מדידת רמות המתח הביופיזיקלי והפסיכולוגית בעקבות ביקורי שלושה מיקומים בעלי רמות שונות של טבע

Summary

מטרת הנייר היא לזהות שינויים ברמות הסטרס לאחר הביקור בשלוש הגדרות שונות ולתאר את השיטות המשמשות לזיהוי רמות הסטרס המבוססות על מדדים של קורטיזול בהרוק, α-עמילאז, ודוח עצמי פסיכולוגי כלי.

Abstract

הביקור בסביבות טבעיות נקשר להפחתת לחץ פסיכולוגי. למרות שרוב המחקרים הקשורים למתח הסתמך על פורמטים של דו ח עצמי, מספר גדל והולך של מחקרים משלב כעת הורמונים ביולוגיים הקשורים ללחץ וזרזים, כגון קורטיזול ו-אמקלז, כדי למדוד רמות של מתח. מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעות על רמות של מתח ביופיזיקלי ופסיכולוגי בעקבות ביקורים לשלושה מיקומים שונים עם רמות שונות של הטבע. רמות הלחץ הפסיכולוגי בביופיזיקלי ודיווח עצמי נמדדות מיד עם הכניסה למיקומים שנבחרו ובדיוק לפני המבקרים העוזבים את האתר. באמצעות שיטת "ריר", המדד הביופיזיקלי מורכב מדגימות של 1-2 mL של רוק שסופקו על-ידי נושאי הלימוד בעת הכניסה לאחד משלושת מיקומי הלמידה. כפי שנקבע על ידי הספרות הקיימת, הרוק נאסף בתוך מסגרת זמן 45 דקה לאחר סיום האירוסין של המבקר במקום. בעקבות איסוף רוק, הדגימות מסומנות ומועברים למעבדה ביולוגית. קורטיזול הוא משתנה ביופיזיקלי של עניין במחקר זה נמדד באמצעות תהליך אליסה עם קורא לוחית TECAN. כדי למדוד מתח שדיווח על עצמו, שאלון הלחץ הנתפס (PSQ), המדווח על רמות של דאגה, מתח, שמחה ודרישות שנתפסו. המידע נאסף בכל שלושת האתרים בשעות אחר הצהריים המאוחרות, בשעות הערב המוקדמות. בהשוואה לכל שלוש ההגדרות, רמות הסטרס, כפי שנמדדות הן הסמנים הביולוגיים והן הדוחות העצמיים, נמוכות באופן משמעותי לאחר הביקור בסביבה הטבעית ביותר.

Introduction

רמות הלחץ הגבוהות כבר מזמן נקשרו למצבים רבים של בריאות חמורות כגון מחלות לב, השמנת יתר, והפרעות פסיכולוגיות^1,2,3. גוף גדל והולך של מחקר מציע כי קרבה או ביקור הגדרות טבעיות כגון פארק ונופים שאינם מפותחים יכול להיות השפעה יוצאת דופן על הרווחה הפסיכולוגית וירידה רמות של מתח^1,4, . ^{חמש,שש,שבע,שמונה,9,10} הסברים על ההשפעות של הגדרות טבעיות ורמות הסטרס כללו את הפרטים הבאים: (1) הגדרות טבעיות לספק מקומות לפעילות גופנית^8,11 ו (2) מבקרים לסביבה טבעית יש את היכולת למקד בתהליכי חשיבה שאינם משימות, ובכך מובילים לירידה בעייפות הקשב¹². כדי לקבוע את ההשפעות של הטבע על הפחתת לחץ, מחקר זה מנצל את הדוח העצמי של הלחץ הפסיכולוגי (PSQ) ושני בסמנים מבוססי רוק, קורטיזול ו-עמילאז, לאחר הביקור לשלושה אתרי בילוי שונים. מיקומים אלה משתנים בין הרמות שלהם "טבעיות" וכוללים הגדרה מסוג פראי, פארק עירוני, מתקן כושר ונופש מקומי.

מחקר זה נועד להתייחס לשאלות המחקר הבאות: (RQ₁) ישנם הבדלים ברמות של סטרס ביופיזיקלי הנמדד על ידי קורטיזול הרוק ו α-עמילאז כאשר לעומת כל שלושת האתרים (כלומר, טבעי, חצי טבעי, בנוי)? (RQ₂) האם יש הבדלים ברמות של לחץ פסיכולוגי הנמדד על ידי PSQ (המתבטאת בארבעה מבנים: דרישות, דאגות, מתח ושמחה) בהשוואה לכל שלושת האתרים (כלומר, טבעי, חצי טבעי, בנוי)?

Protocol

מחקר זה עוקב אחר מדיניות והנחיות של תוכנית הגנת מחקר האדם של אוניברסיטת אינדיאנה המועצה סקירה מוסדית.

1. בחירת מיקום

1. בחר את מספר האתרים (n) המבוססים על רמות שונות של הטבע.
   הערה: בחרנו שלושה אתרים לעבודתנו. באמצעות הרצף המבוסס על רמות של "טבעיות", אתר A נחשב הטבעי ביותר והוא מורכב כ 1,200 דונם של רכסים מיוער הגובל באגם להגדיר בתוך יער נשירים. הפעילויות הנפוצות ביותר כוללות הליכה וצפייה בחיות-בר. אתר B היה פארק עירוני 33 דונם ובו שבילי הליכה, מקומות למפגשים, מגרשי מגרש ומרחב שטח פתוח לפעילויות פנאי סיבתי. אתר C היה מתקן התעמלות עירונית ומקורה עם הרמה הנמוכה ביותר של טבעיות. כל שלושת האתרים נמצאים בסמיכות יחסית לעיר בגודל בינוני (אוכלוסיה מוערכת של 46,000 אנשים) בארצות המערב התיכון.

2. הקרנת משתתפים והכנתו

1. השלמת גיוס משתתפים לפני שנושאים עוסקים בחוויות פנאי.
   הערה: לאתרים A ו-B החוקרים ניגשו לחוקר במגרש החניה של הכניסה לפארק. עבור אתר C, הנבדקים ניגשו לדלפק הקבלה של מתקן ההתעמלות המקורה. כדי לשלוט בהבדלים בסוג הפעילות, הנושאים שגויסו לשני האתרים A ו-B היו מטיילים בעיקר, ואילו באתר C הפעילות העיקרית פעלה או הולכת על המסלול המקורה.
2. במהלך הגיוס, להזכיר נושאים לציית ההנחיות הקשורות איסוף דגימות קורטיזול הרוק. אסור להם לאכול או לשתות 10 דקות לפני מתן דגימות רוק.
   הערה: יש לציין כי במקרה זה, דגימות הרוק לא היו מנורמלות לנפח או לדילול (ריכוז)-כלומר אם המשתתפים היו מאוד מיורכים ו/או עשו שינויי מחות בין אוספי המדגם.
3. תן שודדים אדום (או בגדים אופן מורגש) לכל משתתף כדי לאפשר זיהוי קל כאשר מתפתחים בסוף התקשרויות שלהם.
4. הקצה הקצאת זמן של 30-40 דקות כך שכל הנושאים החוצים את שלושת האתרים יבלו את משך הזמן הדומה בכל אתר. אל תכלול נושאים המבלים באופן משמעותי יותר או פחות זמן משאר המדגם.
5. שמור על סוג הפעילות שתהיה עקבית.
   הערה: במקרה זה, פעילות "בינונית" הלכה או הליכה. נושאים שעסקו בפעילויות שונות באופן משמעותי מהליכה או הליכה לא נכללו במדגם. לדוגמה, נושאים שהיו דיג, פיקניק, או הרמת משקולות לא נכללו בדגימות המתאימות.

3. תנאים ותכנון ניסיוני

1. השתמש בעיצוב טרום ניסוי מדומה/מבחן לאחר הבדיקה.
2. לאחר זיהוי נושאים והסכמה להשתתף, בקש מכל אחד מהנושאים לקרוא ולחתום על טופס IRB המסביר את האופי החופשי, המטרה והליכי המחקר.
3. בעקבות תהליך זה, לתת לנושאים פיסת בגדים (למשל, הסרט האדום) לזיהוי עתידי ולקבל אמצעים פיסיולוגיים ופסיכולוגיים של רמות הלחץ (כלומר, PSQ, 1-2 mL של רוק כי הוא לירוק או דרוד לתוך צינור הבדיקה). איסוף דגימות משעות אחר הצהריים המאוחרות לשעות הערב המוקדמות.
   הערה: הנתונים נאספו על ידי חוקרים שניהם 1) ממש לפני שנכנסו לאתר ו -2 מיד עם סיום ביקורי האתר.

4. דגימות רוק

1. כדי למנוע דילול לדוגמה, בקש מהנושאים לא לאכול, לשתות או לשטוף פיות 10 דקות לפני מתן דגימות רוק.
2. שאל נושאים לספק 1-2 mL דגימות רוק (ללא קצף) רק לפני חווית הפנאי ומיד לאחר סיום החוויה.
3. לאסוף דגימות רוק באמצעות שיטת ריר פסיבי:
   1. לספק נושאים עם 2 ב פלסטיק שתיית קש להזיל ריר לתוך קריובקבוקון 2 mL (ראה טבלת חומרים).
   2. הורה לנושאים לאפשר רוק לבריכה בפיהם, ואז להזיל ריר במורד הקש לתוך הקריובקבוקון. על פי אוסף רוק וטיפול ייעוץ (2011), 1 מ ל (לא כולל קצף) הוא מספיק עבור רוב הבדיקות.
   3. דגימות תווית עם מספר זיהוי מוקצה בן 3 ספרות (כלומר, 001) ומכתב כדי לציין את תזמון איסוף הנתונים (כלומר, A מייצג קדם-בדיקה, B מייצג את לאחר הבדיקה; כאשר 001A מייצג את דגימת רוק שסופקו על-ידי משתתף 001 לפני שניצח על חוויית הפנאי).
   4. לאחר המדגם נאסף ומתויג, זה צריך להיות מאוחסן קפוא זמנית בתיבה קצף סטרואידים מלא קרח יבש עבור לא יותר 2 h.
   5. להעביר את הדגימות המסומנות למעבדה ולחנות ב-80 ° c עד לניתוח.

5. קוונפיקציה של α-עמילאז

הערה: בצורה זו, α-עמיקלז הידרו 2-כלורט-p-ניטרופניו-α-D-maltotrioside ל-2-כלורו-ניטרונול וצורות גלוקוז, 2-כלורט-p-ניטרופניל-α-D-maltoside, maltotriose, ו גלוקוז. התגובה מפוקחת בספיגה של 405 ננומטר, התואמת לפעילות α-עמיקלז במדגם. שיטת הפעולה ממחישה יניאריות בין 0 ל-2000 U/L.

1. חומרים
   1. השתמשו בערכת מגיב של עמיקלז נוזלי (ראו טבלת חומרים) לכמת α-עמילאז בדגימות רוק. כל הריאגנטים מסופקים כנוזלים מוכנים לשימוש ומאוחסנים ב-0-4 ° c.
   2. השתמש בקורא במצב מרובה (ראה טבלת חומרים) המסוגל לקרוא דחיסות אופטית ב405 ננומטר עם טמפרטורה הנשלטת על-ידי 37 ° c במהלך השימוש.
2. ניתוח
   1. . להפשיר את הדגימות על הקרח לפני הניתוח
   2. לדלל דגימות 1:10 with 1x PBS (10 μL של רוק + 90 μL של PBS).
   3. לנתח כל דוגמה בכפולה.
   4. מ20-25 לפחות 30 דקות.
   5. הוסף 0.1 mL של עמיקלז מגיב ל 96 מיקרופלייט היטב עבור כל מדגם.
   6. Pre-מודטה את המיקרופלייט ב 37 ° c למינימום של 5 דקות.
   7. הוסף 2.5 μL של המדגם לגיב אמילז.
   8. לקחת קריאה ראשונית אחרי 60 s.
   9. המשך קריאות כל 60 s עבור 2 דקות נוספות.
   10. לחשב את ההפרש הממוצע בספיגת המחיר לדקה (ΔAbs/min).
3. חישוב
   1. כדי לחשב פעילות עמיקלז, השתמש בנוסחה הבאה:
      
      כאשר ΔAbs/min = שינויים בהפרש הקליטה לדקה; טלוויזיה = נפח שיטת הכולל (0.1025 mL); * 1000 = המרה של U/mL ל U/L; MMA = המשך הספיגה של 2-כלורו-p-ניטרופנול = 12.9; SV = נפח לדוגמה (0.0025 mL); ו LP = שביל אור (1 ס מ). החלפת נותן:
      
      לכן, הכפל את ΔAbs/min על-ידי 3178x מקדם הדילול (10) כדי לקבל אמילז ב U/L.
   2. עבור דגימות מעל 2000 U/L (שיקול יניאריות) לדלל עוד (לפחות 2x באמצעות PBS) ו-מחדש החזרה, ולאחר מכן להכפיל את התוצאה α-עמיקלז על ידי גורם הדילול הנוסף.

6. קוונפיקציה של קורטיזול

הערה: בשיטה זו, קורטיזול חינם הוא ככמת ברוק באמצעות עקומת קורטיזול סטנדרטית. תקנים ודגימות מדולל מתווספים לצלחת microtiter כי הוא מצופה מראש עם נוגדן. מצורף קורטיזול-peroxidase מתווסף הבארות, ואחריו תוספת של נוגדן חד שבטיים כדי קורטיזול. הכמות של כריכת קורטיזול/peroxidase המשלים יורדת כריכוז הקורטיזול במדגם מגביר.

1. חומרים
   1. השתמש בערכת חיסונית של אנזים קורטיזול (ראה טבלת חומרים) כדי לכמת קורטיזול בדגימות רוק. כל החומרים הדרושים לביצוע שיטת הפעולה נכללים בערכה. כל הרכיבים של הערכה מאוחסנים ב 0-4 ° צ' לפני ההגעה לתאריך התפוגה.
   2. השתמש בספקטרוסקופיה המסוגלת לקרוא דחיסות אופטית (OD) ב 450 nm (ראה טבלת חומרים), כמו גם תוכנה המסוגלת להשתמש בהקלטות OD מתוך קורא הצלחות לבצע עקומת לוגיסטי ארבעה פרמטרים (4 PLC) התאמה.
2. הכנה מגיב
   1. אפשר לכל החומרים המאפשרים ל20-25 ° c למינימום של 30 דקות.
   2. לדלל את מאגר הקורטיזול 1:5 באמצעות מים מוכי.
   3. דלל את מאגר הכביסה 1:20. בעזרת מים מוכי מלים
      הערה: שיטת האחסון ומאגרי הכביסה יציבים למשך 3 חודשים כאשר הם מאוחסנים ב-0-4 ° c.
3. הכנה לדוגמא
   1. . להפשיר את הדגימות על הקרח לפני הניתוח
   2. לדלל דגימות 1:10 עם מאגר שיטת קורטיזול (20 μL של רוק + 180 μL של מאגר) ולהשתמש בתוך 2 h הכנה.
4. הכנת תקנים
   1. תווית הבדיקה צינורות זכוכית1 -7.
   2. Pipet 225 μL של מאגר שיטת האגירה לתוך צינור1 ו 125 μL של מאגר לתוך צינורות2 -7.
   3. הוסף 25 μL של פתרון מלאי קורטיזול ל1 צינור מערבולת.
   4. הסר 125 μL של מאגר מ1 הצינור ולהוסיף אותו2 צינור, ואז מערבולת.
   5. חזור על הדילול הסדרתי עבור צינורות3 -7.
      הערה: ריכוזי הקורטיזול הסופיים של כל תקן מוצגים בטבלה 1.
   6. יש להשתמש בתקנים בתוך 2 שעות של הכנה.

רגיל	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
אמצעי אחסון של מאגר שמות (μL)	225	125	125	125	125	125	125
נוסף	מניות Std	#1	#2	#3	#4	#5	#6
נפח של חיבור (μL)	25	125	125	125	125	125	125
ריכוז סופי (pg/mL)	3200	1600	800	400	200	100	50

טבלה 1: טבלת הכנה של עקומת עקומות סטנדרטית.

5. ניתוח
   1. השתמש בפריסת הצלחת למטה באיור 1 כמדריך להגדיר את המיקרו-לוחית.
   2. מומלץ להשתמש בצנרת רב-ערוצית לתוספת של ריאגנטים.
   3. הוסף 50 μL של דגימות או תקנים למספר המתאים של בארות בלוח. יש להפעיל דגימות ותקנים בכפולה.
   4. הוסף מאגר הסדר (75 μL) לתוך בארות האיגוד הלא ספציפיות (NSB).
   5. הוסף מאגר שיטות (50 μL) לתוך המאגר המרבי (B0) בארות ואפס סטנדרטי (ריק) בארות.
   6. הוסף 25 μL של המשלים קורטיזול לכל באר.
   7. הוסף 25 μL של נוגדן קורטיזול לכל טוב, למעט בארות NSB.
   8. להקיש בעדינות את הצד של הצלחת לערבב את הריאגנטים.
   9. מכסים עם חותם הצלחת ללחוץ בטמפרטורת החדר (RT) ב 20-25 ° c עבור 1 h.
   10. הסר את התוכן היטב ולשטוף כל 4x היטב עם מאגר לשטוף (300 Μl). הקש על הצלחת כדי לייבש על מגבות ספיגה בין שוטף.
   11. הוסף את המצע TMB לכל טוב (100 μL).
   12. מודקת את הצלחת ב 20-25 ° c עבור 30 דקות בלי לרעוד.
   13. הוסף פתרון הפסקה לכל טוב (50 μL).
   14. לקרוא את הצפיפות האופטית בכל טוב של מיקרופלייט ב 450 ננומטר.
   15. ממוצע הצפיפות האופטית עבור כל תקן, לאחר מכן לדגום ולהפחית את הצפיפות האופטית הממוצע עבור בארות NSB.
   16. חשב את ה-% bound (B/B0) עבור כל הדוגמאות המשתמשות בפקדי איגוד מרבי (B0).
   17. צור עקומה סטנדרטית תוך שימוש בתוכנה המסוגלת להתאמת עקומת רגרסיה לוגיסטית בעלת ארבעה פרמטרים, מחושבת מעקומת% B/B0.
   18. הכפל את התוצאה על ידי מקדם הדילול (10) כדי לקבל ערכי קורטיזול ב-pg/mL.
   19. דגימות עם צפיפויות אופטיות היורדות מעל הסטנדרט הגבוה ביותר צריכה להיות מדוללת עוד יותר עם מאגר הספיקות ומחדש, ולכן יש להכפיל את התוצאה באמצעות גורם הדילול הנוסף.

איור 1 : לוחית דוגמה פריסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

7. מדידה פסיכולוגית (שאלון מאמץ נתפס)

1. למדוד רמות פסיכולוגיות של נושאים באמצעות PSQ שפורסמו על ידי Fliege et al^.13, הכולל ארבעה גורמים (לדאוג, מתח, מתח, שמחה) ומנצל 20 פריטים.
2. בקשו מהנושא למלא את ה-PSQ רק לפני חווית הפנאי שלהם ומיד לאחר סיום החוויה.
3. תייג שאלונים עם מספר זיהוי בן 3 ספרות הזהה לרמת הלחץ הביוסיטולוגית של כל נושא.

תוצאות

תאור המדגם
ניצול טכניקת דגימה מיכסה, מחקר זה גייסה 35 מבקרים מכל אחד משלושת האתרים. בסך הכל, 105 נושאים גויסו במחקר זה, כולל 63 זכרים ו 42 הנקבות. הגילאים הממוצעים של מבקרים שגויסו משלושה אתרים שונים היו 25.9 שנים (אתר A), 37.2 שנים (אתר B), ו-28.8 שנים (אתר C). כמו כן נרשמו תדרים של ביקורי נושאים ל?...

Discussion

מטרת מחקר זה היא לזהות שינויים פוטנציאליים בלחץ באמצעות כלים ביופיזיים ופסיכולוגיים בעקבות ביקורי פנאי לשלוש הגדרות שונות עם רמות שונות של הטבע. גם קורטיזול וגם α-עמילאז הוכחו כאינדיקטורים אמינים לרמות של לחץ פסיכולוגי. הליך הבדיקה של עמיקלז המתואר במחקר זה הותאם לפורמט היטב 96. כאשר רמות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	DetectX	K003-H1	The Cortisol Enzyme Immunoassay kit is designed to quantitatively measure cortisol present in dried fecal extracts, saliva, urine, serum, plasma and culture media samples.
Cryogenic Labels for Cryogenic Storage	Fisherbrand	5-910-A	Unique adhesive withstands extreme temperature
Liquid Amylase (CNPG3) Reagent Set	Pointe Scientific	A7564	For the quantitative kinetic determination of α-amylase activity in human serum.
Round Bottom 2mL Polypropylene Tubes with External Thread Cap	Greiner Bio-One	07-000-257	2.0 ml U-BTM Cryo.s self standing polypropylene sterilized
Synergy Multi-Mode Microplate Reader	BioTek		It is a single-channel absorbance, fluorescence, and luminescence microplate reader that uses a dual-optics design to perform measurements of samples in a microplate format.