קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

Summary

פרוטוקול זה מציג כיצד לחיות התמונה ולנתח את meristems apical לירות מכל מיני צמחים שונים באמצעות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר.

Abstract

הפונקציות apical meristem (SAM) לירות כמו מאגר תאי גזע שנשמרת וזה יוצר כמעט לכל רקמות מעל פני הקרקע במהלך הפיתוח postembryonic. פעילותן ואת המורפולוגיה של סאמס לקבוע תכונות אגרונומית חשובים, כגון ארכיטקטורה לירות, הגודל והמספר של איברי הרבייה, וחשוב, התשואה תבואה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח המורפולוגיה השטח והן המבנה התאי פנימי של חיים סאמס ממינים שונים דרך מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר. ההליך כולו משלב הכנת המדגם רכישת תמונות תלת מימד (3D) ברזולוציה גבוהה יכול להתבצע במרחק קצר ככל 20 דקות. נדגים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק התפרחת סאמס של המין מודל, אלא גם את meristems וגטטיבי של גידולים שונים, מתן כלי פשוט אך רב עוצמה כדי ללמוד את הארגון ואת התפתחות meristems על פני מינים שונים.

Introduction

Meristem הצמח מכיל מאגר של תאי גזע מובחן, ברציפות ומקיימת את צימוח איברים ואת פיתוח¹. במהלך הפיתוח postembryonic, כמעט כל רקמות מעל פני הקרקע של צמח נגזרות של meristem apical לירות (SAM). בגידולים, פעילותן ואת גודל את סאם שלה meristems פרחוני נגזר הם קשורים בחוזקה רבים אגרונומית תכונות כגון ארכיטקטורה לירות, פירות ייצור זרע התשואה. לדוגמה, בעגבניה, סאם מוגדל גורמת עלייה הצילומים ואת תפרחת הסתעפות, ולכן התוצאות על מנת לייצר פרח נוסף ופרי איברים². תירס, גידול בגודל סאם מוביל מספר הזרעים גבוה יותר, התשואה הכוללת^3,4. סויה, indeterminacy meristem גם קשורה קשר הדוק עם הארכיטקטורה לירות, תשואה⁵.

מורפולוגיה של האנטומיה של סאמס יכולים להיות מאופיינת במספר שיטות, כולל היסטולוגית חלוקתה/צביעת וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)⁶, אשר שניהם יש קידמה מאוד את המחקר meristem באמצעות מתן תצוגת חתך או מבט תלת מימדי (3D) משטח של סאמס. אולם, שתי השיטות הן זמן רב, מעורבים מספר שלבים ניסיוני משלב הכנת המדגם אל, רכישת נתונים, שיטות אלה תלויים בעיקר מדגמים קבועים. התפתחויות אחרונות סריקת מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקת לייזר היה להתגבר על מגבלות אלה ולספק לנו כלי רב עוצמה כדי לחקור את המבנה התאי ואת התהליך ההתפתחותי של הצמח רקמות ואיברים^7,8. דרך אופטי ולא רקמה גופנית מיקרוסקופ קונפוקלי, אופטים מאפשר את האוסף של סדרה של תמונות z-מחסנית ושיחזור 3D עוקבות של המדגם באמצעות תוכנות ניתוח התמונה.

כאן, אנו מתארים הליך יעיל עבור חוקרים גם בפנים ולשתול משטח מבני המגורים סאמס מ שונים מינים באמצעות סריקת קונפוקלית, אשר פוטנציאל מאפשר לחוקרים לבצע כל את ניסיוני לייזר תהליך בתוך קצר ככל 20 דקות. שונה מכל שיטות נוספות שפורסמו בשידור חי הדמיה קונאפוקלית של תודרנית תפרחת סאמס^{9,10,11,12,13,14, 15} ו תודרנית פרחים^12,13, כאן אנחנו מוכיחים כי פרוטוקול זה הוא יעיל ביותר ללמוד לא רק את תפרחת meristems של המין מודל, אלא גם את הצילומים וגטטיבי meristems apical של גידולים שונים, כגון עגבניות, סויה. בשיטה זו אין להסתמך על סמנים פלורסנט הטרנסגניים ולאחר פוטנציאלי יכול להיות מיושם ללמוד את meristems לירות מתוך שפע מינים שונים של הזנים. בנוסף, אנחנו גם מציגים את התמונה פשוט עיבוד צפייה וניתוח סאמס שונים בתצוגה תלת-ממדית. יחדיו, שיטה פשוטה זו יקל על החוקרים להבין טוב יותר את המבנה ואת תהליך התפתחותי meristems דגם אורגניזמים והן יבולים.

Protocol

1. הכנת מנות מדיה והדמיה

1. MS צלחות: להוסיף 0.5 x Murashige & Skoog MS בינוני, 1% אגר למים יונים ולאחר מכן התאם את ה-pH ל 5.8 שימוש אשלגן הידרוקסידי פתרון (אופציונלי: להוסיף 1% סוכרוז לגידול צמחים לטווח ארוך). אוטוקלב, יציקת פלטות.
2. הדמיה מנות: מילוי פלסטיק צלחות פטרי (6 ס"מ, עומק של 1.5 ס מ) ל- 0.5-0.8 ס מ עם agarose מותכת 1.5%.

2. צימוח

1. תודרנית צמיחה
   1. לזרוע זרעים סטיריליים על MS צלחות והנח הצלחות מתחת לגיל 4 ° C במשך יומיים. לאחר מכן, להעביר צלחות MS יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h), ב 22 מעלות צלזיוס במשך שבועיים.
   2. השתלת השתילים אדמה ולצמוח אותם יום קצר (8 שעות אור / כהה 16 h) ב 22 מעלות צלזיוס במשך ארבעה שבועות.
   3. העברת מפעלים אור רציף, ב 22 ° C כדי לעודד את המעבר מ צמח לבמה הרבייה, הדמיה התפרחת סאמס.
2. גידול עגבניות, סויה
   1. דגירה הזרעים מכוסים נייר סינון רטוב מתחת 28 ° C עד שהם לנבוט.
   2. השתלת השתילים אדמה ואגדל אותם ביום ארוך (16 h אור / כהה 8 שעות) 25 ° c במשך שבוע אחד או יותר עבור הדמיה סאמס וגטטיבי.

3. ניתוח השיא לירות

1. דיסקציה של תפרחת לירות השיא
   1. חותכים את איפקס לירות תפרחת יחד עם 1-2 ס מ גזע ראשי מצמחים תודרנית שהצוקים עם סכין גילוח. . תחזיק את החלק הבזליים של הגזע המרכזי, להסיר איברים פרח בוגרים רבים ככל האפשר מן הגזע הראשי על-ידי לנתח החוצה peduncles עם מלקחיים תכשיטים.
      זהירות: הימנעו חיתוך האצבעות כאשר באמצעות סכין גילוח. השלך סכיני גילוח משומשים לגורם המכיל שרפ ראוי.
   2. להחזיק את הגבעול המצורפת של השיא לירות עם מלקחיים תכשיטים או אצבעות בתחום stereomicroscope, להמשיך בהסרת שאר הפרחים עד כמעט כל סם ניתן להציג את עיניות. הסר peduncles בבירור בצומת של הגזע המרכזי.
2. ניתוח איפקס צמח לירות
   1. כדי להציג סאמס צמח עגבניה או סויה, שווייץ פסיגי הזרע, עלים ושורשים מצמחים.
   2. להחזיק את hypocotyls של הצמחים תחת stereomicroscope ומנתחים נוספת החוצה primordia העלה המכסה סאמס וגטטיבי באמצעות מלקחיים תכשיטים.

4. מכתים

1. כדי להמחיש ישירות בתאים סאמס, להשתמש propidium הטרי יודיד (PI) פתרון כתם קירות התא. לפזר אבקת PI במים סטרילי, יונים, הופך פתרון מכתימים 1 מ"ל PI-הריכוז של 1 מ"ג/מ"ל ולאחסן את הפתרון PI בצינור microcentrifuge מכוסה ברדיד אלומיניום.
2. פיפטה 50 פתרון PI µL בסביבה נקייה ולירות הפטרי ריקים ומטבל כל גזור איפקס לתוך צבע עבור 2 דק שטיפה השיא מוכתם לירות פעמיים במים סטרילי, יונים. במהלך תהליך צביעת, לטבול התפרחת כל סם או סם וגטטיבי בתוך תמיסת PI על מנת להשיג צביעה אחידה.

5. אוסף תמונה

הערה: עבור שיטה זו, כל סאמס הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף ועם 20 x עדשת המים טובלים. כפי שמתואר אחרים פרוטוקולים^9,12,13,15, זה גם ריאלי התמונה סאמס באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. בנוסף, ההדמיה חיה יכולה להיות מושגת באמצעות סוגים שונים של מיקרוסקופ קונפוקלי, עם הפעולות הכנת המדגם. במחקר זה, השלבים הדמיה מתוארים בפירוט כדוגמה.

1. פירס חור במרכז צלחת הדמיה באמצעות מלקחיים, תקע את איפקס לירות מוכתם זקוף המדיום.
2. למלא את הצלחת הדמיה במים סטרילי, יונים לחלוטין לטבול את הדגימה. הצגת מ סטריאו מיקרוסקופ, פיפטה למעלה ולמטה כדי להסיר בועות אוויר לכוד סביב meristem. לאחר מכן, להתאים את הזווית של הגזע ב אגר כדי לוודא כי סאם היא גלויה לגמרי מן ישירות מעל.
3. במקום המנה הדמיה על השלב מדגם של מיקרוסקופ קונפוקלי. להוריד את עדשת המים טובלים ולגדל השלב הדגימה במיקרוסקופ לתת הקצה של מח ש עדשה לתוך המים.
4. פתח את התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי ואתר את סאם, brightfield ב עיניות. להעביר את הזכות דוגמת סם מתחת לעדשה המטרה באמצעות התאמת הבקר XY, ואז להתמקד סאם של עיניות דרך בזהירות התאמת הבקר Z.
5. להפעיל את פונקציית רכישת התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלה של חומרים), התחל לחיות במצב להציג את הדגימה של מסך המחשב, ולהגדיר כל הפרמטרים הלייזר סריקה הניסוי.
   1. בעת כוונון הפרמטרים, להשתמש פונקציה מציינת טווח כדי להגדיר אם האות רווי או לא.
   2. באופן אופציונלי, להחיל הפונקציה חוזר רענן כל הגדרות הפרמטר מקובץ ה-קונפוקלי שנבחרו.
      הערה: הציע הדמיה פרמטרים: לייזר קו (עירור): 515 ננומטר או 561 ננומטר; פליטה 570-650 ננומטר; חריר: 1 יחידה אוורירי (AU); רווח: 600-750, במצב סריקה: מסגרת; מסגרת גודל: 512 X 512 או 1024 X 1024; מהירות סריקה: 7 למקס; סריקה כיוון: כיוונים; חישוב ממוצע רגיל מספר: 2-4; ממוצע של השיטה: מתכוון; עומק סיביות: 16 סיביות; מרווח זמן סריקה: 0.5-1 מיקרומטר. יתרה מזאת, למטב כל הפרמטרים הללו מבוסס על האופי של צמחים שונים ודוגמאות על הצרכים הספציפיים הדמיה.

6. עיבוד תמונה

1. להמחשת אופטי אורתוגונלית וכן רוחבי בסעיף נופים, להשתמש בתוכנה מסחרית זהה לרכישת הדמיה. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט הפעלה אורתוגרפית, בחר האורתופדיה. ואז בחר גם מיקום x, מיקום y ו- z מקמו בתמונה ולשמור את התמונות של קובצי tiff.
   1. לחילופין, בחר פונקציית מרחק תלת-ממד כדי להגדיר את המרחק הפיזי בין שתי נקודות אשר נבחרו מתוך הערימה של תמונות קונפוקלי.
   2. לחלופין, השתמש פיג ' י/תמונה J, חבילת עיבוד התמונה משאבים להמחיש התצוגות סעיף אורתוגונלית ו רוחבי.
   3. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחר את סטאקס ולאחר מכן בחר תצוגות אורתוגונלית.
   4. בחר XY yz ימאהה, מטוסים XZ במצב האמצעי ושמור תמונות בתבנית Tiff.
2. להמחשת שקוף הקרנה 3D, להשתמש בתוכנה זהה.
   1. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי, לחץ על תפריט 3Dובחר שקוף ליצירת תצוגה הקרנה תלת-ממד.
   2. לחלופין לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראהולאחר מכן בחר שקיפות כדי להתאים שלושה פרמטרים של ההקרנה כולל סף, השיפוע המרבי עבור השקיפות של 3D תמונה.
   3. לחץ על תפריט תלת-ממד, בחרו מראה, ובחרו אור כדי לכוונן את הבהירות של התמונה התלת-ממד.
   4. ייצוא תמונות המוקרנת ולשמור אותם של קובצי Tiff.
3. להמחשת העוצמה המקסימלית 3D השלכה, לפתוח את הקבצים קונאפוקלית עם התוכנה באותו ולחץ על התפריט תלת-ממד.
   1. בחר תפריט התלת-ממד ובחרו המרבי.
   2. לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש הקרנה תלת-ממדי העוצמה המקסימלית.
   3. פתח את הקובץ המקורי קונאפוקלית עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה ' ובחר ערימות.
   4. בחר פרוייקט 3D ושמור תמונות בתבנית Tiff.
4. להמחשת העומק קידוד תצוגה של תמונות 3D, להשתמש בתוכנה זהה.
   1. לחץ על תפריט התלת-ממד ובחרו המראה.
   2. בחר מיוחדת ובחר עומק קידוד.
   3. לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את עומק קידוד תצוגה.
   4. לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט ' תמונה ', בחרו Hyperstack.
   5. בחר קוד הטמפורלית-צבע ולשמור תמונות בתבנית Tiff.
      הערה: עומק קידוד z-המחסנית גם יכולה להיות מושגת באמצעות התוסף מחסנית קוד Z לפיג'י.
5. להמחשת 3D סיבוב התצוגה המוצגת (1 סרט , סרט 2), להשתמש בתוכנה זהה (ראה את הטבלה של חומרים).
   1. לפתוח את קבצי וידאו, לחץ על תפריט 3Dובחר סדרות.
   2. בחר רינדור סדרתובחר באחת מהאפשרויות 4 כולל תסתובב x, תסתובב y, ההתחלה והסיוםשל הרשימה מיקום.
   3. שמור את הסדרה רינדור קבצי AVI.
   4. לחלופין, השתמש J פיג ' י/תמונה להמחיש את התצוגה סיבוב תלת-ממד.
   5. פתח את קובץ קונאפוקלית המקורי עם פיג'י, לחץ על תפריט ' תמונה 'ובחר ערימות.
   6. בחר פרוייקט 3D ולשמור כקובץ וידאו בפורמט AVI.

תוצאות

כדי להעריך את היעילות של פרוטוקול שלנו וכדי לחקור את המורפולוגיה של meristems של מינים שונים, ערכנו הניסויים קונאפוקלית הדמיה בשידור חי את meristem תפרחת של תודרנית ו את צמח meristems מ עגבניות וגם סויה. זה מחקר, תודרנית אקוטיפ לנדסברג זקופה, עגבניות לדבורי מיקרו-טום, סו...

Discussion

כאן, אנו מתארים שיטה הדמיה פשוטה שניתן להחיל בחקר לירות apical meristems מצמחים שונים עם מינימאליים, פתיחת שדרה חדש ללמוד ברגולציה meristem בשלבים הן וגטטיבי לבין הרבייה בצמחים מודל ו יבולים. בניגוד SEM ופעולות היסטולוגית מוכתמים, פרוטוקול זה יכול לעזור לחשוף בתצוגת משטח והן מבנים הסלולר פנימי של סאמס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software