Измерение уровня биофизического и психологического стресса после посещения трех мест с различными уровнями природы

Резюме

Целью данного документа является выявление изменений в уровнях стресса после посещения трех различных параметров и описание методов, используемых при определении уровней стресса на основе показателей слюнного кортизола, амилазы и психологического самоотчета Инструмент.

Аннотация

Посещение природной среды было связано с психологическим снижением стресса. Хотя большинство исследований, связанных со стрессом, опирались на форматы самоотчета, все большее число исследований в настоящее время включает в себя биологические гормоны и катализаторы, связанные со стрессом, такие как кортизол и амилаза, для измерения уровня стресса. Представлен протокол для изучения влияния на уровни биофизического и психологического стресса после посещения трех различных местах с различными уровнями природы. Биофизические и самостоятельно зарегистрированные уровни психологического стресса измеряются сразу же при входе в выбранные места и непосредственно перед тем, как посетители покидают сайт. Используя метод "слюни", биофизическая мера состоит из 1-2 мл образцов слюны, предоставленных исследуемых испытуемых при входе в одно из трех мест исследования. Как предписано сохранившейся литературы, слюна собирается в течение 45 минут сроки после окончания участия посетителя на месте. После сбора слюны образцы маркируются и транспортируются в биологическую лабораторию. Кортизол является биофизической переменной интереса в этом исследовании и измеряется с помощью процесса ELISA с TECAN пластины читателя. Для измерения самостоятельной сообщил стресс, Воспринимается стресс вопросник (PS), который сообщает уровни беспокойства, напряженности, радости и воспринимается требования. Данные собираются на всех трех объектах во второй половине дня до раннего вечера. При сравнении во всех трех условиях, уровни стресса, измеряемые как биологические маркеры и самоотчеты, значительно ниже после посещения наиболее естественной обстановке.

Введение

Повышенный уровень стресса уже давно связаны со многими серьезными заболеваниями, такими как болезни сердца, ожирение и психологические расстройства^1,2,3. Растущий объем исследований показывает, что близость или посещение природных условий, таких как парк и неразвитые ландшафты могут иметь замечательное влияние на психологическое благополучие и снижение уровня стресса^{1,4, 5,6,7,8,9,10}. Объяснения последствий природных условий и уровней стресса включали в себя следующее:(1) естественные условия обеспечивают места для физической активности 8,¹¹ и (2) посетителей в естественной среде имеют возможность сосредоточиться на более незадачных мыслительных процессов, тем самым приводит к снижению усталости внимания¹². Для определения влияния природы на снижение стресса, это исследование использует самоотчет о психологическом стрессе (ПСЗ) и два биомаркера на основе слюны, кортизола и амилазы, после посещения трех различных мест отдыха. Эти места различаются между их уровнями "естественности" и включают в себя дикую природу типа настройки, муниципальный парк, и местные фитнес-и базы отдыха.

Данное исследование направлено на решение следующих вопросов исследования: (РЗ₁) Существуют ли различия в уровнях биофизического стресса, измеряемых слюнным кортизоломом и амилазой при сравнении во всех трех участках (т.е. естественных, полунатуральных, построенных)? (РЗ₂) Существуют ли различия в уровнях психологического стресса, измеряемые ПСЗ (проявляемые четырьмя конструкциями: требования, заботы, напряжение и радость) по сравнению со всеми тремя участками (т.е. естественными, полуестественными, построенными)?

протокол

Это исследование следует политике и руководящим принципам Программы защиты человеческих исследований Университета Индианы Институциональный обзор совета.

1. Выбор местоположения

1. Выберите количество сайтов (n) на основе различных уровней природы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выбрали три сайта для нашей работы. Используя континуум, основанный на уровнях "естественности", сайт А считался наиболее естественным и состоит из примерно 1200 акров лесистых хребтов, граничащих с озером и установленных в лиственных лесах. Наиболее распространенные виды деятельности включают ходьба и наблюдение за дикой природой. Сайт B был 33 акров муниципального парка с участием пешеходных дорожек, мест для собраний, игровых площадок, а также открытое пространство поля для причинно-следственной деятельности. Сайт C был городским, крытым объектом упражнений с самым низким уровнем естественности. Все три объекта находятся в относительно близкой близости от города среднего размера (по оценкам, население 46000 человек) на среднем западе Соединенных Штатов.

2. Скрининг участников и подготовка

1. Полный набор участников, прежде чем предметы занимаются рекреационным опытом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для сайтов A и B, субъекты подходили исследователь на стоянке входа в парк. Для сайта C, предметы подходили на стойке регистрации крытый объект упражнений. Для контроля различий в типе активности субъекты, набранные как для сайтов A, так и B, были преимущественно походами, в то время как для сайта C основной деятельностью была бег или ходьба по крытой трассе.
2. Во время набора напоминайте субъектам о соблюдении руководящих принципов, связанных со сбором образцов слюнного кортизола. Они не должны есть или пить 10 мин, прежде чем предоставить образцы слюны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что в этом случае образцы слюны не были нормализованы для объема или разбавления (концентрации) - т.е. были ли участники надлежащим образом увлажнены и/или же гидратация изменялась между сборами образцов.
3. Дайте красные повязки (или эквивалентно заметной одежды) для каждого участника, чтобы обеспечить легкую идентификацию при появке в конце их обязательств.
4. Назначить 30-40 минут времени выделения так, что все субъекты на трех сайтах проводят одинаковое количество времени в каждом сайте. Исключите испытуемых, которые тратят значительно больше или меньше времени, чем остальная часть выборки.
5. Поддерживайте согласованность вида деятельности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае ,средняя" деятельность была ходьба или походы. Субъекты, занимающиеся деятельностью, существенно отличающейся от пеших или пешеходных походов, были исключены из выборки. Например, в соответствующие образцы не были включены предметы, которые ловили рыбу, устраивали пикники или тяжеловесы.

3. Условия и экспериментальный дизайн

1. Используйте квазиэкспериментальный предтестовый/посттестовый дизайн.
2. После определения предметов и их согласия на участие, попросите каждого субъекта прочитать и подписать форму IRB, объясняющую добровольный характер, цель и процедуры исследования.
3. После этого процесса, дать субъектам кусок одежды (например, красная повязка) для будущей идентификации и получить физиологические и психологические показатели уровня стресса (например, Ps , 1-2 мл слюны, которая плевать или слюни в пробирку). Соберите образцы с позднего вечера до раннего вечера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти данные были собраны исследователями как 1) как перед субъектами вошел на сайт и 2) сразу же после окончания посещения сайта.

4. Образцы слюны

1. Чтобы избежать разбавления образцов, попросите испытуемых не есть, не пить и не полоскать рот за 10 минут, прежде чем предоставить образцы слюны.
2. Попросите испытуемых предоставить образцы слюны 1-2 мл (за исключением пены) непосредственно перед рекреационным опытом и сразу же после завершения опыта.
3. Сбор образцов слюны с помощью пассивного метода слюни:
   1. Предоставьте субъектам 2 в пластиковой соломы для слюни в 2 мл кривой (см. Таблица материалов).
   2. Проинструктируйте испытуемых разрешить слюне слиться в рот, затем слюни вниз по соломе и в кривой. Согласно рекомендациям по сбору и обработке слюны (2011), 1 мл (за исключением пены) является достаточным для большинства тестов.
   3. Образцы этикетки с присвоенным 3-значным идентификационным номером (т.е. 001) и письмом, указывающим время сбора данных (т.е. A представляет собой предварительный тест, B представляет после тестирования; где 001A представляет образец слюны, предоставленный участником 001 перед проведением рекреационный опыт).
   4. После того, как образец собран и помечен, он должен храниться временно замороженные в стероидной пены окно, полное сухого льда не более 2 ч.
   5. Транспортировать отмеченные образцы в лабораторию и хранить при -80 градусах По Цельсию до анализа.

5. Количественная оценка амилазы

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом ассее, й-амилазы гидролизов 2-хлоро-р-нитрофенил-з-D-maltotrioside до 2-хлоро-нитрофенол и формы глюкозы, 2-хлоро-p-nitrophenyl-- -D-maltoside, мальтотрия, и глюкоза. Реакция контролируется при абсорбции 405 нм, что соответствует активности амилозы в образце. Этот ассеид демонстрирует линейность между 0 и 2000 U/L.

1. Материалы
   1. Используется набор жидкой амилазы реагентов (см. Таблицаматериалов) для количественной оценки амилазы в образцах слюны. Все реагенты предоставляются в виде готовых к использованию жидкостей и хранятся при 0-4 градусах Цельсия.
   2. Используйте многорежимный считыватель (см. ТаблицаМатериалов), способный читать оптическую плотность на 405 нм с температурой, контролируемой до 37 градусов по Цельсию во время асссе.
2. Анализа
   1. Оттепель образцов на льду до анализа.
   2. Разбавить образцы 1:10 с 1x PBS (10 л слюны и 90 л PBS).
   3. Проанализируйте каждый образец в дубликате.
   4. Уравновесите реагент амилазы до 20-25 градусов по Цельсию в течение не менее 30 минут.
   5. Добавьте 0,1 мл амилазного реагента к микроплите 96 скважин для каждого образца.
   6. Предварительно навислите на микроплиту при 37 градусах по Цельсию в течение как минимум 5 мин.
   7. Добавьте 2,5 л образца в реагент амилазы.
   8. Возьмите первоначальное чтение после 60 с.
   9. Продолжить чтения каждые 60 с в течение дополнительных 2 минут.
   10. Рассчитайте среднее значениеразницы абсорбции в минуту (
3. Расчет
   1. Для расчета активности амилазы используйте следующую формулу:
      
      Где абс/мин - изменения в абсорбции в минуту; ТВ - общий объем ассеа (0,1025 мл); 1000 евро - преобразование U/mL в U/L; ММА - миллимолярная абсорптивность 2-хлоро-р-нитрофенола - 12,9; Объем пробы SV (0,0025 мл); и LP - световая дорожка (1 см). Замена дает:
      
      Таким образом, умножьте «Абс/мин» на 3178x коэффициент разбавления (10), чтобы получить амилазу в U/L.
   2. Для образцов выше 2000 U/ L (асссиевые линейность) разбавляют далее (по крайней мере 2x с помощью PBS) и переасвиливаем, а затем умножьте результат амилазы дополнительным фактором разбавления.

6. Количественная оценка кортизола

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом ассее, свободный кортизол количественно в слюне с помощью стандартной кривой кортизола. Стандарты и разбавленные образцы добавляются в пластину микротитера, предварительно покрытую антителом. Конъюгировать кортизол-пероксидаза добавляется в скважины, а затем добавление моноклональных антител к кортизола. Количество конъюгированной связывания кортизола/пероксидазы уменьшается по мере увеличения концентрации кортизола в образце.

1. Материалы
   1. Используйте набор иммуноанализов ферментов кортизола (см. Таблицаматериалов) для количественной оценки кортизола в образцах слюны. Все реагенты, необходимые для выполнения этого асссеа, включены в комплект. Все компоненты комплекта хранятся при 0-4 градусах Цельсия до истечения срока годности.
   2. Используйте спектрофотометр, способный читать оптическую плотность (OD) на уровне 450 нм (см. Таблицаматериалов), а также программное обеспечение, способное использовать записи OD от считывателя пластин для выполнения четырехпопаратической логистической кривой (4 PLC) установки.
2. Подготовка реагента
   1. Разрешить всем реагентам уравновесить до 20-25 градусов по Цельсию в течение как минимум 30 мин.
   2. Разбавить кортизол ассибуфер 1:5 с помощью деионизированной воды.
   3. Разбавить буфер стирки 1:20 с помощью деионизированной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Асссея и мыть буферы стабильны в течение 3 месяцев при хранении на 0-4 градусов по Цельсию.
3. Подготовка образцов
   1. Оттепель образцов на льду до анализа.
   2. Разбавить образцы 1:10 с буфером ассидного кортизола (20 л слюны и 180 л буфера) и использовать в течение 2 ч подготовки.
4. Подготовка стандартов
   1. Этикетка стеклянные пробирки #1-#7.
   2. Пипет капота 225 л буфера асссев в трубку #1 и 125 л буфера в трубки #2-#7.
   3. Добавьте 25 зл и стоек кортизола в трубку #1 и вихрь.
   4. Удалить 125 л буфера из трубки #1 и добавить его в трубку #2, а затем вихрь.
   5. Повторите серийные разбавления для трубок #3-#7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации кортизола каждого стандарта показаны в таблице 1.
   6. Стандарты должны использоваться в течение 2 ч подготовки.

Стандартный	#1	#2	#3	#4	#5	#6	#7
Объем буфера асса (КЛ)	225 год	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.
Дополнение	Фондовый Std	#1	#2	#3	#4	#5	#6
Объем добавления (КЛ)	25	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.	125 г.
Окончательная концентрация (пг/мл)	3200 г.	1600 г.	800	400	200 г.	100	50 лет

Таблица 1: Стандартный таблица подготовки кривой.

5. Анализа
   1. Используйте макет пластины ниже на рисунке 1 в качестве руководства для настройки микроплиты.
   2. Рекомендуется использовать многоканальный пипетки для добавления реагентов.
   3. Добавьте 50 кл. образцов или стандартов в соответствующее количество колодцев в пластине. Образцы и стандарты должны быть запущены в дубликате.
   4. Добавьте буфер ассеа (75 л) в неспецифические обязательные скважины (NSB).
   5. Добавьте буфер ассея (50 л) в скважины с максимальной связыванием (B0) и нулевые стандартные (пустые) скважины.
   6. Добавьте 25 конъюгированного кортизола к каждой скважине.
   7. Добавьте 25 кЛ антител кортизола к каждому колодцу, за исключением скважин NSB.
   8. Аккуратно коснитесь стороны пластины, чтобы смешать реагенты.
   9. Накройте плитой уплотнитель и встряхните при комнатной температуре (RT) при температуре 20-25 градусов по Цельсию на 1 ч.
   10. Удалите содержимое колодца и промойте каждый колодец 4x буфером для мытья (300 л). Нажмите на тарелку, чтобы высохнуть на абсорбирующимполомы между стихами.
   11. Добавьте субстрат TMB к каждой скважине (100 л).
   12. Инкубировать пластину при 20-25 градусах По Цельсию в течение 30 минут без встряхивания.
   13. Добавьте стоп-решение к каждому колодцу (50 л).
   14. Прочитайте оптическую плотность в каждой скважине микроплиты на уровне 450 нм.
   15. Средний оптической плотности для каждого стандарта, а затем образца и вычесть среднюю оптическую плотность для скважин NSB.
   16. Рассчитайте % bound (B/B0) для всех образцов, используя элементы максимальной связывания (B0).
   17. Создайте стандартную кривую с использованием программного обеспечения, способного к четырехпараметрической логистической регрессионной кривой, рассчитанной по кривой %B/B0.
   18. Умножьте результат на коэффициент разбавления (10), чтобы получить значения кортизола в pg/mL.
   19. Образцы с оптической плотностью, опадание выше высочайшего стандарта, следует дополнительно разбавлять буфером асссеа и повторно асссесифицированы, после чего результат следует умножать на дополнительный коэффициент разбавления.

Рисунок 1 : Пример макета пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

7. Психологическое измерение (Воспринимаемый вопросник стресса)

1. Измерьте психологические уровни испытуемых с помощью ПСЗ, опубликованного Fliege et al.¹³, который включает в себя четыре фактора (беспокойство, напряжение, напряжение, радость) и использует 20 пунктов.
2. Попросите субъекта заполнить PS ' непосредственно перед их рекреационного опыта и сразу же после завершения опыта.
3. Теги анкеты с 3-значным идентификационным номером идентичны биофизиологическому уровню стресса каждого субъекта.

Результаты

Описание образца
Используя метод иную технику отбора квот, в этом исследовании приняли на работу 35 посетителей с каждого из трех участков. В общей сложности в этом исследовании было набрано 105 испытуемых, в том числе 63 мужчины и 42 женщины. Средний возраст посетителей, набранны...

Обсуждение

Цель этого исследования заключается в выявлении потенциальных изменений в стрессе с использованием биофизических и психологических инструментов после посещения рекреационных в трех различных условиях с различными уровнями природы. Как кортизол, так и амилаза, как было показано, явл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cortisol Enzyme Immunoassay Kit	DetectX	K003-H1	The Cortisol Enzyme Immunoassay kit is designed to quantitatively measure cortisol present in dried fecal extracts, saliva, urine, serum, plasma and culture media samples.
Cryogenic Labels for Cryogenic Storage	Fisherbrand	5-910-A	Unique adhesive withstands extreme temperature
Liquid Amylase (CNPG3) Reagent Set	Pointe Scientific	A7564	For the quantitative kinetic determination of α-amylase activity in human serum.
Round Bottom 2mL Polypropylene Tubes with External Thread Cap	Greiner Bio-One	07-000-257	2.0 ml U-BTM Cryo.s self standing polypropylene sterilized
Synergy Multi-Mode Microplate Reader	BioTek		It is a single-channel absorbance, fluorescence, and luminescence microplate reader that uses a dual-optics design to perform measurements of samples in a microplate format.