Um protocolo para a terapia de décadas transcraniana em ratos

Resumo

Décadas de terapia é uma inovadora modalidade não-invasiva para o tratamento de uma ampla variedade de desordens neurológicas e psiquiátricas e também pode melhorar a função cerebral saudável. Este protocolo inclui um guia passo a passo para executar décadas de cérebro em ratos pela entrega de luz transcraniana, que pode ser adaptada para uso em outros roedores de laboratório.

Resumo

Transcraniana décadas é uma abordagem terapêutica não invasiva inovadora potencial para melhorar bioenergética do cérebro, a atividade cerebral em uma ampla variedade de desordens neurológicas e psiquiátricas e realce da memória em declínio cognitivo relacionados com a idade e doenças neurodegenerativas. Descreveremos um protocolo do laboratório para a terapia de décadas transcraniana (PBMT) em ratos. Envelhecido camundongos BALB/c (18 meses de idade) são tratados com um 660 nm laser transcranially, uma vez ao dia por 2 semanas. Dados de transmitância do laser mostram que aproximadamente 1% da luz incidente sobre o couro cabeludo vermelho atinge uma profundidade de 1 mm da superfície cortical, penetrando o hipocampo dorsal. Os resultados do tratamento são avaliados por dois métodos: um Barnes labirinto teste, que é um hipocampo-dependente espacial aprendizagem e memória tarefa avaliação, e medição de níveis de ATP hipocampo, que é usado como um índice de Bioenergética. Os resultados da tarefa de Barnes mostram um aumento da memória espacial em ratos envelhecidos do laser-tratado quando comparado com a idade-controles. Análise bioquímica após tratamento com laser indica aumento dos níveis de ATP hippocampal. Podemos postular que a melhoria do desempenho da memória é potencialmente devido a uma melhoria no metabolismo de energia hippocampal induzida pelo tratamento a laser vermelho. As observações em camundongos poderiam ser estendidas a outros modelos animais, desde que este protocolo potencialmente poderia ser adaptado para outras espécies frequentemente usados em neurociência translacional, tais como o coelho, gato, cachorro ou macaco. Transcraniana décadas é uma modalidade segura e econômica, que pode ser uma promissora abordagem terapêutica no comprometimento cognitivo relacionados com a idade.

Introdução

PBMT, ou terapia de luz laser de baixo nível (LLLT), é um termo geral que refere-se a métodos terapêuticos baseados a estimulação de tecidos biológicos pela energia luminosa do laser ou diodos emissores de luz (LEDs). Quase todos os tratamentos de PBMT são aplicados com vermelho a luz infravermelha (NIR) em comprimentos de onda de 600 a 1100 nm, uma potência variando de 1 a 500 mW e uma fluência que variam de < 1 a > 20 J/cm² (veja Chung et al.¹).

Transcranial PBMT é um método de entrega de luz não-invasiva que é conduzido por irradiação da cabeça usando um externo fonte de luz (laser ou LEDs)². Para aplicações de animais, este método inclui contacto ou sem contacto colocação da sonda LED ou laser na cabeça do animal. Dependendo da região de interesse terapêutica, uma sonda de luz pode ser colocada sobre a cabeça inteira (para cobrir todas as áreas do cérebro) ou sobre uma parte específica da cabeça, como a região pré-frontal, frontal ou parietal. A transmissão parcial de luz vermelha/NIR através do couro cabeludo, crânio e dura-máter pode alcançar o nível da superfície cortical e fornecem uma quantidade de energia do photon suficiente para produzir benefícios terapêuticos. Posteriormente, a fluência de luz entregue a nível cortical iria ser propagada em matéria cinza e branca do cérebro até atingir as estruturas mais profundas do cérebro³.

Luz das bandas espectrais em vermelho para far-red (600-680 nm) e região NIR precoce (800-870 nm) corresponde o espectro de absorção da citocromo c oxidase, a enzima terminal da cadeia respiratória mitocondrial⁴. Supor que PBMT no espectro vermelho/NIR provoca photodissociation do óxido nítrico (NO) da citocromo c oxidase, resultando em aumento do transporte de elétrons mitocondrial e, em última análise, aumentou a geração de ATP⁵. Em relação aos aplicativos neuronais, os potenciais benefícios de neurostimulatory do cérebro PBMT usando transcraniana irradiação métodos têm sido relatados em uma variedade de estudos pré-clínicos, incluindo modelos de roedores de cerebral traumática lesão (TBI)⁶, AVC agudo⁷, a doença de Alzheimer (AD)⁸, a doença de Parkinson (PD)⁹, depressão¹⁰e envelhecimento¹¹.

Envelhecimento cerebral é considerado uma condição neuropsicológica que afeta negativamente a algumas funções cognitivas, como memória e aprendizagem¹². As mitocôndrias são as organelas primárias responsáveis pela produção de ATP e bioenergética neuronal. Disfunção mitocondrial é conhecida para ser associado com déficits relacionados com a idade, em áreas do cérebro que estão ligadas à memória de navegação espacial, tais como o hipocampo,¹³. Porque o tratamento craniano com vermelho/NIR luz principalmente atos pela modulação de bioenergética mitocondrial, doses suficientes de luz entregues para o hipocampo podem resultar na melhoria da memória espacial resultados¹⁴.

O objectivo do protocolo atual é demonstrar o procedimento PBMT transcraniana em ratos, utilizando baixos níveis de luz vermelha. As medições de transmissão de luz de laser necessária através dos tecidos cabeça de ratos envelhecidos são descritas. Além disso, labirinto de Barnes, como uma aprendizagem espacial do hipocampo-dependente e memória tarefa e hippocampal níveis de ATP, como um índice de bioenergética, são utilizados para uma avaliação sobre o impacto do tratamento nos animais.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do National Institutes of Health (NIH; Publicação n º 85-23, revista em 1985) e aprovado pelo Comitê de ética regionais de Ciências da Universidade de Tabriz Medical.

Atenção: Este protocolo inclui a aplicação de instrumentos de laser classe 3B e exigirá uma formação adequada e aderência às diretrizes de segurança. Lasers de classe 3B podem danificar gravemente os olhos e podem aquecer a pele. Lasers de classe 3B não são considerados um risco de queimaduras. Óculos de proteção de olho é obrigatório em todos os momentos quando operar o dispositivo a laser.

1. experimentos de transmissão de luz de laser

Nota: Usado aqui três camundongos BALB/c machos de 18 meses de idade foram obtidos da instalação de animais da Universidade de Tabriz Medical Sciences. Um laser de 60 mW (660 nm) com um feixe circular forma de 2,5 mm de diâmetro é usada como a fonte de luz. A fonte de laser produz uma luz circularmente polarizada com um perfil de intensidade Gaussian e é operada no modo de onda contínua. Um medidor de energia do fotodiodo comercial com uma resolução de nW 10, uma área ativa de quadrados de 1 cm² fotodíodo e uma faixa de resposta espectral de 400 a 1100 nm é usado para medir a potência de luz transmitida através das amostras.

1. Preparação da amostra
   1. A fim de obter amostras frescas, anestesia profundamente o mouse com uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg).
   2. Disse a cabeça do rato com tesoura regular, começando do ponto localizado logo acima dos ombros.
   3. Gire a cabeça de modo que o lado ventral da mandíbula voltado para. Deslize a tesoura angulada dissecação lisamente através da cavidade oral até a resistência da junção mandibular é notada. Corte todos os músculos grandes, vinculando o osso maxilar inferior ao crânio e descartá-las.
   4. Remova os ossos palatinos, usando tesouras de dissecação em ângulo.
   5. Descarte toda a carne em torno do crânio, utilizando pinças curvas.
   6. Dissecar a parte inferior do crânio e depois, cuidadosamente o osso remanescente do crânio, o cérebro com uma espátula curva.
   7. Reparar o tecido cerebral intacta em um gel de agarose 2% assim o tecido será apropriado para cortar.
      Nota: A fim de obter um crânio intacto, além do couro cabeludo amostra, o tecido cerebral deve ser removido do lado ventral da cabeça do animal sem nenhum dano para a porção dorsal da cabeça.
2. Procedimento de corte de cérebro
   1. Espalhe uma gota de supercola (~0.05 mL) na superfície do bloco de montagem de vibratome.
   2. Cuidadosamente coloque o agarose do vibratome bloco de montagem, para que a superfície ventral do cérebro é virado para baixo e ajustar a sua posição.
   3. Ligeiramente coincidir com a lâmina de vibratome para a superfície superior do bloco de agarose e registre o valor do cortador como nível primário.
   4. Encha o depósito de vibratome com solução salina normal gelada.
   5. Ajuste os parâmetros de vibratome (por exemplo, a fatia espessura [1], velocidade [5 de 5 unidade do dispositivo] e frequência de vibração [5 de 5 unidade do dispositivo]) para obter o corte satisfatório.
   6. Corte o cérebro transversalmente em uma fatia com uma espessura de 1.000 µm.
      Nota: A fatia é a parte do tecido cerebral delimitado pela superfície cortical e um avião posicionado 1.000 µm inferior à superfície cortical (o hipocampo dorsal).
   7. Adicionar uma gota de água (~0.05 mL) na superfície de vidro óptico e colocar a fatia de cérebro em cima dela. Em seguida, adicione uma gota de água no cérebro fatia e coloque cuidadosamente o segundo vidro óptico em cima dela.
      Nota: Uma gota de água deve ser adicionada aos limites de vidro de amostra, para evitar a secagem de tecido e luz espalhamento de superfícies ásperas.
3. Medida de transmissão de luz através dos tecidos da cabeça
   1. Configure o equipamento óptico, incluindo o dispositivo a laser, refletindo os espelhos e unidade de medidor de energia.
      Atenção: Usar óculos de proteção de olho antes de ligar o laser.
   2. Na ausência de uma amostra sobre o medidor de energia, ligue o dispositivo a laser e focar o feixe de laser que está localizado a distância adequada para orientar o feixe perpendicular à área ativa do fotodiodo espelho.
      Nota: As medições de transmissão de luz devem ser realizadas em um quarto escuro, à temperatura ambiente (23-25 ° C), até 30 min após os cabeça tecidos foram extraídos.
   3. Realizar medições sobre o tecido cerebral em fatias.
      1. Coloque dois vidros óticos em branco sobre a superfície do medidor de energia.
      2. Leia a potência de luz transmitida (eu₀) do medidor de energia ecrã e registre o valor.
      3. Delicadamente Coloque a amostra do cérebro, que é abarcada por dois vidros óticos, na superfície do medidor de energia, focar o feixe na respectiva área do tecido, leia a potência transmitida e registre o valor.
   4. Realizar medições sobre o crânio e o couro cabeludo.
      1. Coloque um vidro ótico em branco sobre a superfície do medidor de energia.
      2. Leia a potência de luz transmitida (eu₀) do medidor de energia ecrã e registre o valor.
      3. Levemente Coloque um vidro ótico com crânio fresco plus couro cabeludo tecido na superfície do medidor de energia, coincidir com o feixe de luz na zona de bregma, leia a potência transmitida e registre o valor.
      4. A fim de maximizar a relação sinal-ruído, repita a medição de transmissão de luz de pelo menos 3 x para todas as amostras.
         Nota: A zona de bregma é colocada em uma cerca de 3 mm rostral uma linha traçada através da base anterior das orelhas. A espessura do crânio e couro cabeludo mais tecido é medida por um paquímetro padrão.

2. décadas terapia (PBMT)

Nota: Quarenta e cinco camundongos BALB/c masculinos, atribuídos a três grupos de 15 ratos cada foram usados. Os grupos foram compostos de jovens-controle ratos (2 meses de idade) que recebeu sham-PBMT, ratos envelhecidos-controle (18 meses de idade) que recebeu sham-PBMT e ratos de idosos-PBMT (18 meses de idade) que receberam PBMT. O tratamento de Souza-PBMT consistia de tratamento idêntico do PBMT grupo, mas com o laser inativo. Os ratos foram obtidos da instalação de animais, de Ciências da Universidade de Tabriz Medical e foram alojados no animal segurando a unidade de centro de pesquisa de Neurociências (NSRC) em 24-25 ° C e 55% umidade relativa, com uma luz de 12 h e fotoperíodo escuro de 12 h. Comida e água foram fornecidos ad libitum. Todos os ratos foram aclimatados para pelo menos 1 semana antes do tratamento.

1. Procedimento de tratamento do laser
   Nota: Um laser de diodo GaAlAs com modo de onda contínua no comprimento de onda de 660 nm foi usado para o tratamento de PBMT transcraniana. O dispositivo a laser foi operado em uma potência de 200 mW ± 2 e uma irradiância de 6,66 W/cm², com um tamanho de ponto de 0,03 cm². Uma fluência média de 99,9 J/cm² por cada sessão foi entregue para a superfície do couro cabeludo por 15 s de irradiação. A irradiação foi administrado 1 x diariamente por 2 semanas consecutivas.
   1. Traga os ratos em jaulas em casa para a sala de terapia, aproximadamente 20 min antes do início do tratamento.
   2. Conecte um protetor elétrico à tomada de parede.
   3. Insira o plugue do dispositivo do laser um surtos elétrico.
   4. Cobrir a ponta da sonda com uma película de nylon transparente do laser a fim de evitar qualquer arranhões na superfície.
   5. Ligar cuidadosamente a sonda no canal do dispositivo do laser.
   6. Ligue o dispositivo a laser e aguarde alguns segundos para a aquecer.
   7. Ajuste os parâmetros de tratamento a laser, incluindo o modo de tempo e operação de irradiação.
   8. Na ausência de quaisquer amostras, determine a potência média do laser em contato com a ponta da sonda para a área do medidor de energia ativa no dispositivo a laser. O valor de registro.
   9. Repita o processo de calibração (etapa 2.1.8) pelo menos 5x, ler os poderes incidentes desde do medidor de energia ecrã e registre os valores.
   10. Delicadamente segurar um mouse pela pele dorsal do pescoço do animal na palma de uma mão e imobilizar a sua cabeça.
       Nota: O protocolo atual, a sonda laser é colocada na zona de bregma, que é ~ 3 mm rostral uma linha traçada entre a base interna das orelhas.
   11. Levemente, coloque a ponta da sonda diretamente no couro cabeludo na linha média, cerca de 3 mm rostral uma linha traçada através da base anterior das orelhas.
       Nota: Segure a sonda em um ângulo de aproximadamente 45° ao plano do abdômen.
   12. A fim de evitar a irradiação direta para os olhos do animal, primeiro, entre em contato com a ponta da sonda na cabeça e, em seguida, ligue o dispositivo a laser.
   13. Ligar o laser e estàvel, segurar a sonda até a conclusão do tratamento por irradiação.
   14. Após o término da terapia, retirar a sonda do laser da cabeça e retornar suavemente o mouse para sua gaiola.
   15. Desligue o dispositivo a laser e desconectar a sonda do dispositivo.
   16. Limpe a sonda laser com um líquido de limpeza óptico adequado.
   17. Transferi os ratos para as instalações de animais.

3. comportamentais tarefas

1. Teste de campo aberto
   1. Avaliar a locomoção atividade de cada rato pela distância total percorrida durante um teste de campo aberto, como descrito anteriormente a¹⁵.
2. Tarefa de labirinto de Barnes
   1. Aparelho
      Nota: A tarefa de aprendizagem e memória espacial é executada em um labirinto de Barnes¹⁶. O aparelho utilizado para esta tarefa Neurocomportamentais consiste em uma plataforma circular, feita de madeira preta (95 cm de diâmetro) com 20 equidistante, 5 orifícios circulares cm-diâmetro localizados na plataforma, 3 cm do perímetro. O aparelho é elevado a 50 cm do chão para impedir que o animal descer. Uma caixa de fuga móveis de plástico preto (20 x 15 cm x 5 cm) é colocado sob o orifício de fuga. Um labirinto preto é usado para testes ratos brancos, e um tapete preto deve ser colocado sob o labirinto quando é usado um sistema de rastreamento de software.
      1. Coloque o aparelho de labirinto no centro de uma sala silenciosa com brilhante iluminação aérea.
      2. Coloca um sinal de "Não entre" do lado de fora da porta do quarto da tarefa.
      3. Anexe sugestões visual-espacial para as paredes de perímetro.
      4. Posicione uma câmera de vídeo digital sobre a plataforma do labirinto.
      5. Limpe a superfície da plataforma labirinto com etanol a 70% para remover indesejadas sugestões olfactory.
      6. Adicione uma pequena quantidade de roupa de cama de gaiola em casa do animal no interior da caixa de fuga para servir como uma sugestão olfativo.
   2. Sessão de adaptação
      1. Trazer cada rato para a tarefa sala cerca de 30 min antes de começar o experimento, para que o mouse para tornar-se hábito.
      2. Retire o mouse da jaula e delicadamente, coloque o animal na caixa fuga por 1 min.
   3. Sessão de treinamento
      Nota: A sessão de treino é repetido para cada rato em 4 dias consecutivos.
      1. Remova cuidadosamente o mouse da caixa de fuga.
      2. Coloque o mouse no centro da arena; em seguida, coloque a câmara iniciar na parte superior do rato.
      3. Remova a câmara de início após 10 s e permitir que o mouse para explorar a arena por 3 min.
      4. Calmamente, mova para a área de informática e colocar em fones de ouvido com cancelamento de ruído.
      5. Desencadear um estímulo auditivo negativo consistindo de um ruído branco alto de aproximadamente 80 dB no nível da plataforma e começar a gravar o mouse.
      6. Desligar o ruído branco e parar de gravar quando o mouse entra a caixa de saída. Permitir que o animal permanecer imperturbável na caixa por 1 min.
      7. Remover o mouse da caixa de fuga e colocá-lo de volta para sua jaula.
      8. Repita as etapas 3.4.2 através de 3.4.7 4x por dia, com intervalos de 3 min entre ensaios repetidos.
         Nota: Entre todos os ensaios, para eliminar qualquer urina ou fezes da arena e limpar o labirinto com etanol a 70%.
   4. Sessão experimental de sonda
      1. Após o último julgamento de treinamento, 24h depois, remova a caixa de escapar da plataforma do labirinto e repita os passos de 3.4.2 através de 3.4.5.
      2. Depois de 3 min, desligar o ruído branco e parar de filmar. Retire o mouse da arena labirinto e colocá-lo de volta para sua jaula.
      3. Depois que todos os animais foram testados, limpe a plataforma do labirinto e a câmara de início. Desligue as luzes da sala e remover o sinal de "Não entre" da porta.
      4. Armazene as gravações de vídeo das sessões de testes para um disco rígido externo para posterior análise.
      5. Configure o programa de software de controle de vídeo e extrair os parâmetros de interesse, desde os vídeos gravados, incluindo o tempo de latência para encontrar o buraco alvo durante 4 dias de sessões de treinamento e o tempo gasto no quadrante alvo durante a sessão de julgamento de sonda.

4. bioquímica avaliação

1. Níveis de ATP no hipocampo
   1. Anestesia profundamente cada rato com uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg por grama de peso corporal) e xilazina (10mg por grama de peso corporal).
   2. Decapitar o animal e remover rapidamente o tecido cerebral do crânio.
   3. Dissecar o hipocampo e homogeneizar o tecido no amortecedor da amostra gelada (fornecido pelo kit) com um homogeneizador.
   4. Centrifugar imediatamente o homogenate a 2.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
   5. Transferi o sobrenadante para um tubo limpo.
   6. Avaliar os níveis de ATP hippocampal, usando o espectrofotométrico método conforme descrito anteriormente,¹¹.

Resultados

Análises estatísticas

A análise estatística dos dados obtidos a partir das sessões de treinamento de Barnes foi analisada pela ANOVA de duas vias; os outros testes comportamentais e análise dos níveis de ATP hippocampal entre os grupos foram realizados por One-Way ANOVA, seguido pelo teste post hoc de Tukey. Todos os dados são expressos como média ± o erro padrão da média (SEM), com exceção dos dad...

Discussão

Descreveremos um protocolo para a realização de um procedimento PBMT transcraniana em camundongos. Este protocolo destina-se especificamente aos laboratórios de neurociência que realizam pesquisas de décadas focadas em roedores. No entanto, este protocolo pode ser adaptado para outros animais de laboratório que são frequentemente usados no campo da neurociência, tais como o coelho, gato, cachorro ou macaco.

Atualmente, há um interesse crescente na investigação transcraniana PBMT com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100