Doğanın farklı seviyeleri ile üç yerlere ziyaretten sonra biyofizik ve psikolojik stres seviyeleri ölçme

Özet

Bu makalenin amacı, üç farklı ayarlara ziyaretten sonra stres düzeylerinde yapılan değişiklikleri belirlemektir ve tükürük kortizol, α-amilaz ve psikolojik kendi kendine rapor önlemleri temelinde stres düzeylerini tanımlamada kullanılan yöntemleri açıklamak Enstrüman.

Özet

Doğal ortamlarda ziyaret psikolojik stres azaltma ile bağlantılı olmuştur. En stres ile ilgili araştırma kendi kendine rapor formatları üzerinde güvenmiştir rağmen, çalışmalar artan sayıda Şimdi biyolojik stres ile ilgili hormonlar ve katalizörler dahil, kortizol ve α-amilaz gibi, stres düzeylerini ölçmek için. Burada sunulan bir protokol doğanın farklı seviyeleri ile üç farklı yerlere ziyaret aşağıdaki Biyofizik ve psikolojik stres seviyeleri üzerinde etkilerini incelemek için. Biyofizik ve kendi kendine bildirilen psikolojik stres seviyeleri, seçilen konumları girdikten hemen önce ve siteyi bırakarak ziyaretçilerden önce ölçülür. Bir "Drool" yöntemi kullanarak, Biyofizik tedbir üç çalışma yerlerinden birine giriş üzerine çalışma konuları tarafından sağlanan tükürük 1-2 mL örnekleri oluşur. Uzadığı literatürde belirtildiği gibi, tükürük bir 45 dakika içinde toplanarak ziyaretçinin bulunduğu yerin sonuna kadar zaman diliminde toplanır. Tükürük koleksiyonunu takiben, numune etiketlenir ve biyolojik bir laboratuara taşınır. Kortizol Bu çalışmada ilgi Biyofizik değişkenidir ve bir TECAN plaka okuyucu ile bir ELISA süreci kullanılarak ölçülür. Kendi kendine bildirilen stres ölçmek için, algılanan stres Anketi (PSQ), endişe düzeyleri raporlar, gerginlik, sevinç, ve algılanan talepleri. Veriler, öğleden sonraları akşamları erken saatlerde üç sitede toplanır. Her üç ayar arasında karşılaştırıldığında, stres seviyeleri, hem biyolojik işaretçileri ve kendi kendine raporlar tarafından ölçülen, en doğal ayarı ziyaret ettikten sonra önemli ölçüde daha düşüktür.

Giriş

Yüksek stres seviyeleri uzun kalp hastalığı gibi birçok ciddi sağlık koşullarına bağlı olmuştur, obezite, ve psikolojik bozukluklar^1,2,3. Araştırma büyüyen bir vücut, Park ve non-gelişmiş manzaralar gibi doğal ayarlara yakın yakınlık ya da ziyaret psikolojik refah ve stres seviyeleri azaldı üzerinde dikkat çekici bir etkiye sahip olabileceğini düşündürmektedir^{1,4, 5},^6,7,8,9,10. Doğal ayarlar ve stres düzeylerinin etkileri için açıklamalar aşağıdakiler dahil edilmiştir: (1) doğal ayarları fiziksel aktivite için mekanlar sağlamak^8,11 ve (2) doğal ortamlar için ziyaretçiler odaklanmak yeteneğine sahip daha fazla olmayan görev düşünce süreçleri, böylece dikkat yorgunluk bir azalma yol açan¹². Doğanın stres azaltma üzerinde etkilerini belirlemek için, bu çalışmada üç farklı rekreasyon sitelerine ziyaretten sonra, psikolojik stres (PSQ) ve iki tükürük bazlı biyomarker, kortizol ve α-amilaz kendi kendine rapor kullanır. Bu konumlar "doğalılık" seviyeleri arasında değişir ve bir vahşi tipi ayarı, Belediye Parkı ve yerel Fitness ve rekreasyon tesisi içerir.

Bu çalışmada aşağıdaki araştırma sorularını ele almayı amaçlamaktadır: (RQ₁) her üç sitede (yani, doğal, yarı doğal, inşa) karşılaştırıldığında tükürük kortizol ve α-amilaz ile ölçülen Biyofizik stres düzeylerinde farklılıklar var mı? (RQ₂) Her üç sitede (yani, doğal, yarı doğal, inşa) karşılaştırıldığında PSQ (dört yapıları: talepler, endişeler, gerginlik ve sevinç) ile ölçülen psikolojik stres seviyeleri farklılıkları var mı?

Protokol

Bu çalışmada, Indiana Üniversitesi Kurumsal Inceleme kurulu ınsan araştırma koruma programı 'nın politikaları ve kuralları takip edilir.

1. konum seçimi

1. Farklı doğa düzeylerine dayanan site sayısını (n) seçin.
   Not: Biz iş için üç site seçti. "Doğalılık" düzeylerine dayalı bir süreklilik kullanarak, site A en doğal olarak kabul edildi ve bir göl sınırında ormanlık sırtların yaklaşık 1.200 dönümlük oluşur ve bir yaprak döken orman içinde ayarlayın. En yaygın etkinlikler arasında yürüyüş ve yaban hayatı gözlemciliği sayılabilir. B sitesi, yürüyüş yolları, toplantılar için yerler, oyun alanları ve nedensel eğlence faaliyetleri için açık alan alanı içeren bir 33 dönümlük Belediye parkıydı. C sitesi, en düşük doğalılık düzeyine sahip kentsel, kapalı bir egzersiz tesisidir. Her üç site orta ölçekli bir şehir (46.000 kişi tahmini nüfusu) Orta Batı Amerika Birleşik Devletleri nispeten yakın bulunmaktadır.

2. katılımcı taraması ve hazırlanması

1. Katılımcılar eğlence deneyimleriyle karşılaşmadan önce tam katılımcı alımı.
   Not: A ve B siteleri Için, konular Park girişinin otoparkında araştırmacı tarafından yaklaşıldı. C sitesi için, konular kapalı egzersiz tesisin resepsiyonunda yaklaştılar. Aktivite türünde farklılıklar için kontrol etmek için, her iki site A ve B için işe konular ağırlıklı olarak yürüyüş, site C için birincil aktivite çalışan veya kapalı pistte yürüyüş oldu.
2. İşe alma sırasında, konular tükürük kortizol örnekleri toplama ile ilgili yönergelerine uymasını hatırlatın. Tükürük numuneleri vermeden önce 10 dakika yemiyor veya içmiyor olmalılar.
   Not: Bu durumda, tükürük numunelerinin hacim veya seyreltme (konsantrasyon) için normalleştirilmediğini-yani katılımcıların yeterli derecede Hidratlanmış ve/veya örnek koleksiyonlar arasında hidrasyon değişikliği yapmadığını unutulmamalıdır.
3. Her katılımcı için kırmızı kol bantları (veya eşdeğer fark giysi) vermek için onların nişan sonunda ortaya çıktığında kolay kimlik sağlamak için.
4. Üç sitedeki tüm konuların her sitede benzer bir süre harcamasını sağlayan 30-40 min zaman tahsis etme süresi atayın. Numunenin geri kalanından daha fazla veya daha az zaman harcayacak konuları dışlama.
5. Faaliyet türünü tutarlı tutun.
   Not: Bu durumda, "Orta" aktivite yürüyüş veya yürüyüş oldu. Yürüyüşten veya yürüyüşlerden önemli ölçüde farklı faaliyetler yapan konular örnekten dışlandı. Örneğin, balıkçılık, picnicking veya ağırlık kaldırma olan konular ilgili örneklere dahil edilmedi.

3. koşullar ve deneysel tasarım

1. Bir yarı deneysel ön test/post-test tasarımı kullanın.
2. Konuları tanımlayıp katılmaları üzerine, her konuyla ilgili olarak, çalışmanın gönüllü doğasını, amacını ve prosedürlerini açıklayan bir ıRB formunu okuyup imzalamalarını isteyin.
3. Bu sürecin ardından, konular (örneğin, kırmızı kol bandı) gelecekteki tanımlama için bir parça vermek ve stres seviyeleri fizyolojik ve psikolojik önlemler elde (yani, PSQ, 1-2 mL tükürük ya da bir test tüpü içine drooled). Öğleden sonra akşam erken örnekleri toplayın.
   Not: Bu veriler araştırmacılar tarafından her ikisi de 1) hemen önce konular siteye girdi ve 2) siteye ziyaret sona erdirme sonra toplandı.

4. tükürük örnekleri

1. Numune seyreltmesini önlemek için, tükürük numuneleri vermeden önce 10 dakika yememesi, içmemesi veya durulaması için konular isteyin.
2. Eğlence deneyiminden hemen önce ve deneyimin sona akması sonrasında 1-2 mL tükürük örneği (köpük hariç) sağlamak için konularda isteyin.
3. Pasif bir saçmalamak yöntemi kullanarak tükürük örneklerini toplayın:
   1. 2 ml kriyoşişe içine saçmalamak için plastik içme saman 2 ile konular sağlamak ( malzeme tablosunabakın).
   2. Tükürüğün ağızlarında havuza girmesine izin vermek, sonra da saman ve kriyoşişe içine tükürme için konular isteyin. Tükürük toplama ve taşıma tavsiyesi (2011) göre, 1 mL (köpük hariç) çoğu testler için yeterlidir.
   3. Atanan 3 haneli KIMLIK numarasına sahip etiket örnekleri (örn. 001) ve veri toplamanın zamanlamasını gösteren harf (örn. ön testi temsil eden B, post-test temsil eder; burada 001A, katılımcı 001 tarafından sağlanan tükürük örneğini temsil eder, eğlence deneyimi).
   4. Örnek toplanan ve etiketlendikten sonra, daha sonra geçici olarak dondurulmuş bir steroid köpük kutusunda Kuru buz dolu, daha fazla 2 h için depolanmalıdır.
   5. İşaretli numuneleri bir laboratuvara taşıma ve analiz edene kadar-80 °C ' de saklayın.

5. α-amilaz miktarının belirlenmesi

Not: Bu tahlil, α-amilaz hidrolize 2-chloro-p-nitrophenyl-α-D-maltotrioside 2-chloro-nitrophenol ve formları glikoz, 2-chloro-p-nitrophenyl-α-D-maltoside, maltotriose, ve glikoz. Reaksiyon, numunenin α-amilaz aktivitesine karşılık gelen 405 nm 'lik bir absorbante izlenir. Bu tahlil 0 ve 2000 U/L arasında doğrusallık gösterir.

1. Malzeme
   1. Tükürük örneklerinde α-amilaz ölçmek için sıvı amilaz reaktif seti ( malzeme tablosunabakın) kullanılmıştır. Tüm reaktif maddeleri kullanıma hazır sıvılar olarak sağlanır ve 0-4 °C ' de saklanır.
   2. Test sırasında 37 °C ' ye kadar kontrollü bir sıcaklık ile 405 nm 'de optik yoğunluğu okuma yeteneğine sahip çok modlu bir okuyucu ( malzeme tablosunabakın) kullanın.
2. Analysis
   1. Analizlerden önce buzun üzerindeki numuneleri çözün.
   2. 1 PBS (10 μL tükürük + 90 μL PBS) ile seyreltmeli numuneler 1:10.
   3. Yinelenen her örnek analiz edin.
   4. Amilaz reakajının 20-25 °C ' ye en az 30 dakika dengelenmek.
   5. Her örnek için 96 iyi bir mikroplakaya 0,1 mL amilaz reakajının ekleyin.
   6. Mikroplakayı 37 °C ' de en az 5 dk. ön inkübe etmek.
   7. 2,5 μL örneğini amilaz reakajında ekleyin.
   8. 60 s sonra ilk okuma alın.
   9. Devam okuma her 60 s ek 2 dakika için.
   10. Dakika başına ortalama emilme farkını hesaplayın (Δabs/min).
3. Hesaplama
   1. Amilaz etkinliğini hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      
      Burada ΔABS/min = dakika başına emilme farkı değişiklikleri; TV = toplam tahlil hacmi (0,1025 ml); * 1000 = u/mL 'ye dönüştürme = u/L; MMA = 2-chloro-p-nitrophenol milimetre emici = 12,9; SV = numune hacmi (0,0025 ml); ve LP = ışık yolu (1 cm). Yerine verir:
      
      Bu nedenle, U/L 'de amilaz elde etmek için Δabs/min 'i 3178x tarafından seyreltme faktörü (10) ile çarpın.
   2. Yukarıdaki örnekler için 2000 U/L (tahlil doğrusallık) daha fazla seyreltme (en az 2x PBS kullanarak) ve yeniden tahlil, daha sonra ek seyrelme faktörü ile α-amylase sonucu çarpın.

6. kortizol ölçümü

Not: Bu tahlil, ücretsiz kortizol bir kortizol standart eğrisi kullanarak tükürük nicelik olduğunu. Standartlar ve seyreltilmiş numuneler, antikor ile önceden kaplanmış bir mikrotiter plakasına eklenir. Bir kortizol-peroksidaz Konjugat kuyu eklenir, kortizol bir monoklonal antikor ek olarak takip. Kortizol/peroksidaz Konjugat bağlayıcı miktarı, örnekteki kortizol konsantrasyonu arttıkça azalır.

1. Malzeme
   1. Tükürük numunelerinde kortizol ölçmek için bir kortizol enzim Immunassay kiti ( malzeme tablosunabakın) kullanın. Bu tahlil gerçekleştirmek için gerekli tüm reaktifler kiti dahildir. Kit 'in tüm bileşenleri, son kullanma tarihine ulaşmadan önce 0-4 °C ' de saklanır.
   2. 450 nm 'de ( malzeme tablosunabakın) bir optik yoğunluğu (OD) okuyabilen bir spektrofotometre ve dört parametreye ait Logistic Curve (4 PLC) uyum gerçekleştirmek için plaka okuyucudan od kayıtlarını kullanma yeteneğine sahip yazılım kullanın.
2. Reakajın hazırlanması
   1. Tüm reaktiflerin en az 30 dakika boyunca 20-25 °C ' ye dengelenmesine izin verin.
   2. Deiyonize su kullanarak kortizol assay tampon 1:5 seyreltin.
   3. Deiyonize su kullanarak yıkama tamponunu 1:20 seyreltin.
      Not: 0-4 °C ' de saklandığı zaman 3 ay boyunca tahlil ve yıkama tamponları stabildir.
3. Numune hazırlama
   1. Analizlerden önce buzun üzerindeki numuneleri çözün.
   2. Seyreltmeli numuneler 1:10 kortizol tahlil tamponu (20 μL tükürük + 180 μL tampon) ve 2 h hazırlık içinde kullanın.
4. Standartlar hazırlanması
   1. Etiket cam test tüpleri #1-#7.
   2. Pipet 225 μL test tamponu tüp #1 ve 125 μL tampon #2-#7.
   3. Tüp #1 ve Vortex için 25 μL kortizol stok solüsyonu ekleyin.
   4. Tüp #1 tampon μL 125 çıkarın ve tüp #2, sonra Vortex ekleyin.
   5. Tüpler #3-#7 için seri dilüsyonları tekrarlayın.
      Not: her standart son kortizol konsantrasyonları Tablo 1' de gösterilir.
   6. Standartların hazırlanması 2 saat içinde kullanılması gerekmektedir.

Standart	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
Tahlil tampon hacmi (μL)	225	125	125	125	125	125	125
Ek	Stok std	#1	#2	#3	#4	#5	#6
Ilavenin hacmi (μL)	25	125	125	125	125	125	125
Son konsantrasyon (PG/mL)	3200	1600	800	400	200	100	50

Tablo 1: Standart eğrisi hazırlama tablosu.

5. Analysis
   1. Mikroplaka ayarlamak için bir kılavuz olarak Şekil 1 ' de aşağıdaki plaka düzenini kullanın.
   2. Reaktiflerin eklenmesi için çok kanallı pipet kullanılması tavsiye edilir.
   3. 50 μL örnekleri veya standartları plaka içinde uygun sayıda kuyu içine ekleyin. Örnekler ve standartlar yinelenen olarak çalıştırılmalıdır.
   4. Özel olmayan bağlama (NSB) kuyuları içine tahlil tampon (75 μL) ekleyin.
   5. Maksimum bağlayıcı (B0) kuyuları ve sıfır standart (boş) kuyuları içine tahlil tampon (50 μL) ekleyin.
   6. Her bir kuyu için 25 μL kortizol Konjugat ekleyin.
   7. NSB kuyuları dışında her bir kuyu için 25 μL kortizol antikor ekleyin.
   8. Reaktifleri karıştırmak için plakanın tarafına hafifçe dokunun.
   9. Plaka mühürleyici ile Kapla ve oda sıcaklığında (RT) 20-25 °C ' de 1 saat sallayın.
   10. Kuyu içeriğini çıkarın ve her iyi 4X yıkama tampon (300 μL) ile durulayın. Yıkaylar arasında emici havlu üzerine kurumaya plaka dokunun.
   11. TMB substrat her iyi (100 μL) ekleyin.
   12. 20-25 °C ' de plakayı 30 dakika süreyle sallama.
   13. Her kuyu için Stop çözümünü ekleyin (50 μL).
   14. 450 nm 'de mikroplakanın her bir kuyunda optik yoğunluğu okuyun.
   15. Her standart için optik yoğunlukları ortalama, sonra örnek ve NSB kuyuları için Ortalama optik yoğunluğu çıkarın.
   16. Maksimum bağlama (B0) denetimlerini kullanarak tüm örneklerin% bağımlı (B/B0) hesaplayın.
   17. % B/B0 eğrisinden hesaplanan dört parametreye sahip Logistic regresyon eğri sığdırma yeteneğine sahip yazılımları kullanarak standart bir eğri oluşturun.
   18. PG/mL 'de kortizol değerleri elde etmek için sonucu seyreltme faktörü (10) ile çarpın.
   19. En yüksek standartta düşen optik yoğunluklara sahip numuneler, tahlil tamponu ile daha da seyreltilmeli ve ardından sonuç ek seyreltme faktörü ile çarpılmalıdır.

Şekil 1 : Örnek plaka düzeni. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

7. psikolojik ölçüm (algılanan stres Anketi)

1. Dört faktör (endişe, gerginlik, gerginlik, sevinç) içerir ve 20 öğeleri kullanır Fliege ve al.¹³tarafından yayımlanan PSQ kullanarak konuların psikolojik düzeylerini ölçmek.
2. Konuyla ilgili olarak, eğlence deneyimlerinden hemen önce ve deneyimlerinin sonuçlandırılması ile ilgili olarak PSQ 'i doldurmasını isteyin.
3. Anketleri, her bir konunun biophysiological stres düzeyine özdeş 3 haneli bir KIMLIK numarasına sahip olarak etiketleyin.

Sonuçlar

Örnek açıklama
Bir kota örnekleme tekniği kullanarak, bu çalışmada her üç sitelerin 35 ziyaretçi işe. 63 erkek ve 42 kadın da dahil olmak üzere bu çalışmada toplam 105 konu alındı. Üç farklı siteden alınan ziyaretçilerin ortalama çağları 25,9 yıl (site A), 37,2 yıl (site B) ve 28,8 yıl (site C) idi. Seçilen üç siteye ilgili konuların ziyaretlerinin frekansları da kaydedildi. Site A ve site C için, konuların çoğunluğu haftada bir-üç kez bu siteyi ziyaret etti. ...

Tartışmalar

Bu çalışmanın amacı, farklı doğa seviyelerine sahip üç farklı ayar için eğlence ziyareti sonrasında Biyofizik ve psikolojik aletleri kullanarak stres üzerindeki olası değişiklikleri belirlemektir. Hem kortizol hem de α-amilaz psikolojik stres düzeylerinin güvenilir göstergeleri olarak gösterilmiştir. Bu çalışmada açıklanan amilaz tahlil prosedürü bir 96 iyi biçimine adapte edilmiştir. Tükürük amilaz seviyeleri yüksek olduğunda, emilme değişiklikleri hızla ortaya çıkar. Bu nedenle...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	DetectX	K003-H1	The Cortisol Enzyme Immunoassay kit is designed to quantitatively measure cortisol present in dried fecal extracts, saliva, urine, serum, plasma and culture media samples.
Cryogenic Labels for Cryogenic Storage	Fisherbrand	5-910-A	Unique adhesive withstands extreme temperature
Liquid Amylase (CNPG3) Reagent Set	Pointe Scientific	A7564	For the quantitative kinetic determination of α-amylase activity in human serum.
Round Bottom 2mL Polypropylene Tubes with External Thread Cap	Greiner Bio-One	07-000-257	2.0 ml U-BTM Cryo.s self standing polypropylene sterilized
Synergy Multi-Mode Microplate Reader	BioTek		It is a single-channel absorbance, fluorescence, and luminescence microplate reader that uses a dual-optics design to perform measurements of samples in a microplate format.