанных с возрастом.

Введение

PBMT, или низкого уровня лазерного света терапии (LLLT), это общий термин, который относится к терапевтические методы, основанные на стимулирование биологических тканей, световой энергии от лазеров или светоизлучающие диоды (СИД). Почти все PBMT лечения применяются с красным возле ИК-области спектра (NIR) света на длинах волн от 600 до 1100 Нм, мощностью от 1 до 500 МВт и флюенса, начиная от < 1 > 20 Дж/см² (см. Чун et al.¹).

Транскраниальная PBMT — метод неинвазивного света доставки, который проводится облучение головы с использованием внешнего источника света (лазер или светодиоды)². Для животных приложений этот метод включает в себя контактные или бесконтактные размещения LED или лазерный зонд на голову животного. В зависимости от области терапевтический интерес зондом света могут быть размещены на всю голову (для покрытия всех областях мозга) или через определенную часть головы, например префронтальной, лобной или теменной области. Частичная передача красный/NIR света через головы, череп и твердой мозговой оболочки может достигать корковых уровня поверхности и обеспечивают количество энергии фотона, достаточного для получения терапевтического эффекта. Впоследствии поставленный света Флюенс на уровне кортикальной будет передаются в серый и белый мозгового вещества, до тех пор, пока он достигает более глубоких структур мозга³.

Спектр поглощения цитохрома с-оксидазы, терминал ферментов дыхательной цепи митохондрий⁴соответствует света в спектральных диапазонах на красной far-red региона (600-680 нм) и раннего NIR региона (800-870 нм). Можно предположить, что PBMT в спектре красный/NIR вызывает фотодиссоциации оксида азота (NO) от цитохрома с-оксидазы, что привело к увеличению митохондриальной переноса электронов и, в конечном счете, увеличить СПС поколение⁵. Что касается нейрональных приложений потенциальные преимущества neurostimulatory мозга с помощью транскраниальной облучения, которую методы были зарегистрированы в различных доклинических исследований, в том числе грызунов модели черепно-мозговой травмы (ЧМТ)⁶, PBMT острый инсульт⁷, болезни Альцгеймера (AD)⁸, болезни Паркинсона (PD)⁹, депрессии¹⁰и старения¹¹.

Старение мозга считается нейропсихологических условие, которое негативно сказывается на некоторых когнитивных функций, таких как обучение и память¹². Митохондрии являются основным органеллы, ответственных за производство АТФ и Биоэнергетика нейронов. Митохондриальной дисфункции как известно быть связан с возрастным дефицитом в областях мозга, которые связаны с пространственной навигации памяти, таких как гиппокамп¹³. Потому что черепных лечение с красным/NIR свет главным образом акты модуляции митохондриальной биоэнергетики, достаточные поставки дозировки света в гиппокампе может привести к улучшение пространственной памяти результаты¹⁴.

Целью протокола является продемонстрировать транскраниальная PBMT процедуры в мышей, используя низкий уровень красного света. Описаны необходимые лазерные светопропускание измерений через головы ткани возрасте мышей. Кроме того Барнс лабиринт, как гиппокамп зависимых пространственного обучения и памяти задачи и гиппокампа уровни ATP, как индекс биоэнергетики, используются для оценки воздействия лечения животных.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов здравоохранения (низ; Публикация № 85-23, пересмотренная 1985 года) и утвержден Комитетом регионального этики Тебриз университета медицинских наук.

Предупреждение: Этот протокол включает в себя применение класса 3B лазерных инструментов и потребует надлежащей подготовки и соблюдение руководящих принципов обеспечения безопасности. Класс 3B лазеры могут серьезно повредить глаза и может тепла кожи. Класс 3B лазеры не считаются ожог. Необходимо носить очки защита глаз в любое время при эксплуатации лазерного устройства.

1. Лазерная светопропускание эксперименты

Примечание: Используется здесь были три 18-месячного самцов мышей BALB/c, получены от животных фонда Тебриз Университет медицинских наук. 60 МВт лазер (660 нм) с лучом круговой формы диаметром 2,5 мм используется в качестве источника света. Лазерный источник производит циркулярно поляризованный свет с профиль Гаусса интенсивности и эксплуатируется в непрерывная волна режиме. Измеритель мощности коммерческих фотодиод с разрешением 10 nW, квадратный 1 см² фотодиода активной области и спектральной диапазоне от 400 до 1100 нм используется для измерения передачи силы света через образцы.

1. Подготовка образца
   1. Для того, чтобы получить свежие образцы, глубоко анестезировать мыши с смесью кетамин (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
   2. Вскрыть мыши голова с регулярной ножницами, начиная от точки, расположенной чуть выше плеч.
   3. Поворот головы, так что вентральной стороне челюсти стоят. Слайд угловой Рассечение ножницами плавно через полость рта, пока не заметил сопротивление стыке нижней челюсти. Вырезать все большие мышцы, связывание челюсти кости черепа и отбросить их.
   4. Удаление небных костей, угловой Рассечение ножницами.
   5. Отменить все живое вокруг черепа, используя Изогнутый пинцет.
   6. Вскрыть в нижней части черепа, а затем, тщательно мозг из остальных костей черепа, с изогнутой шпателем.
   7. Исправьте нетронутыми мозговой ткани в 2% агарозном геле так ткани будет пригодных для нарезки.
      Примечание: Чтобы получить нетронутыми череп плюс головы образца, ткани мозга исключить из вентральной стороне головы животного без повреждения спинной части головы.
2. Мозг, нарезка процедуры
   1. Распространение каплю суперклея (~0.05 мл) на поверхности vibratome монтажный блок.
   2. Тщательно Прикрепите блок агарозы для vibratome монтажа блока, так что вентральной поверхности мозга лицевой стороной и скорректировать свою позицию.
   3. Слегка матч vibratome лезвие до верхней поверхности блока агарозы и запишите значение резец как начального уровня.
   4. Заполните бак vibratome с ледяной нормальный физиологический раствор.
   5. Отрегулируйте значения параметров vibratome (например, толшины [1 мм], скорость [5 из 5 на единица устройства] и частота вибрации [5 из 5 на единица устройства]) для получения удовлетворительного нарезки.
   6. Вырежьте мозг поперечно в срез с 1000 мкм толщиной.
      Примечание: Фрагмент является частью ткани мозга, разделенных кортикального слоя поверхности и плоскости расположены 1000 мкм уступает поверхности коры (спинной гиппокампа).
   7. Добавить каплю воды (~0.05 мл) на поверхности оптического стекла и поставить мозг срез поверх него. Затем добавить каплю воды на мозг срез и осторожно поместите второй оптическое стекло поверх него.
      Примечание: Капля воды следует добавить к границам образца стекла во избежание высыхания ткани и светорассеянию от неровных поверхностей.
3. Измерение света передачи через голову ткани
   1. Настройка оптического оборудования, включая лазерный прибор, отражающие зеркала и блок питания метр.
      Предупреждение: Наденьте очки защитные глаз до поворота на лазер.
   2. В отсутствие образца на измеритель мощности включите устройство лазера и сфокусировать лазерный луч на зеркале, расположенный в надлежащее расстояние для направления луча, перпендикулярно фотодиод активной области.
      Примечание: Измерения коэффициента пропускания света должны быть выполнены в тёмной комнате при комнатной температуре (23-25 ° C), в течение 30 мин после извлечения головы тканей.
   3. Выполнения измерений на ломтики мозговой ткани.
      1. Место два пустых оптических стекол на поверхности измерителя мощности.
      2. Читайте передаваемая мощность света (я₀) от измеритель мощности экран и запишите значение.
      3. Осторожно поместите образец мозга, который охватывается два оптических стекол, на поверхности измерителя мощности, фокус пучка на ткани в соответствующей области, читать передаваемая мощность и запишите значение.
   4. Выполнения измерений на череп плюс волосистой части головы.
      1. Место пустым оптического стекла на поверхности измерителя мощности.
      2. Читайте передаваемая мощность света (я₀) от измеритель мощности экран и запишите значение.
      3. Слегка место оптического стекла с свежим череп плюс головы ткани на поверхности измерителя мощности, матч луч света в bregma зоне, читать передаваемая мощность и запишите значение.
      4. Чтобы максимизировать отношение сигнал шум, повторите измерение степени пропускания света по крайней мере 3 x для всех образцов.
         Примечание: В зоне bregma помещается в приблизительно 3 мм ростральной линию через переднюю основания ушей. Толщина ткани череп плюс головы измеряется стандартных суппортов.

2. фотомодуляции терапия (PBMT)

Примечание: 45 самцов мышей BALB/c, назначаются три группы 15 мышей были использованы. Эти группы состоят из молодых контроль мышей (2 месяца), которые получили Шам PBMT, возрасте контроль мышей (18 месяцев), которые получили Шам PBMT и престарелых PBMT мышей (18 месяцев), которые получили PBMT. Шам PBMT лечение состояло из лечения идентичен PBMT группы, но с лазером неактивным. Мыши были получены от животных фонда Тебриз университета медицинских наук и были размещены в животное, держа блок нейронаук центр исследований (состояния) на 24-25 ° C и 55% относительной влажности, с 12 h свет и темные фотопериода 12 h. Пища и вода были предоставлены ad libitum. Все мыши были акклиматизированы для по крайней мере за 1 неделю до начала лечения.

1. Лазерное лечение
   Примечание: Лазер диода GaAlAs с незатухающая волна режиме при 660 нм длины волны был использован для лечения транскраниальная PBMT. Лазерный прибор эксплуатировался на выходной мощностью 200 ± 2 МВт и освещенность 6.66 Вт/см², пятно размером 0,03 cm². Средняя Флюенс 99.9 Дж/см² на каждой сессии было доставлено к поверхности головы для 15 s облучения. Облучение был administered 1 x ежедневно в течение 2 недель подряд.
   1. Принесите мышей в их дома клетки в комнату терапии, примерно 20 минут, до начала лечения.
   2. Подключите электрический протектор к электрической розетке.
   3. Вставьте вилку устройства лазера в электрической защиты.
   4. Обложка кончик лазерный излучатель с прозрачной нейлоновой пленкой во избежание каких-либо царапин на поверхности.
   5. Аккуратно подключите датчик к каналу лазерного устройства.
   6. Включите устройство лазера и подождать несколько секунд для того чтобы согреться.
   7. Отрегулируйте значения параметров/лазером, включая время и эксплуатации режим облучения.
   8. В отсутствие любых образцов определите средняя мощность лазера, обратившись кончик зонда для активной области измеритель мощности лазерного устройства. Запишите значение.
   9. Повторите процесс калибровки (шаг 2.1.8) по крайней мере 5 x, читать инцидента полномочия от измеритель мощности экран и записать значения.
   10. Нежно держать мышь на спинной кожи шеи животного в ладони и обездвижить свою голову.
       Примечание: В текущем протоколе, лазерный излучатель размещен на bregma зона, которая составляет ~ 3 мм ростральной линию между внутренней основания ушей.
   11. Слегка место кончике зонда непосредственно на кожу головы на средней линии, примерно 3 мм ростральной линию через переднюю основания ушей.
       Примечание: Держать датчик на примерно под углом 45° к плоскости живота.
   12. Во избежание прямого облучения для глаза животного, первый контакт кончик зонда на голове и, затем, включите устройство лазера.
   13. Включите лазер и стабильно удерживать зонд до завершения облучения.
   14. После окончания терапии снять лазерный излучатель с головы и осторожно вернуть мышь к своей клетке.
   15. Лазерное устройство выключить и отключить зонда от устройства.
   16. Очистите лазерный излучатель с соответствующей оптических пылесоса.
   17. Трансфер мышей в объекте животных.

3. поведенческих задач

1. Открыть полевые испытания
   1. Оценить опорно-двигательной активности каждого мыши на общее расстояние ездил во время испытания на открытых местах, как описано ранее,¹⁵.
2. Задание лабиринт Барнс
   1. Аппарат
      Примечание: Пространственные задачи обучения и памяти выполняется в лабиринт Барнс¹⁶. Аппарат используется для этой задачи нейроповеденческих состоит из круговой платформы, сделанные из черного дерева (95 см в диаметре) с 20 равноотстоящих, 5 см в диаметре круглые отверстия, которые расположены на платформе, 3 см от периметра. Аппарат является повышенный 50 см от пола для предотвращения животное от восхождения. Окно Подвижной черный пластиковый побег (20 см х 15 см х 5 см) помещается под отверстием побег. Черный лабиринт используется для тестирования белых мышей, и черный матовый должны быть поставлены под лабиринт, когда используется программное обеспечение, системы слежения.
      1. Место лабиринт аппарат в центре тихой комнате с ярким освещением накладных.
      2. Место «Не входить» знак на внешней двери номер задачи.
      3. Прикрепите визуально пространственным подсказки по периметру стен.
      4. Позиция цифровая видеокамера выше платформы лабиринта.
      5. Очистите поверхность платформы лабиринта с 70% этанол, чтобы удалить нежелательные обонятельные сигналы.
      6. Добавьте небольшое количество кроватей из дома клетка животного внутри окна бежать служить обонятельных биток.
   2. Адаптация сессия
      1. Принесите каждой мыши целевой номер около 30 мин до начала эксперимента, чтобы мыши, чтобы стать привыкли.
      2. Удалить из своей клетки мыши и осторожно поместите животное в поле бежать за 1 мин.
   3. Учебная сессия
      Примечание: На тренировке повторяется для каждой мыши на 4 дней подряд.
      1. Аккуратно удалите мыши из окна побег.
      2. Поместите указатель мыши в центре арены; затем место начала палата верхней части мыши.
      3. Снимите камеру Пуск после 10 s и позволить мыши, чтобы исследовать Арена на 3 мин.
      4. Спокойно двигаться в компьютерной области и надеть шума Отмена наушники.
      5. Спровоцировать негативные слуховой стимул, состоящий из громкий белый шум примерно в 80 дБ на уровне платформы и начать видеозапись мыши.
      6. Выключить белый шум и остановить видеозаписи, когда указатель мыши входит ящик побега. Позвольте животному остаются нетронутыми в поле за 1 мин.
      7. Удаление мыши из окна побег и поместите его обратно в своей клетке.
      8. Повторите шаги 3.4.2 через 3.4.7 4 x в сутки, с интервалом 3 мин между повторных испытаний.
         Примечание: Между всеми процессами, удалите любые моче или Кале от поверхности Арена и очистите лабиринт с 70% этиловом спирте.
   4. Зонд судебная сессия
      1. После последнего судебного процесса обучения 24 h позже, удалите поле побег из лабиринта платформы и повторите шаги 3.4.2 через 3.4.5.
      2. После 3 минут выключите белый шум и остановить видеозаписи. Удаление мыши из лабиринта Арена и поместите его обратно в своей клетке.
      3. После того, как все животные были протестированы, очистите платформы лабиринта и запуска камеры. Выключите свет номер и удалите знак «Не входить» от двери.
      4. Храните видеозаписи от тестирования сессий на внешний жесткий диск для дальнейшего анализа.
      5. Настройка видео отслеживания программного обеспечения и извлечь параметры интерес из записанных видео, включая время ожидания для поиска целевой дыра в течение 4 дней учебных занятий и время провел в квадранте целевой зонд суда сессии.

4. биохимическая Оценка

1. Уровни ATP в гиппокампе
   1. Глубоко анестезировать каждая мышь с внутрибрюшинного введения смеси кетамин (100 мг на грамм массы тела) и ксилазина (10 мг на грамм веса тела).
   2. Обезглавить животного и быстро удалить ткани мозга от черепа.
   3. Вскрыть из гиппокампа и гомогенизации ткани в ледяной пример буфера (предоставляется комплект) с гомогенизатор ткани.
   4. Сразу же центрифуга огневки на 2000 x g 3 мин при 4 ° C.
   5. Передача супернатант чистую пробирку.
   6. Оценить гиппокампа уровни ATP, используя спектрофотометрический метод как описано выше¹¹.

Результаты

Статистический анализ

Статистический анализ данных, полученных из учебных занятий Барнс был проанализирован двусторонний ANOVA; другие поведенческие тесты и анализ уровня гиппокампа СПС между группами были совершены одностор...

Обсуждение

Мы описываем протокол для проведения процедуры транскраниальная PBMT в мышах. Этот протокол предназначен для неврологии лаборатории, которые выполняют фотомодуляции исследования сосредоточены на грызунов. Однако этот протокол может быть адаптирована к другим лабораторных животных, к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100