マウスにおける経頭蓋 Photobiomodulation 療法のプロトコル

要約

Photobiomodulation 療法は幅広い神経疾患、精神疾患の治療のための革新的な非侵襲的様相を健康な脳機能を向上させることも。このプロトコルには、マウスが他のげっ歯類での使用に合わせることができる配光経頭蓋脳 photobiomodulation を実行するステップ バイ ステップ ガイドが含まれています。

要約

Photobiomodulation 経頭蓋は脳生体エネルギー、神経疾患、精神疾患の広い範囲での脳機能や認知機能の低下の年齢関連のメモリ拡張を改善するため潜在的な革新的な非侵襲的治療アプローチ神経変性疾患。マウスにおける経頭蓋 photobiomodulation 療法 (PBMT) の実験プロトコルについて述べる。高齢者の BALB/c マウス (18 ヶ月) は、660 nm レーザー transcranially、一度 2 週間毎日と扱われます。レーザー透過率データは、背側の海馬を貫通、皮質表面から深さ 1 mm を頭皮にインシデントの赤色光の約 1% に達するを示しています。2 つの方法によって治療成績が評価されて: Barnes 迷路海馬依存空間学習・記憶タスク評価は、テストと測定海馬 ATP のレベル、生体エネルギー インデックスとして使用されています。バーンズ タスクから結果は高齢マウスのレーザー光を用いて年齢をマッチさせたコントロールと比較した場合の空間の記憶の強化を表示します。レーザー治療の後の生化学的分析は、海馬の ATP レベルを増加しました。我々 はメモリ性能の向上は赤色レーザー治療による海馬のエネルギー代謝の改善可能性があることを仮定します。マウスの観察は、このプロトコルをウサギ、猫、犬、猿などの並進運動神経科学で頻繁に使用される他の種に合わせることができる可能性があるので他の動物モデルに拡張できます。経頭蓋 photobiomodulation は、加齢に伴う認知機能障害で有望な治療アプローチがあります安全でコスト効果の高い療法です。

概要

PBMT、または低レベルのレーザー光治療 (LLLT) は、レーザーまたは発光ダイオード (Led) の光エネルギーによって生体組織への刺激に基づく治療法を意味する一般的な用語です。〜 1100 nm、1 から 500 までの出力電力 600 から近赤外線 (NIR) ライト波長への赤と PBMT のほぼすべての治療が適用されます、mW と < 1 > から及ぶフルエンス 20 J/cm² (鄭ら¹参照)。

経頭蓋 PBMT は、外部光源 (Led またはレーザー)²を用いたヘッドの照射によって行われている非侵襲的光配信方法です。動物用には、このメソッドには、連絡先または動物の頭の上の LED またはレーザー プローブの接触の配置が含まれます。興味の治療の地域によって光プローブは (脳のすべての領域をカバー) の全体の頭の上や頭、前頭前野、前頭葉、または頭頂領域などの特定部分の上に配置できます。頭皮、頭蓋骨、硬膜赤色/近赤外光の部分の透過は皮質表面レベルに到達し、光子エネルギー治療効果を生成するための十分な量を提供できます。その後、皮質レベルで配信光フルエンスもグレーと白の脳実質へ伝播される脳³のより深い構造に達するまで。

遠領域 (600-680 nm) と初期の近赤外領域 (800-870 nm) に赤のスペクトル バンドの光は、シトクロム c 酸化酵素は、ミトコンドリアの呼吸鎖⁴のターミナルの酵素の吸収スペクトルに対応します。それは、PBMT 赤/近赤外スペクトルでミトコンドリアの電子伝達の増加の結果からチトクロム酸化酵素、一酸化窒素 (NO) の光解離を引き起こすし、最終的には、⁵世代の ATP を増加に仮定されます。神経のアプリケーションに対する潜在的な neurostimulatory の利点脳メソッドは、さまざまな外傷性の脳損傷 (TBI)⁶、齧歯動物モデルを含む、臨床研究で報告されている頭蓋照射を用いた PBMT急性期脳卒中⁷アルツハイマー病 (AD)⁸パーキンソン病 (PD)⁹うつ病の¹⁰、および高齢化¹¹。

脳の老化は、学習と記憶¹²などのいくつかの認知機能に影響を与える否定的神経心理学的条件と見なされます。ミトコンドリアは、ATP の生産および神経細胞の生体エネルギーを担当主な器官です。海馬¹³などの空間的ナビゲーション メモリにリンクされている脳領域の加齢に伴う赤字に関連するミトコンドリア機能障害が知られています。頭蓋治療赤色/近赤外光行為主にミトコンドリアのエネルギー代謝の変調、ので、海馬に十分な用量で配信された光は空間記憶の結果¹⁴の改善につながります。

現在のプロトコルの目的は、赤い光の低レベルを用いたマウス頭蓋 PBMT 手順をデモンストレーションすることです。老齢マウスの頭の組織を通じて必要なレーザー光透過率測定値の説明します。また、バーンズ迷路、海馬依存性の空間学習とメモリ タスク、および生体エネルギー インデックスとしての海馬の ATP レベルとして使用されます動物の治療への影響を評価するため。

プロトコル

すべてのプロシージャはケアと健康の国民の協会 (NIH; の実験動物の使用のためにガイドに従い実施されました。85-23 号の文書改訂 1985) タブリーズ医科大学学地域倫理委員会の承認と。

注意: このプロトコル クラス 3B レーザー機器のアプリケーションを含む、適切な訓練と安全のガイドラインの遵守が必要になります。クラス 3B レーザーは真剣に目を損傷することができます、皮膚を熱することができます。クラス 3B レーザーは火傷の危険とは見なされません。目の保護ゴーグルを着用する必要がありますすべての回でレーザー デバイスの作動。

1. レーザー光伝送実験

注: ここで使用される 3 18 ヶ月歳の男性 balb/c マウスから得られたタブリーズ医科大学学動物施設。60 mW レーザー (660 nm) 光源として円形ビーム直径 2.5 mm の図形が使用されます。レーザー ソースはガウス分布と円偏光を生成し、連続波モードで動作します。10 nW 解像度、正方形の 1 cm²フォト ダイオードのアクティブ エリア、400 から 1100 nm までのスペクトル応答範囲とコマーシャル フォト ダイオード電源メーターを使用して、サンプルを送信光パワーを測定します。

1. サンプル準備
   1. 新鮮なサンプルを得るために深くケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の混合物とマウスを麻酔します。
   2. 肩の真上に位置するポイントから始まって通常のハサミでマウスの頭を解剖します。
   3. 顎の腹側向くように、頭を回転させます。下顎の接合部の抵抗を気づいたまで口腔内を円滑に斜め解剖はさみをスライドさせます。頭蓋骨、下顎骨骨をリンクすべての大きな筋肉を切り取って捨てます。
   4. 斜め解剖はさみを使って、口蓋骨を削除します。
   5. カーブタイプ鉗子を使用して、頭蓋骨を取り巻くすべての肉を破棄します。
   6. 頭蓋骨の下の部分を解剖し、慎重に曲がりヘラで残りの頭蓋骨から脳を取る。
   7. 組織、スライスに適しているので 2% アガロースゲルのままの脳組織を修正します。
      注: そのまま頭蓋骨を取得プラス頭皮のサンプルのために脳組織に除去されるべき損傷せず動物の頭の腹側から頭の背の部分。
2. 脳スライスの手順
   1. Vibratome マウント ブロックの表面に瞬間接着剤 (~0.05 mL) のドロップを広がってください。
   2. 慎重に vibratome ブロックを取り付け、脳の腹側表面は、下向きにアガロース ブロックを添付し、位置を調整します。
   3. 少しアガロース ブロックの上面に vibratome のブレードに一致し、プライマリ レベルとしてカッター値を記録します。
   4. 氷冷生理食塩水で vibratome タンクを記入します。
   5. 満足なスライスを取得する vibratome パラメーター (例えば、スライス厚 1 mm、速度 [デバイス単体で 5 の 5] と振動 [装置で 5 の 5]) を調整します。
   6. 1,000 μ m の厚みで脳をスライスに横カットします。
      メモ: スライスは皮質表面で区切られた脳の部分と平面配置 1,000 μ m (背側海馬) は皮質表面に劣る。
   7. 光学ガラスの表面に一滴の水 (~0.05 mL) を追加し、その上に脳スライスを入れてください。水が脳にスライスの滴を追加し、その上に 2 番目の光学ガラスを慎重に配置します。
      注: 一滴の水は、組織の乾燥や粗面からの散乱光を防止するためにサンプル ガラス境界を追加する必要があります。
3. 頭の組織を介して光透過率の測定
   1. 反射ミラー、パワー メーター ユニット、レーザー デバイスを含む、光学機器を設定します。
      注意: レーザーの電源を入れる前に保護の目眼鏡をかけます。
   2. 電源メーターのサンプルがない場合は、レーザー デバイスをオンにし、フォト ダイオードのアクティブな領域に垂直の梁を導くための適切な距離に位置していますミラーにレーザー光線を集中します。
      注: 光透過率測定は、本社組織を抽出した後の 30 分以内常温 (23-25 ° C)、暗室で実行する必要があります。
   3. スライスした脳組織での測定を実行します。
      1. 電源メーターの表面に 2 つの空白の光学ガラスを配置します。
      2. 送信光パワーを読む (私₀) 電源メーターの表示画面と値を記録します。
      3. ゆっくり脳のサンプルは、2 つの光学ガラスにつつまれて、電源メーターの表面に、組織の各領域の光線を焦点、送信電力を読むし、記録値。
   4. 頭蓋骨と頭皮での測定を実行します。
      1. 電源メーターの表面に空白の光学ガラスを配置します。
      2. 送信光パワーを読む (私₀) 電源メーターの表示画面と値を記録します。
      3. 軽く新鮮な頭蓋骨と光学ガラスを配置プラス電源メーターの表面の組織を頭皮、前ゾーンに光ビームを一致、送信電力を読み取って値を記録します。
      4. 信号対雑音比を最大化するために光の透過率測定、少なくとも 3 を繰り返してすべてのサンプルのための x。
         注: 前のゾーンに配置は、耳の前方基地を通して引かれた線を約 3 mm。頭蓋骨と頭皮組織の厚さは、標準的なキャリパーによって測定されます。

2. Photobiomodulation 療法 (PBMT)

注: 45 男性 balb/c マウス 15 匹のマウスの 3 つのグループに割り当てられているが使用されました。グループは、偽 PBMT を受け取った高齢者コントロール マウス (18 ヶ月) および PBMT を受け取った高齢者 PBMT マウス (18 ヶ月)、偽 PBMT を受け取った若いコントロール マウス (2 ヶ月) で構成されていました。偽 PBMT 治療は、グループが非アクティブのレーザー治療、PBMT と同じから成っていた。マウスはタブリーズ医科大学学動物施設から得られた、24-25 ° C と 55% の相対湿度で 12 h の光と 12 時間日長で暗い処理単位の神経科学研究センター (中央) を保持している動物に収容されました。食料と水は、自由を提供されました。すべてのマウスは、治療前に、少なくとも 1 週間の順応されました。

1. レーザー治療の手順
   注: 連続波モードでは 660 nm の波長を持つ半導体 GaAlAs レーザー経頭蓋 PBMT 治療に使われました。レーザー デバイスは、200 ± 2 mW の出力電力と 0.03 cm²のスポット サイズと 6.66 W/cm²の照度で稼動していた。15 頭皮表面に配信された 99.9 J/cm²各セッションごとの平均フルエンス照射の s。照射された投与 1 x 2 週連続の毎日。
   1. セラピー ルームでは、治療を開始する前に約 20 分にホームの檻の中でマウスをもたらします。
   2. 電気のプロテクターを壁のコンセントに接続します。
   3. 電気のプロテクターにレーザー デバイスのプラグを挿入します。
   4. 任意の表面に傷を防ぐために透明ナイロン膜を用いたレーザー プローブの先端をカバーします。
   5. 慎重にレーザー デバイスのチャンネルにプローブを接続します。
   6. レーザー デバイスをオンにし、ウォーム アップするため数秒を待ちます。、
   7. 照射時間と操作のモードを含むレーザー/治療パラメーターを調整します。
   8. 任意のサンプルがない場合は、レーザー装置の電源メーターのアクティブな領域にプローブの先端に連絡してレーザーの平均電力を決定します。値を記録します。
   9. 校正を繰り返して (ステップ 2.1.8) 少なくとも 5 x を読んで電源メーターからインシデントの権限画面を表示して値を記録します。
   10. 慎重に手のひらの上で動物の首の背側皮膚にマウスを押したまま、その頭を固定します。
       注: 現在のプロトコル レーザー プローブは 〜 3 mm を耳の内部のベースを結ぶ線は、前のゾーンに配置します。
   11. 軽く約 3 mm、耳の前方基地線を正中線で頭皮に直接プローブの先端を配置します。
       注: 保持でプローブを腹部の平面に対して約 45 ° の角度。
   12. 動物の目に直接照射を避けるために頭にプローブの先端がファーストコンタクトし、レーザー装置に入れます。
   13. レーザーをオンに、照射の終了するまでプローブを安定保持します。
   14. 療法の終了後、頭からレーザー プローブを撤回、ゆっくりマウスをケージに戻ります。
   15. レーザー デバイスの電源を切り、デバイスからプローブを外します。
   16. 適切な光学式洗浄機にレーザー プローブをクリーンアップします。
   17. 動物実験施設にマウスを転送します。

3. 行動のタスク

1. オープン フィールド テスト
   1. 評価、運動としてオープン フィールド テスト中に旅の総距離によってそれぞれのマウスの活動は上記¹⁵。
2. バーンズ迷路課題
   1. 装置
      注: 空間の学習と記憶のタスクは、バーンズ迷路¹⁶で実行されます。この神経行動学的タスクのために使用される装置から成っている黒い木 (直径 95 cm) 20 等距離、作られた円形プラットフォーム、プラットフォームの境界部から 3 cm 上にある 5 cm 径孔。装置は降りてから動物を防ぐために床から高い 50 cm です。可動式の黒いプラスチックのエスケープ ボックス (20 cm × 15 cm × 5 cm) エスケープ穴下に置かれます。黒の迷路、白いマウスをテストするため使用され、追跡システム ソフトウェアが使用される場合に、黒いマットが迷路下に配置します。
      1. 迷路装置を明るい間接照明と静かな部屋の中央に配置します。
      2. 作業部屋のドアの外側に「入らない」記号を配置します。
      3. 視覚空間的手がかりを周囲の壁に取り付けます。
      4. 迷路のプラットフォーム上のデジタル ビデオ カメラの位置します。
      5. 削除不要な嗅覚の手がかりを 70% エタノールで迷路のプラットフォームの表面をきれいにします。
      6. 嗅覚キューとして使用するエスケープ ボックスの内側に動物のホーム ケージから寝具の少量を追加します。
   2. 適応セッション
      1. マウスに慣れるために、実験を開始する前にタスク ルーム約 30 分に各マウスをもたらします。
      2. 檻から、マウスを削除し、優しく 1 分のエスケープ ボックスで動物を配置します。
   3. トレーニング セッション
      注: トレーニング セッションは、4 日間連続で各マウスに対して繰り返されます。
      1. そっとエスケープ ボックスから、マウスを削除します。
      2. アリーナの中央にマウスを置きマウスの上にスタート室を置きます。
      3. 10 後スタート室を削除 s、3 分アリーナを探索するマウスを許可するとします。
      4. 静かにコンピューター領域にノイズ キャンセルのヘッドフォンに移動します。
      5. プラットフォーム レベルで約 80 dB の騒音白で構成される否定的な聴覚刺激をトリガーし、マウスを録画を開始します。
      6. ホワイト ノイズの電源を切り、マウス エスケープ ボックスに入ったときの録画を停止します。1 分のボックスで妨げられていないままに動物を許可します。
      7. エスケープ ボックスからマウスを取り外して、そのケージに戻します。
      8. 3.4.2 3.4.7 を介しての手順を繰り返します 3 分間隔繰り返し試験を一日あたり 4 倍。
         注: すべての試験の間アリーナ面から尿や便を削除し、70% エタノールで迷路をきれい。
   4. プローブ トライアル セッション
      1. 最後の訓練試験終了後、24 時間後、迷路のプラットフォームからエスケープ ボックスを削除、手順 3.4.5 を通じて 3.4.2.
      2. 3 分後にホワイト ノイズを切りビデオテープに録画を停止します。迷路・ アリーナからマウスを取り外して、そのケージに戻します。
      3. すべての動物がテストされた後は、迷路のプラットフォームおよびスタート室をクリーニングします。室内灯の電源を切り、ドアから「入らない」サインを取り外します。
      4. さらに分析のための外付けハード ドライブにテスト セッションからのビデオ録画を格納します。
      5. ビデオ追跡のソフトウェア プログラムと研修 4 日間ターゲットの穴を見つけるために遅延時間と時間を含む記録されたビデオからの興味のパラメーターはプローブ トライアル セッション中にターゲット作業領域で過ごした抽出を設定します。

4 生化学的評価

1. 海馬の ATP レベル
   1. 深く (体重の 1 グラムあたり 100 mg) ケタミン ・ キシラジン (体重の 1 グラムあたり 10 mg) の混合物の腹腔内注入各マウスを麻酔します。
   2. 動物の首をはねるし、急速に頭蓋骨から脳組織を取り除きます。
   3. 海馬を解剖し、組織ホモジナイザーを用いた冷たいサンプル バッファー (キットで提供されます) で組織をホモジナイズしてください。
   4. すぐに 4 ° C で 3 分間 2,000 x gでホモジネートを遠心します。
   5. クリーン チューブに上清を転送します。
   6. 吸光光度を使って海馬の ATP レベルを評価する方法¹¹を前述のよう。

結果

統計解析

二元; バーンズ トレーニング セッションから取得したデータの統計的分析を行った他の行動テストやグループ間での海馬の ATP レベルの解析がテューキー事後テストが続く一方向の分散分析によってを行った。すべてのデータは ± 標準偏差 (SD) の手段として示されているレーザ伝送データを除く (SEM...

ディスカッション

マウスにおける経頭蓋 PBMT プロシージャを行なうためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、特に齧歯動物に焦点を当てた photobiomodulation 研究所にターゲットします。しかし、このプロトコルは、ウサギ、猫、犬、猿など、神経科学の分野で頻繁に使用される他の実験動物に適応できます。

現在、経頭蓋 PBMT 赤/近赤外レーザーと Led の調査に関心が高まってい...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Alfasan	#1608234-01
Xylazine	Alfasan	#1608238-01
Agarose	Sigma	#A4679
Superglue	Quickstar
Vibratome	Campden Instruments	#MA752-707
Optical glass	Sail Brand	#7102
Power meter	Thor labs	#PM100D
Photodiode detector	Thor labs	#S121C
Caliper	Pittsburgh
GaAlAs laser	Thor Photomedicine
Etho Vision	Noldus
Centrifuge	Froilabo	#SW14R
Earmuffs	Blue Eagle
Digital camera	Visionlite	#VCS2-E742H
Sterio amplifier	Sony
Ethanol	Hamonteb	#665.128321
Barnes maze	Costom-made
ATP assay kit	Sigma	#MAK190
Elisa reader	Awareness	#Stat Fax 2100