Farelerde Transkraniyal Photobiomodulation tedavisi için bir iletişim kuralı

Özet

Photobiomodulation tedavi geniş bir nörolojik ve psikiyatrik hastalıkların tedavisi için yenilikçi bir noninvaziv modalite ve aynı zamanda sağlıklı beyin fonksiyonlarını artırabilir. Bu iletişim kuralı tarafından diğer laboratuvar Rodents kullanmak için adapte edilebilir Transkraniyal ışık teslim farelerde beyin photobiomodulation gerçekleştirmek için adım adım yönergeler içerir.

Özet

Transkraniyal photobiomodulation beyin bioenergetics, beyin fonksiyonları nörolojik ve psikiyatrik bozukluklar geniş bir alanda ve bilişsel gerileme yaşa bağlı hafıza geliştirme geliştirmek için bir potansiyel yenilikçi noninvaziv terapötik yaklaşımdır ve nörodejeneratif hastalıklar. Biz Transkraniyal photobiomodulation terapi (PBMT) fareler için bir laboratuvar protokol tanımlamak. Yaşlı BALB/c fare (18 aylık) bir 660 nm lazer transcranially, 2 hafta boyunca günde bir kez ile tedavi edilir. Olay kırmızı ışık kafa derisi üzerinde yaklaşık % 1'i dorsal hipokampus penetran kortikal yüzeyden 1 mm derinlik ulaşır lazer geçirgenliği verileri gösterir. Tedavi sonuçları iki yöntemle değerlendirilir: bir Barnes labirent bir hipokampus bağımlı kayma öğrenme ve hafıza görev değerlendirme test ve bioenergetics Dizin kullanılan ölçüm hipokampal ATP düzeyleri. Barnes görev sonuçlarını uzamsal bellek donanım yaş eşlemeli denetimleri ile karşılaştırıldığında lazer tedavi Yaşlı fareler gösterir. Lazer tedavisi gösterir sonra biyokimyasal analiz hipokampal ATP düzeyleri artmış. Bellek performansı geliştirme potansiyel bir gelişme kırmızı lazer tedavi ile indüklenen hipokampal enerji metabolizması nedeniyle olduğunu varsayıyorum. Bu iletişim kuralı potansiyel translasyonel nörolojik, tavşan, kedi, köpek veya maymun gibi sık kullanılan diğer türler adapte beri gözlemler farelerde hayvan diğer modeller için uzun olabilir. Transkraniyal photobiomodulation kognitif bozukluk yaşa bağlı olarak umut verici bir tedavi yaklaşımı olabilir bir güvenli ve uygun maliyetli yöntemidir var.

Giriş

PBMT veya alt düzey lazer ışık tedavisi (LLLT), biyolojik doku uyarılması lazer veya ışık - yayan diyotlar (LED'ler) ışık enerjisi tarafından temelli tedavi yöntemleri başvurduğu genel bir terimdir. Hemen hemen tüm PBMT tedaviler ile yakın kızılötesi (Nur) ışık dalga boylarında, kırmızıdan 600 1100 nm, 1 ile 500 arasında bir çıkış gücü uygulanır mW ve < 1-> değişen bir akım 20 J/cm² (bkz: Chung vd.¹).

Transkraniyal PBMT başından bir dış ışık kaynağı (lazer veya LED'ler)²kullanarak ışınlama tarafından yürütülen bir noninvaziv ışık teslim yöntemidir. Hayvan uygulamaları için ilgili kişi veya aygıtlar hayvanın kafasında LED veya lazer prob yerleşimini bu yöntem içerir. Faiz tedavi bölgeye bağlı olarak, hafif bir sonda (için tüm beyin bölgeleri kapsayan) tüm Merkez over veya baş, prefrontal, frontal veya parietal bölge gibi belirli bir bölümünün üzerine yerleştirilebilir. Kırmızı/nur ışık kafa derisi, kafatası ve dura mater kısmi iletim kortikal yüzey seviyesine ulaşmak ve foton enerji terapötik yararları üretmek için yeterli bir miktar sağlar. Daha sonra beyin³daha derin yapıların ulaşıncaya kadar teslim edilen hafif dozda kortikal düzeyinde gri ve beyaz beyin dokusu dağıtılmasını.

Işık Red far-red bölge (600-680 nm) ve erken NIR bölge (800-870 nm) spektral bantlarında sitokrom c oksidaz, mitokondrial solunum zinciri⁴terminal enzim soğurma spektrumu karşılık gelir. PBMT kırmızı/NIR spektrumda mitokondrial elektron taşıma artışlar sonuçlanan photodissociation nitrik oksit (NO) sitokrom c oksidaz, neden olur ve sonuçta, ATP üretimi⁵arttı, onaylanmadığına karar. Nöronal uygulamaları ile ilgili potansiyel neurostimulatory yararları preklinik çalışmaları, travmatik beyin hasarı (TBY)⁶kemirgen modelleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemleri bildirilmiştir Transkraniyal ışınlama kullanarak PBMT beyin, Akut inme⁷, Alzheimer hastalığı (Ah)⁸, Parkinson hastalığı (PD)⁹, depresyon¹⁰ve yaşlanma¹¹.

Beyin yaşlanma olumsuz yönde etkileyen öğrenme ve hafıza¹²gibi bazı bilişsel işlevler nöropsikolojik bir durum olarak kabul edilir. Mitokondri birincil organelleri ATP üretimi ve nöronal bioenergetics sorumlu vardır. Mitokondrial disfonksiyon Mekansal kullan bellek, hipokampus¹³gibi bağlı olan beyin bölgeleri içinde yaşa bağlı açıkları ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Çünkü mitokondriyal bioenergetics modülasyon tarafından öncelikle eylemleri kırmızı/NIR ile kafatası tedavi ışık hipokampüs yeterli teslim edilen ışık dozajı mekansal hafıza sonuçları¹⁴düzelme neden olabilir.

Geçerli protokol amacı Transkraniyal PBMT yordam farelerde, kırmızı ışık seviyesinin düşük kullanarak göstermektir. Gerekli lazer ışık geçirgenliği ölçümleri yaşlı farelerin baş dokular ile açıklanmıştır. Ayrıca, Barnes labirent, hipokampus bağımlı kayma öğrenme ve bellek görev ve hipokampal ATP düzeyleri, bir bioenergetics dizin olarak olarak kullanılan hayvanlarda tedavi etkisi değerlendirilmesi.

Protokol

Tüm yordamları uygun olarak Kılavuzu bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH; için yapılmıştır Yayın No 85-23, 1985) revize ve Tebriz Üniversitesi Tıp Bilimleri bölgesel Etik Komitesi tarafından onaylanmış.

Dikkat: Bu iletişim kuralı uygulama sınıf 3B lazer aletleri içerir ve uygun eğitim ve güvenlik kurallarına bağlılık gerektirir. Sınıf 3B lazer gözler ciddi zararlar verebilir ve cilt ısı olabilir. Sınıf 3B lazerler yanmak tehlike kabul edilmez. Göz koruma gözlüğü yıpranmış gerekir her zaman laser cihazı çalışırken.

1. lazer ışık geçirgenliği deneyler

Not: burada kullanılan üç 18 aylık erkek BALB/c fare Tebriz Üniversitesi Tıp Bilimleri hayvan tesisten elde edilmiştir. 60 mW lazer (660 nm) ile dairesel bir ışın Şekil 2.5 mm çapında, ışık kaynağı olarak kullanılır. Lazer kaynak bir Gauss yoğunluğu kasalı dairesel yayın yapan bir ışık üretir ve sürekli dalga modunda işletilmektedir. Bir ticari fotodiyot güç metre 10 KB çözünürlük, bir kare 1 cm² fotodiyot etkin alanı ve bir spektral yanıt--dan 400 ile 1100 nm ile örnekleri aracılığıyla gönderilen ışık güç ölçmek için kullanılır.

1. Numune hazırlama
   1. Taze örnekleri edinmek için fareyi ketamin (100 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) karışımı ile derin anestezi.
   2. Fare kafa sadece omuzları bulunan noktadan başlayarak düzenli makasla parçalara.
   3. Çene ventral tarafı yukarı dönük baş döndürür. Açılı diseksiyon makası ağız boşluğu ile sorunsuz çene kemiğinde kavşak dayanıklılığını fark edene kadar kaydırın. Tüm büyük kas mandibula kemik kafatası bağlama kesmek ve onları atın.
   4. Palatine bones, açılı diseksiyon makası kullanarak kaldırın.
   5. Bütün eti eğri forseps kullanarak kafatasını çevreleyen atmak.
   6. Kafatasının alt kısmındaki incelemek ve sonra dikkatle dışında kalan kafatası kemik, beyin kavisli bir spatula ile almak.
   7. Doku Dilimleme için uygun olur, böylece sağlam beyin dokusu içinde % 2 özel jel düzeltmek.
      Not: sağlam bir kafatası elde artı örnek kafa derisi için beyin dokusu hayvanın kafası zarar vermeden ventral taraftan baş dorsal kısmındaki kaldırılması gerekir.
2. Yordam Dilimleme beyin
   1. Yapıştırıcı (~0.05 mL) bir damla vibratome montaj blok yüzeyine yayılmış.
   2. Dikkatlice böylece beyin ventral yüzeyinde yüzüstü blok montaj vibratome özel blok eklemek ve konumunu ayarlayın.
   3. Biraz maç özel blok üst yüzeyine vibratome bıçak ve kesici değeri birincil düzeyde olarak kaydedin.
   4. Vibratome tank buz gibi normal tuzlu çözüm ile doldurun.
   5. Tatmin edici Dilimleme elde etmek için (örneğin, dilim kalınlığı [1 mm], hız [5 / 5 aygıt birim üzerinde] ve titreşim frekansı [5 / 5 aygıt birim üzerinde]) vibratome parametreleri ayarlayın.
   6. Beyin kemiği ile 1000 µm kalınlık içine bir dilim kes.
      Not: Dilim kortikal yüzeyi tarafından ayrılmış beyin dokusu bölümüdür ve bir uçak 1000 µm kortikal yüzeyi (dorsal hipokampus) aşağı konumlandırılmış.
   7. Bir damla su (~0.05 mL) optik cam yüzeyde ekleyin ve beyin dilim üstüne koydu. Daha sonra bir damla su on beyin dilim ekleyin ve dikkatlice ikinci optik cam üstüne koyun.
      Not: Bir damla su, kurutma doku ve kaba yüzeyler arasında saçılma ışık önlemek için örnek cam sınırları için eklenmelidir.
3. Baş dokuları aracılığıyla ışık geçirgenliği ölçümü
   1. Aynalar ve güç metre birimi yansıtan laser cihazı dahil olmak üzere optik cihazın ayarlayın.
      Dikkat: üzerine lazer Torna önce koruyucu göz gözlük koymak.
   2. Bir örneğe bağlı olarak güç metre yokluğunda lazer aygıtı açın ve fotodiyot'ın aktif bölgesine dikey kiriş rehberlik için uygun mesafede bulunur ayna lazer ışını odaklanmak.
      Not: Işık geçirgenliği ölçüm, oda sıcaklığında (23-25 ° C), karanlık bir odada baş dokular elde edilmiştir sonra 30 dk içinde gerçekleştirilmesi gerekir.
   3. Ölçümler dilimlenmiş beyin dokusu üzerinde gerçekleştirin.
      1. İki boş optik gözlük güç metre bir yüzeye yerleştirin.
      2. Gönderilen ışık güç okuyun (ben₀) güç ölçer'ın perde göstermek ve değeri kaydedin.
      3. Yavaşça iki optik gözlük tarafından kapsıyordu, beyin örnek güç metre yüzeye ışın doku'nın ilgili alan üzerinde odaklanmak, gönderilen güç okuyun ve değeri kaydedin.
   4. Ölçümler kafatası artı kafa derisi üzerinde gerçekleştirin.
      1. Boş bir optik cam güç metre bir yüzeye yerleştirin.
      2. Gönderilen ışık güç okuyun (ben₀) güç ölçer'ın perde göstermek ve değeri kaydedin.
      3. Hafifçe bir optik cam taze kafatası ile yer artı güç metre yüzeyinde doku kafa derisi, ışık demeti bregma bölgede maç, gönderilen güç okuyun ve değeri kaydedin.
      4. Sinyal-gürültü oranı en üst düzeye çıkarmak için en az 3 ışık geçirgenliği ölçüm tekrar x tüm örnekleri için.
         Not: Bregma bölge yerleştirilen bir yaklaşık 3 mm rostral kulakları ön Bankası çizilen bir çizgi için. Kafatası artı kafa derisi doku kalınlığı standart bir kumpas ile ölçülür.

2. Photobiomodulation terapisi (PBMT)

Not: 15 fareler üç gruba atanan kırk beş erkek BALB/c fareler kullanıldı. Gruplar sahte-PBMT, sahte PBMT alınan yaşlı kumandalı fare (18 aylık) ve PBMT alınan yaşlı PBMT fareler (18 aylık) alınan genç-kontrol fare ile (2 aylık) oluşturuldu. Sahte-PBMT tedavi tedavi için PBMT aynı grup ama etkin olmayan lazer ile oluşuyordu. Fareler Tebriz Üniversitesi Tıp Bilimleri hayvan tesisten elde edilmiştir ve birim Nöroloji Araştırma Merkezi (NSRC) 12 h ışık ve karanlık 12 h photoperiod 24-25 ° C ve %55 bağıl nem, holding hayvan muhafaza. Gıda ve su ad libitumverilmiştir. Bütün fareler en az 1 hafta önce tedavi acclimatized.

1. Lazer tedavi prosedürü
   Not: 660 nm dalga boyu sürekli dalga modu ile diyot GaAlAs lazer Transkraniyal PBMT tedavisi için kullanıldı. Laser cihazı 200 ± 2 mW çıkış gücünü ve 6,66 W/cm², bir olma 0.03 cm²spot büyüklüğü ile ameliyat. Her oturum başına 99,9 J/cm² ortalama bir akım 15 kafa derisi yüzeye teslim edildi radyoterapi s. Işınlama yönetilen 1 oldu x 2 ardışık hafta boyunca her gün.
   1. Fareler terapi odası, tedaviye başlamadan önce yaklaşık 20 dk içinde onların ev kafes getirmek.
   2. Bir elektrik koruyucu duvar prizine takýn.
   3. Elektrikli bir koruyucuya lazer cihazı takın.
   4. Lazer sonda şeffaf naylon film ile ucu herhangi bir yüzeye çizilmemesi önlemek için kapak.
   5. Dikkatle sonda laser cihazı kanala bağlanmak.
   6. Lazer aygıtı açın ve ısınmak için bunun için birkaç saniye bekleyin.
   7. Işınlama zaman ve işlem modu dahil olmak üzere lazer/tedavi parametrelerini ayarlamak.
   8. Herhangi bir örnekleri yokluğunda, lazer ortalama güç lazer cihazın güç metre etkin alanına sonda ucunda irtibata geçerek belirlemek. Değeri kaydedin.
   9. (Adım 2.1.8) kalibrasyon işlemi yineleyin en az 5 x, okuma güç ölçer'ın olay güçlerden ekran görüntülemek ve değerleri kaydetmek.
   10. Yavaşça bir avuç hayvanın boynuna dorsal cilt tarafından bir fare tutun ve başının immobilize.
       Not: geçerli protokol ~ 3 mm kulak iç tabanı arasında çizilen bir çizgi rostral bregma bölge lazer sonda yerleştirilir.
   11. Hafifçe doğrudan orta hat yaklaşık 3 mm rostral kulakları ön Bankası çizilen bir çizgi için kafa derisi üzerinde prob ucu yerleştirin.
       Not: sonda, tutun bir yaklaşık 45 derecelik açıyla uçağa karın.
   12. Hayvanın gözleri doğrudan ışınlama önlemek amacıyla, ilk başından sonda ucunda başvurun ve sonra lazer aygıtı açın.
   13. Üzerine lazer açmak ve stabil sonda ışınlama tamamlanması kadar basılı tutun.
   14. Terapinin sonuna sonra lazer sonda başından geri çekilin ve yavaşça fare onun kafes dönmek.
   15. Lazer cihazı kapatın ve sonda aygıtın bağlantısını kesin.
   16. Lazer sonda bir uygun optik süpürge ile temizlik.
   17. Fareler hayvan tesisine transfer.

3. davranışsal görevleri

1. Açık alan testi
   1. Lokomotor değerlendirmek etkinlik her fare bir açık alan test sırasında olarak toplam mesafe tarafından açıklanan önceden¹⁵.
2. Barnes labirent görev
   1. Aparatı
      Not: Bir Barnes labirent¹⁶' kayma öğrenme ve hafıza görev gerçekleştirilir. Bu neurobehavioral görev için kullanılan cihazlar eşit uzaklıkta, siyah ahşap (95 cm çapında) 20 ile yapılmış bir dairesel platformunun oluşur platformu, çevreyi 3 cm yer alan 5 cm çapında dairesel delik. Aparatı yerden tırmanma hayvan önlemek için yükseltilmiş 50 cm'dir. Bir hareketli siyah plastik kaçış kutu (20 cm x 15 cm x 5 cm) kaçış deliği altında yer alıyor. Siyah bir labirent yerinehamster sınamak için kullanılır ve bir yazılım sistem izleme kullanıldığında bir siyah mat labirent altında yer almalıdır.
      1. Labirent aparatı parlak havai aydınlatma ile sessiz bir oda ortasına yerleştirin.
      2. "Girmeyin" işareti görev oda kapı dışına yerleştirin.
      3. Görsel-uzamsal yardımlar için çevre duvarları iliştirin.
      4. Bir dijital video kamera labirent platformu üzerinde konumlandırın.
      5. İstenmeyen koku ipuçları kaldırmak için % 70 etanol ile labirent platform yüzeyi temizleyin.
      6. Odada küçük bir miktar koku bir işaret hizmet etmek için kaçış kutunun içindeki hayvanın eve kafes ekleyin.
   2. Adaptasyon oturum
      1. Denemede habituated olmak için fare için sipariş başlayan önce görev Oda yaklaşık 30 dk her fare getir.
      2. Fare kendi kafesinden çıkarmak ve yavaşça kaçış kutusunda 1 dk. için hayvan yerleştirin.
   3. Eğitim oturumu
      Not: Eğitim oturumu için her fare üzerinde 4 gün üst üste tekrarlanır.
      1. Yavaşça fare kaçış kutusundan çıkarın.
      2. Fare arena ortasına yerleştirin; o zaman, fareyi üzerine başlangıç odası yer.
      3. Başlangıç odası 10'dan sonra kaldırmak s ve fare arena 3 min için keşfetmek için izin verir.
      4. Sessizce bilgisayar alan ve tarih koymak ses geçirmeyen kulaklık için hareket.
      5. Beyaz gürültü yaklaşık 80 DB platformu düzeyinde oluşan olumsuz bir işitsel uyarıcı tetikler ve fare videoya başlar.
      6. Beyaz gürültü açmak ve fare çıkış kutusu girdiğinde videoya durdurmak. 1 dk. için kutusunda bozulmamış kalmak hayvan izin.
      7. Fare kaçış kutusundan çıkarın ve geri onun kafes yerleştirin.
      8. 3.4.2 3.4.7 aracılığıyla adımları yineleyin 4 x günde 3 dk aralıklarla tekrarlanan denemeler arasında.
         Not: Tüm denemeler arasında herhangi bir idrar veya dışkı arena yüzeyden çıkarın ve labirent % 70 etanol ile temizleyin.
   4. Sonda deneme oturum
      1. Son eğitim deneme 24 saat sonra kaldırmak kaçış kutusu labirent platformu ve 3.4.2 3.4.5 aracılığıyla arasındaki adımları yineleyin.
      2. 3 dakika sonra beyaz gürültü açmak ve videoya durdurmak. Fare labirent salondan çıkarın ve geri onun kafes yerleştirin.
      3. Bütün hayvanlar test ettikten sonra labirent platformu ve başlangıç odası temiz. Oda ışıkları kapatın ve kapıdan "Girmeyin" işareti kaldırın.
      4. Test oturumlarından video kayıtları daha ayrıntılı bir çözümleme için harici bir sabit disk için saklayın.
      5. Video izleme yazılım programı ve eğitim toplantıları sırasında 4 gün hedef delik bulmak için gecikme süresi ve zaman da dahil olmak üzere kaydedilen video dan ilgi parametreleri hedef çeyreğinde sonda deneme oturumu sırasında harcanan özü ayarlayın.

4. biyokimyasal değerlendirme

1. Hipokampüs seviyelerinde ATP
   1. Derinden her fare ketamin (vücut ağırlığının gram başına 100 mg) ve xylazine (vücut ağırlığının gram başına 10 mg) karışımı bir mayi enjeksiyon ile anestezi.
   2. Hayvan başını kesmek ve hızla beyin dokusu kafatasından kaldırın.
   3. Hippocampus teşrih ve buz gibi örnek arabelleği (kit tarafından sağlanan) doku doku homogenizer ile homojenize.
   4. Hemen homogenate 2.000 x g 4 ° C'de 3 dk de santrifüj kapasitesi
   5. Süpernatant temiz bir tüp aktarın.
   6. Spektrofotometrik kullanarak hipokampal ATP düzeylerini değerlendirmek daha önce¹¹açıklandığı gibi yöntemi.

Sonuçlar

İstatistiksel analizler

Barnes eğitimler elde edilen verilerin istatistiksel analizi iki yönlü ANOVA tarafından analiz edildi; diğer davranışsal test ve analiz hipokampal ATP düzeylerinin gruplar arasında tek yönlü ANOVA, Tukey'nın öğleden hoc testi ile takip tarafından yapılmıştır. Tüm verileri ± standart sapma (SD) aracı olarak gösterilir lazer iletim verileri dışında ± standart hat...

Tartışmalar

Biz farelerde Transkraniyal PBMT yordamı yürütmek için bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı özellikle kemirgenler üzerinde duruldu photobiomodulation araştırma yapmak neuroscience laboratuarları hedeflenmektedir. Ancak, bu iletişim kuralını Nörobilim alanında tavşan, kedi, köpek ya da maymun gibi sık kullanılan diğer Laboratuvar hayvanlarının adapte edilebilir.

Şu anda, Transkraniyal PBMT kırmızı/NIR lazerler ve LED ile soruşturma artan ilgi yoktur. Kemirgen...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100