Un protocolo de Transcranial Photobiomodulation terapia en ratones

Resumen

Photobiomodulation terapia es una innovadora modalidad no invasiva para el tratamiento de una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y también puede mejorar la función cerebral saludable. Este protocolo incluye a una guía paso a paso a realizar photobiomodulation de cerebro en ratones por entrega luz transcranial, que puede ser adaptada para su uso en otros roedores de laboratorio.

Resumen

Fotobiomodulación transcraneal es un enfoque terapéutico no invasivo innovador potencial para mejorar la bioenergética cerebral, función del cerebro en una amplia gama de trastornos neurológicos y psiquiátricos y mejorar la memoria en deterioro cognitivo relacionados con la edad y enfermedades neurodegenerativas. Se describe un protocolo de laboratorio para transcraneal photobiomodulation terapia (PBMT) en ratones. De ratones BALB/c (18 meses) se tratan con un 660 nm láser transcranially, una vez al día durante 2 semanas. Datos de transmitancia láser muestran que aproximadamente el 1% de la luz incidente de rojo en el cuero cabelludo alcanza una profundidad de 1 mm de la superficie cortical, penetrando el hipocampo dorsal. Los resultados del tratamiento se evaluaron mediante dos métodos: un Barnes laberinto de prueba, que es un dependiente de hipocampo espacial memoria y el aprendizaje tarea evaluación, y medición hipocampales niveles de ATP, que se utiliza como un índice de bioenergética. Los resultados de la tarea de Barnes muestran una mejora de la memoria espacial en ratones tratados con láser envejecidos en comparación con controles pareados por edad. Análisis bioquímico después de tratamiento con láser puede indicar aumento de los niveles de ATP hippocampal. Postulamos que la mejora de rendimiento de memoria es potencialmente debido a una mejora en el metabolismo de energía hipocampo inducida por el tratamiento de láser rojo. Las observaciones en los ratones podrían extenderse a otros modelos animales ya que este protocolo potencialmente podría ser adaptado a otras especies usadas con frecuencia en Neurociencia traslacional, como mono, conejo, perro o gato. Photobiomodulation transcraneal es una modalidad segura y rentable que puede ser un enfoque terapéutico prometedor en deterioro cognitivo relacionados con la edad.

Introducción

PBMT, o terapia de luz láser de bajo nivel (LLLT), es un término general que se refiere a los métodos terapéuticos basados en la estimulación de tejidos biológicos de energía de la luz de los láseres o diodos emisores de luz (LEDs). Casi todos los tratamientos PBMT se aplican con rojo a la luz de infrarrojo cercano (NIR) en longitudes de onda de 600 a 1100 nm, una potencia de salida desde 1 hasta 500 mW y un fluence de < 1 a > 20 J/cm² (ver Chung et al.¹).

Transcranial PBMT es un método de suministro de luz no invasiva que se lleva a cabo por la irradiación de la cabeza utilizando una fuente de luz externa (láser o LED)². Para aplicaciones de animal, este método incluye contacto o sin contacto de la sonda láser o LED en la cabeza del animal. Dependiendo de la región terapéutica de interés, puede colocarse una sonda suave sobre toda la cabeza (para cubrir todas las áreas del cerebro) o sobre una parte específica de la cabeza, como la región prefrontal, frontal o parietal. La transmisión parcial de luz roja/NIR por el cuero cabelludo, el cráneo y la duramadre puede alcanzar el nivel de la superficie cortical y proporcionar una cantidad de energía fotónica suficiente para producir beneficios terapéuticos. Posteriormente, el fluence luz entregado a nivel cortical se propaga en la materia gris y blanca del cerebro hasta alcanzar las estructuras profundas del cerebro³.

Luz en las bandas espectrales en el rojo a far-red región (600-680 nm) y la región NIR temprano (800-870 nm) se corresponde con el espectro de absorción del citocromo c oxidasa, la enzima terminal de la cadena respiratoria mitocondrial⁴. Se presume que PBMT en el espectro rojo/NIR provoca photodissociation de óxido nítrico (NO) de la citocromo c oxidasa, dando por resultado aumentos en el transporte de electrones mitocondrial y, en última instancia, aumento de la generación de ATP⁵. Con respecto a aplicaciones neuronales, los beneficios potenciales de la neurostimulatory de cerebro PBMT usando irradiación de transcranial métodos se han divulgado en una variedad de estudios preclínicos, incluyendo roedores modelos de Lesion traumatica cerebral⁶ accidente cerebrovascular agudo⁷,⁸de la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP)⁹, depresión¹⁰y envejecimiento¹¹.

Envejecimiento del cerebro se considera una condición neurofisiológica que negativamente afecta algunas funciones cognitivas como el aprendizaje y la memoria¹². Las mitocondrias son los orgánulos primarios responsables de la producción de ATP y bioenergética neuronal. La disfunción mitocondrial se sabe para ser asociada a déficits relacionados con la edad en áreas del cerebro que están vinculadas a la memoria de la navegación espacial, tales como el hipocampo¹³. Porque el tratamiento craneal con rojo/NIR luz principalmente los actos por la modulación de la bioenergética mitocondrial, suficiente dosis de luz entregada al hipocampo pueden resultar en la mejora de la memoria espacial de los resultados¹⁴.

El protocolo actual pretende demostrar el procedimiento PBMT transcraneal en ratones, con bajos niveles de luz roja. Describen las mediciones de transmisión de la luz láser requiere a través de los tejidos de la cabeza de ratones envejecidos. Además, laberinto de Barnes, como un aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y tarea de la memoria e hipocampales niveles de ATP, como un índice de bioenergética, se utilizan para la evaluación de los efectos del tratamiento en animales.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo conforme a la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud (NIH; Publicación no. 85-23, revisada en 1985) y aprobado por el Comité de ética regional de Tabriz Universidad de ciencias médicas.

PRECAUCIÓN: Este protocolo incluye la aplicación de instrumentos de láser de clase 3B y requerirá una formación adecuada y la adherencia a pautas de seguridad. Láseres de clase 3B pueden dañar gravemente los ojos y pueden calentar la piel. Láseres de clase 3B no se consideran un riesgo de quemaduras. Anteojos de protección deben llevarse en todo momento cuando el funcionamiento del aparato de láser.

1. experimentos de transmisión de la luz laser

Nota: Utiliza aquí tres ratones BALB/c machos de 18 meses de edad se obtuvieron de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas. Un láser mW 60 (660 nm) con una viga circular forma de 2,5 mm de diámetro se utiliza como fuente de luz. La fuente láser produce una luz circular polarizada con un perfil gaussiano de intensidad y se opera en modo de onda continua. Un medidor de potencia de fotodiodo comercial con una resolución de nW 10, un área activa de cuadrado 1 cm² fotodiodo y un rango de respuesta espectral de 400 a 1100 nm se utiliza para medir la potencia de luz transmitida a través de las muestras.

1. Preparación de la muestra
   1. Con el fin de obtener muestras frescas, profundamente anestesiar el ratón con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
   2. Disecar la cabeza del ratón con tijeras regulares, a partir del punto situado justo encima de los hombros.
   3. Gire la cabeza para que quede el lado ventral de la mandíbula hacia arriba. Deslice tijeras disección angulada suavemente a través de la cavidad bucal hasta que se nota la resistencia de la Unión de la mandíbula. Cortar todos los músculos grandes que une el hueso de la mandíbula con el cráneo y deshacerse de ellos.
   4. Quitar los huesos palatinos, con tijeras de disección angulada.
   5. Deseche toda la carne que rodea el cráneo, usando fórceps curvado.
   6. Disecar la parte inferior del cráneo y luego tomar cuidadosamente el cerebro fuera queda de hueso del cráneo, con una espátula curvada.
   7. Fijar el tejido cerebral intacto en un gel de agarosa al 2% por lo que será conveniente para cortar el tejido.
      Nota: Para obtener un cráneo intacto y muestra en el cuero cabelludo, el tejido cerebral debe retirarse el lado ventral de la cabeza del animal sin ningún daño a la porción dorsal de la cabeza.
2. Procedimiento de corte de cerebro
   1. Extender una gota de superglue (~0.05 mL) en la superficie del bloque de montaje de vibratome.
   2. Con cuidado coloque el bloque de agarosa en el vibratome bloque de montaje para que la superficie ventral del cerebro es boca abajo y ajustar su posición.
   3. Ligeramente la patilla el vibratome a la superficie superior del bloque de agarosa y registre el valor de corte como el nivel primario.
   4. Llene el tanque de vibratome con solución salina normal helada.
   5. Ajustar los parámetros de vibratome (p. ej., el grosor de corte [1 mm], velocidad [5 de 5 en la unidad de dispositivo] y frecuencia [5 de 5 en la unidad de dispositivos]) para obtener corte satisfactorio.
   6. Cortar transversalmente el cerebro en una rebanada con un espesor de 1.000 μm.
      Nota: El segmento es la porción del tejido de cerebro delimitado por la superficie cortical y un plano colocado 1.000 μm inferior a la superficie cortical (el hipocampo dorsal).
   7. Añadir una gota de agua (~0.05 mL) en la superficie de vidrio óptico y poner la rebanada del cerebro en la parte superior. Luego, añadir una gota de agua en el cerebro rebanada y coloque con cuidado el segundo vidrio óptico en la parte superior.
      Nota: Una gota de agua debe añadirse a los límites de vidrio muestra para prevenir el secado del tejido y luz dispersión de superficies rugosas.
3. Medición de la transmisión ligera a través de los tejidos de la cabeza
   1. Configurar el equipo óptico, incluyendo el dispositivo láser, reflejo de espejos y medidor de alimentación.
      PRECAUCIÓN: Poner gafas de protección ocular antes de encender el láser.
   2. En la ausencia de una muestra en el medidor de energía, encienda el dispositivo láser y enfocar el rayo láser en el espejo que se encuentra a la distancia adecuada para guiar el rayo perpendicular al área activa del fotodiodo.
      Nota: Las mediciones de transmisión de luz deben realizarse en un cuarto oscuro a temperatura ambiente (23-25 ° C), dentro de 30 minutos después de que se hayan extraído los tejidos de la cabeza.
   3. Realizar mediciones en el tejido cerebral en rodajas.
      1. Coloque dos vidrios ópticos en blanco sobre la superficie del medidor de energía.
      2. Leer la potencia de luz transmitida (I₀) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.
      3. Suavemente Coloque la muestra de cerebro, que está rodeada por dos vidrios ópticos, en la superficie del medidor de energía, enfocar el rayo en la zona respectiva de tejido, leer la potencia y el valor.
   4. Realizar mediciones en el cráneo y el cuero cabelludo.
      1. Coloque un vidrio óptico en blanco sobre la superficie del medidor de energía.
      2. Leer la potencia de luz transmitida (I₀) desde el medidor de energía de pantalla y registre el valor.
      3. Ligeramente Coloque un vidrio óptico con cráneo fresco más tejido en la superficie del medidor de potencia en el cuero cabelludo, coincide con el haz de luz en la zona de vértice, leer la potencia y el valor.
      4. Con el fin de maximizar la relación señal a ruido, repita la medición de la transmisión de la luz por lo menos 3 x para todas las muestras.
         Nota: La zona de vértice se coloca en un rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas aproximadamente 3 mm. El espesor de los tejidos del cráneo y del cuero cabelludo se mide con un calibrador estándar.

2. Photobiomodulation terapia (PBMT)

Nota: Se utilizaron cuarenta y cinco ratones BALB/c machos asignados a tres grupos de 15 ratones. Los grupos estaban compuestos de ratones jóvenes-control (2 meses) que recibieron sham-PBMT, control de edad ratones (18 meses de edad) que recibieron tratamiento simulado-PBMT y ratones envejecidos-PBMT (18 meses de edad) que recibieron PBMT. El tratamiento de sham PBMT consistió en tratamiento idéntico a la PBMT grupo, pero con el láser inactivo. Ratones fueron obtenidos de Animalario de Tabriz Universidad de ciencias médicas y fueron alojados en el unidad del centro de investigación de Neurociencias (NSRC) animales a 24-25 ° C y 55% humedad relativa, con 12 h luz y fotoperíodo oscuro 12 h. Alimentos y el agua fueron proporcionados ad libitum. Todos los ratones fueron aclimatados durante al menos 1 semana antes del tratamiento.

1. Procedimiento de tratamiento láser
   Nota: Un diodo láser de GaAlAs con modo de onda continua en longitud de onda de 660 nm se utilizó para el tratamiento de PBMT transcraneal. El dispositivo del laser fue funcionado en una potencia de 200 mW ± 2 y una irradiación de 6.66 W/cm², con un tamaño de punto de 0,03 cm². Una fluencia promedio de 99.9 J/cm² por cada sesión se entregó a la superficie del cuero cabelludo durante 15 s de irradiación. La irradiación fue administrado 1 x día durante 2 semanas consecutivas.
   1. Llevar los ratones en sus jaulas hogar a la sala de terapia, aproximadamente 20 minutos antes de comenzar el tratamiento.
   2. Conecte un protector eléctrico a la toma de corriente.
   3. Inserte el enchufe del dispositivo de láser en un protector eléctrico.
   4. Cubrir la punta de la sonda de láser con una película de nylon transparente para evitar cualquier rasguño en la superficie.
   5. Conecte con cuidado la sonda en el canal del dispositivo láser.
   6. Encienda el dispositivo láser y esperar unos segundos para se caliente.
   7. Ajustar los parámetros de tratamiento de láser, incluyendo el modo de operación y tiempo de irradiación.
   8. En ausencia de cualquier muestra, determinar la potencia media de láser por ponerse en contacto con la punta de la sonda en la zona del medidor de energía activa en el dispositivo de láser. Registre el valor.
   9. Repita el proceso de calibración (paso 2.1.8) al menos 5 x, leer las energías incidentes desde el medidor de energía pantalla y registran los valores.
   10. Suavemente Sujete un ratón por la piel dorsal del cuello del animal en la palma de una mano e inmovilizar su cabeza.
       Nota: En el protocolo actual, la sonda láser se coloca sobre la zona de vértice, que es ~ 3 mm rostral a una línea trazada entre la base interna de las orejas.
   11. Coloque suavemente la punta de la sonda directamente en el cuero cabelludo en la línea media, aproximadamente de 3 mm de rostral a una línea trazada a través de la base anterior de las orejas.
       Nota: Sujete la sonda a un ángulo aproximado de 45° al plano del abdomen.
   12. Para evitar la irradiación directa a los ojos del animal, primero con la punta de la sonda en la cabeza y, luego, encienda el dispositivo laser.
   13. Encienda el láser y mantener estable la sonda hasta la finalización de la irradiación.
   14. Después del final de la terapia, retirar la sonda de láser de la cabeza y suavemente volver el ratón a su jaula.
   15. El dispositivo láser y desconecte la sonda del dispositivo.
   16. Limpiar la sonda de láser con un limpiador óptico apropiado.
   17. Transferencia de los ratones a un centro de animales.

3. comportamiento tareas

1. Prueba de campo abierto
   1. Evaluar el aparato locomotor actividad de cada ratón por la distancia total recorrida durante una prueba de campo abierto, como describe previamente¹⁵.
2. Tarea de laberinto de Barnes
   1. Aparato de
      Nota: La tarea de aprendizaje y la memoria espacial se realiza en un laberinto de Barnes¹⁶. El aparato utilizado para esta tarea de neurobehavioral consiste en una plataforma circular hecha de madera negra (95 cm de diámetro) con 20 equidistante, agujeros circulares de 5 cm de diámetro que se encuentran en la plataforma, 3 cm desde el perímetro. El aparato es elevada 50 cm del piso para evitar que el animal bajando. Una caja móvil escape plástico negro (20 x 15 cm x 5 cm) se coloca debajo del orificio de escape. Un laberinto negro se utiliza para pruebas de ratones blancos y un negro mat debe colocarse bajo el laberinto cuando se utiliza un software de sistema de seguimiento.
      1. Coloque el aparato de laberinto en el centro de una habitación tranquila con brillante iluminación cenital.
      2. Coloque un letrero de "No entrar" en el exterior de la puerta de la sala de tarea.
      3. Coloque señales visuales-espaciales en los muros perimetrales.
      4. Coloque una cámara de vídeo digital sobre la plataforma de laberinto.
      5. Limpie la superficie de la plataforma de laberinto con etanol al 70% para eliminar señales olfativas no deseados.
      6. Agregue una pequeña cantidad de ropa de cama de jaula casera del animal en el interior de la caja de escape para servir como una referencia olfativa.
   2. Sesión de adaptación
      1. Traer cada ratón a la tarea sala aproximadamente 30 min antes de comenzar el experimento, en orden para que el ratón de ser habituado.
      2. Quitar el ratón de su jaula y suavemente Coloque el animal en la caja de escape durante 1 minuto.
   3. Sesión de entrenamiento
      Nota: La sesión de entrenamiento se repite para cada ratón en 4 días consecutivos.
      1. Retire suavemente el ratón de la caja de escape.
      2. Coloque el ratón en el centro de la arena; Luego, coloque la cámara de inicio en la parte superior del ratón.
      3. Retire la cámara de inicio después de 10 s y el ratón para explorar la arena de 3 minutos.
      4. Tranquilamente hacia el área de la computadora y puesto en auriculares de cancelación de ruido.
      5. Desencadenar un estímulo auditivo negativo que consiste en un ruido blanco de aproximadamente 80 dB a nivel de la plataforma y comenzar a grabar el ratón.
      6. Apague el ruido blanco y dejar de grabar cuando el ratón entra en la caja de escape. Permite al animal permanecer inalterados en el cuadro de 1 minuto.
      7. Quite el ratón de la caja de escape y coloque en su jaula.
      8. Repita los pasos 3.4.2 por 3.4.7 4 veces por día, con intervalos de 3 minutos entre los ensayos repetidos.
         Nota: Entre todos los ensayos, quite cualquier orina o las heces de la superficie de la arena y limpiar el laberinto con etanol al 70%.
   4. Sesión de prueba de sonda
      1. Tras el último entrenamiento ensayo, 24 h después, quitar la casilla de escape de la plataforma de laberinto y repita los pasos 3.4.2 a través de 3.4.5.
      2. Después de 3 minutos, apagar el ruido blanco y deje de grabar. Quitar el ratón de la arena de laberinto y coloque en su jaula.
      3. Después de todos los animales han sido probados, limpie la plataforma del laberinto y la cámara de inicio. Apagar las luces de la habitación y quitar el letrero de "No entrar" de la puerta.
      4. Almacenar las grabaciones en vídeo de las sesiones de prueba a un disco duro externo para su posterior análisis.
      5. Configurar el programa seguimiento de video y extracto de los parámetros de interés de los vídeos grabados, incluyendo el tiempo de latencia para encontrar el agujero del objetivo durante 4 días de sesiones de entrenamiento y el tiempo gastados en el cuadrante de destino durante la sesión de prueba de sonda.

4. bioquímica evaluación

1. Niveles de ATP en el hipocampo
   1. Anestesiar profundamente cada ratón con una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg por gramo de peso corporal) y xilacina (10 mg por gramo de peso corporal).
   2. Decapitar al animal y quitar rápidamente el tejido cerebral del cráneo.
   3. Disecar un hipocampo y homogeneizar el tejido en el tampón de muestra helada (proporcionado por el kit) con un homogeneizador de tejidos.
   4. Inmediatamente centrifugar el homogeneizado a 2.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
   5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
   6. Evaluar los niveles de ATP hippocampal, utilizando la lectura espectrofotométrica método descripto anteriormente¹¹.

Resultados

Análisis estadísticos

El análisis estadístico de datos obtenidos de las sesiones de entrenamiento de Barnes se analizó mediante ANOVA de dos vías; la otras pruebas conductuales y análisis de niveles de ATP hipocampales entre los grupos se llevaron a cabo por ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post-hoc de Tukey. Todos los datos se expresan como medios ± el error estándar de la media (SEM), except...

Discusión

Se describe un protocolo para la realización de un procedimiento PBMT transcraneal en ratones. Este protocolo está dirigido específicamente a los laboratorios de neurociencia que realizan investigación fotobiomodulación en roedores. Sin embargo, este protocolo puede ser adaptado a otros animales de laboratorio que se utilizan con frecuencia en el campo de la neurociencia, como mono, conejo, perro o gato.

En la actualidad hay creciente interés en la investigación de transcranial PBMT con...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100