Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Özet

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Özet

Sürgün apikal meristem (SAM) işlevleri korunmuş kök hücre rezervuar ve olarak postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular oluşturur. Etkinlik ve SAMs Morfoloji çekim mimarisi, boyutu ve üreme organları ve en önemlisi, tahıl verim sayısı gibi önemli tarımsal özellikleri belirler. Burada, biz yüzey morfolojisi ve iç hücresel yapısı farklı türlerden yaşam SAMs confocal mikroskobu tarama lazer ile analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntüleri edinimi için numune hazırlama üzerinden tüm prosedürü içinde gerçekleştirilebilir 20 dakika gibi kısa. Bu iletişim kuralı sadece önümüzdeki eğitim kuruluşu ve gelişimi için basit ama güçlü bir araç sağlayarak SAMs modeli tür aynı zamanda farklı bitkileri, bitkisel sürgen eğitimi için yüksek verimli olduğunu ispat sürgen farklı bitki türleri arasında.

Giriş

Bitki meristem bir havuzu farklılaşmamış kök hücre içeren ve sürekli olarak bitki organ büyüme ve gelişme¹ayakta tutan. Postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular bir bitkinin sürgün apikal meristem (SAM) türetilir. Bitkileri, etkinlik ve SAM ve onun türetilmiş çiçek sürgen boyutunu sıkıca vur mimarisi, meyve üretimi ve tohum verimi gibi birçok tarımsal özellikleri ile ilişkilidir. Örneğin, domates, ateş ve önümüzdeki dallanma artış ve böylece ilave çiçek ve meyve organları²üreten sonuçlarındaki genişlemiş bir SAM neden olur. Mısır, SAM boyutunda bir artış daha yüksek tohum sayısı ve toplam verim^3,4yol açar. Soya, meristem belirsizlik da ateş mimarisi ile yakından ilişkilidir ve⁵verim.

Morfolojisi ve anatomisi SAMs ikisi de büyük ölçüde sağlayarak meristem araştırma gelişti histolojik kesit/boyama ve elektron mikroskobu (SEM)⁶, tarama dahil olmak üzere birkaç farklı yöntem tarafından karakterize edilebilir kesit görünümü veya üç boyutlu (3D) yüzey görünümü SAMs. Ancak, her iki yöntem de zaman alıcı, veri toplama, numune hazırlama birkaç deneysel adımlar içeren ve bu yöntemleri esas olarak sabit örnekleri üzerinde bağlıdır. Lazer confocal mikroskobu tekniği tarama son gelişmeler bu sınırlamalarının üstesinden gelir ve bizi hücresel yapısı ve bitki doku ve organların^7,8gelişim sürecinin araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Aracılığıyla fiziksel doku yerine optik parça, confocal mikroskobu z-yığın görüntüleri bir dizi ve örnek görüntü analiz yazılımı aracılığıyla sonraki 3D inşası topluluğu sağlar.

Burada, biz içinde her ikisi de soruşturma için verimli bir açıklayınız ve farklı yaşam SAMs yüzey yapıları kullanarak potansiyel olarak araştırmacılar tüm deneysel gerçekleştirmek için sağlar confocal mikroskobu tarama lazer tür bitki süreç içinde 20 dakika gibi kısa. Yayınlanan diğer yöntemleri Arabidopsis önümüzdeki SAMs^{9,10,11,12,13,14canlı confocal görüntüleme için farklı, 15} ve Arabidopsis çiçekler^12,13, burada bu protokolü sadece önümüzdeki sürgen modeli tür aynı zamanda bitkisel ateş çalışmak için son derece verimli olduğunu ispat apikal sürgen domates ve soya gibi farklı bitkileri. Bu yöntem üzerinde transgenik floresan işaretleri dayanmaz ve potansiyel olarak çok farklı türler ve çeşitlerin ateş sürgen çalışmaya uygulanabilir. Buna ek olarak, biz de basit görüntü işleme adımları ve 3D görünümünde farklı SAMs çözümlemeyi tanıtmak. Birlikte ele alındığında, bu basit yöntem araştırmacılar canlılar ve bitkiler sürgen gelişimsel süreci ve yapısını daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Protokol

1. kitle iletişim araçları ve görüntüleme yemekleri hazırlama

1. MS levha: 0.5 x Murashige & Skoog MS orta, % 1 agar deiyonize su ekleyebilir ve ardından pH potasyum hidroksit çözüm kullanarak 5.8 için ayarlayabilirsiniz (isteğe bağlı: uzun vadeli bitki yetiştirme için % 1 Sükroz ekleyin). Basınçlı kap ve dökme levha.
2. Yemekleri görüntüleme: doldurmak plastik Petri yemekler (6 cm genişliğinde, 1.5 cm derinlik) 0.5-0,8 için % 1.5 erimiş özel cm.

2. bitki büyüme

1. Arabidopsis büyüme
   1. MS plakaları sterilize tohumları ekmek ve levha altında 4 ° C iki gündür yerleştirin. Sonra MS plakaları kısa bir güne taşır (8 h ışık / 16 h karanlık), iki hafta boyunca 22 ° c.
   2. Toprak fidan nakli ve onları büyümek kısa bir günde (8 h ışık / 16 h karanlık) 22 ° c dört hafta için.
   3. Bitkiler 22 ° C'de geçiş bitkisel üreme sahneye ve önümüzdeki SAMs görüntüleme için ikna etmek için sürekli ışık aktarın.
2. Domates ve soya büyüme
   1. Onlar çimlenme kadar ıslak filtre kağıdı altında 28 ° C ile kaplı tohum kuluçkaya.
   2. Toprak fidan nakli ve onları büyümek uzun bir günde (16 h ışık / 8 saat karanlık) için bir hafta veya daha uzun bitkisel SAMs görüntüleme için 25 ° c.

3. ateş apex diseksiyon

1. Önümüzdeki ateş apex diseksiyon
   1. Önümüzdeki ateş apex 1-2 cm ana kök cıvatalı Arabidopsis bitkiler bir tıraş bıçağı ile birlikte kesti. Ana kök Bazal bölümünü tutan ve gibi birçok büyük çiçek organlarını mümkün olduğu ana kök peduncles takı Forseps ile anatomi tarafından kaldırın.
      Dikkat: kesme parmak bir tıraş bıçağı kullanırken kaçının. Bir uygun "Sharps" konteyner için kullanılan jilet atmayın.
   2. Ateş apex ekli kök takı forseps veya parmak stereomicroscope alanında tutun, neredeyse bütün SAM-ebilmek var olmak görüş göz mercekleri kadar çiçek kalan kaldırmaya devam etmek. Peduncles ana kök kavşağında açıkça kaldırın.
2. Bitkisel ateş apex diseksiyon
   1. Domates veya soya bitkisel SAMs görüntülemek için cotyledons teşrih bırakır ve kökleri bitkilerden.
   2. Hypocotyls stereomicroscope altında bitkilerin tutun ve daha fazla yaprak takı forseps kullanarak bitkisel SAMs kapsayan primordia incelemek.

4. boyama

1. Doğrudan SAMs hücrelerde görselleştirmek için taze hazırlanmış propidium iyodür (PI) çözüm hücre duvarları leke için kullanın. Steril, deiyonize su PI toz geçiyoruz, 1 mL PI boyama çözüm 1 mg/mL konsantrasyonu olun ve alüminyum folyo ile kaplı microcentrifuge tüp PI çözüm saklayın.
2. 50 µL PI çözümde temiz bir pipet ve boş Petri kabına ve bütün disseke dip tepe 2 dk. durulama için boya içine lekeli ateş apex steril, deiyonize su içinde iki kez ateş. Boyama işlemi sırasında tüm önümüzdeki SAM veya bitkisel SAM Tekdüzen boyama elde etmek için PI çözüm içine bırakın.

5. resim koleksiyonu

Not: Bu yöntem, tüm SAMs yansıma dik bir confocal mikroskop kullanarak için ve bir 20 x su daldırma objektif. Diğer iletişim kuralları^9,12,13,15' te açıklandığı gibi aynı zamanda görüntü ters bir mikroskop kullanarak SAMs uygulanabilirdir. Ayrıca, canlı görüntüleme confocal mikroskoplar, farklı markaların aynı örnek hazırlık adımları ile kullanılarak elde edilebilir. Bu çalışmada, örnek olarak görüntüleme adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

1. Lekeli ateş apex ortamda dik sopa ve forseps kullanarak bir görüntüleme çanak merkezinde bir delik pierce.
2. Görüntüleme çanak tamamen örnek sokmak için steril, deiyonize su ile doldurun. Stereo mikroskop--dan ile ilgilenen, yukarı ve aşağı meristem sıkışmış hava kabarcıkları kaldırmak için pipet. Sonra SAM tamamen üstünde görünür olduğundan emin olmak için agar kök açısını ayarlayın.
3. Görüntüleme çanak confocal mikroskop örnek sahne alanı üzerine yerleştirin. Su daldırma objektif düşürebilir ve objektif DIP suya ucu izin vermek mikroskop örnek aşaması yükseltmek.
4. Açık confocal mikroskop bilgisayar yazılımı ve SAM göz mercekleri içinde aydınlık alan bulun. SAM örnek hemen XY denetleyicisi ayarlama yoluyla objektif lens altında taşıyın ve sonra ihtiyatlı Z denetleyicisi ayarlama yoluyla göz mercekleri SAM'den odaklanmak.
5. Confocal mikroskop bilgisayar yazılımı toplama işlevinde işletmek (bakınız Tablo malzemeler), başlangıç örnek bilgisayar ekranında görüntülemek ve deney tarama lazer için tüm parametreleri ayarlamak için modu yaşamak .
   1. Parametreleri ayarlarken, sinyal ya da değil doymuş tanımlamak için Aralığı göstergesi işlevini kullanın.
   2. İsteğe bağlı olarak, seçili confocal dosyasından tüm parametre ayarlarını yeniden yüklemek için yeniden işlevi uygular.
      Not: parametrelerini görüntüleme önerdi: lazer çizgi (uyarma): 515 nm veya 561 nm; Emisyon 570-650 nm; iğne deliği: 1 havadar adet (AU); Kazanç: 600-750, tarama modu: çerçeve; Çerçeve boyutu: 512 X 512 ya da 1024 X 1024; tarama hızı: 7 Max; Yönde tarama: iki yön; Ortalama sayı: 2-4; Yöntemi ortalama: demek; Bit derinliği: 16 Bit; Tarama aralığı: 0.5-1 µM. Ayrıca, farklı bitki örnekleri ve belirli resim gereksinimleriniz niteliğine göre bu parametreler optimize edin.

6. görüntü işleme

1. Optik dik ve enine bölüm sayısı görüntülenmesi için aynı ticari yazılım görüntü alımı için kullanın. Özgün confocal dosyasını açıp, ortho menüsünü tıklatın, ortho seçin. Sonra her iki x konumunu seçin, y konumu ve z resmin getirin ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydetmek.
   1. İsteğe bağlı olarak confocal görüntüleri yığından seçilen iki nokta arasındaki fiziki mesafeyi tanımlamak için 3D mesafe işlevini seçin.
   2. Alternatif olarak, Fiji/resim J, dik ve enine bölüm sayısı görselleştirmek için açık kaynak görüntü işleme paketi kullanın.
   3. Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünü tıklatın, yığınlar seçip ardından ortogonal sayısı.
   4. XY, YZve XZ uçakları orta pozisyonda seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin.
2. 3D şeffaf projeksiyon görüntülenmesi için aynı yazılımı kullanın.
   1. Özgün confocal dosyasını açıp, 3D menüsünütıklatın ve bir 3D projeksiyon görünümü oluşturmak için saydam ' ı seçin.
   2. İsteğe bağlı olarak 3D menüsünütıklatın, Görünümseçin ve projeksiyon Eşik, rampa ve en büyük 3D şeffaflık için de dahil olmak üzere üç parametreleri ayarlamak için saydamlık seçeneğini belirleyin görüntü.
   3. 3D menüsünütıklatın, görünüm, seçin ve 3D görüntü parlaklığını ayarlamak için ışık ' ı seçin.
   4. Öngörülen görüntüleri dışa aktarmak ve TIFF dosyaları olarak kaydedebilirsiniz.
3. 3D maksimum yoğunluk projeksiyon görselleştiren, açık belgili tanımlık confocal eğe ile aynı yazılım ve 3D menü' yü tıklatın.
   1. 3D menü ve maksimumseçin.
   2. Alternatif olarak, Fiji/resim J 3D maksimum yoğunluk projeksiyon görselleştirmek için kullanın.
   3. Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünü tıklatın ve yığınlarseçin.
   4. 3D proje örneği seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin.
4. 3D görüntü görünümünü kodlama derinlik görüntülenmesi için aynı yazılımı kullanın.
   1. 3D menüsünü tıklatın ve bir görünümseçin.
   2. Özel seçin ve Derinlik kodlamaseçin.
   3. Alternatif olarak, Fiji/resim J görünümü kodlama derinlik görselleştirmek için kullanın.
   4. Açık belgili tanımlık confocal eğe, Görüntü menüsünde' ı tıklatın, Hyperstackseçin.
   5. Temporal-renk kodu seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin.
      Not: Derinlik kodlama z-yığın da eklenti Fiji için Z kod yığını aracılığıyla elde edilebilir.
5. 3D görselleştirme için döndürme görünüm olarakgösterilen (film 1 ve Film 2), kullanmak aynı yazılım ( Tablo reçetesigörmek).
   1. Açık belgili tanımlık confocal eğe, 3D menü' yü tıklatın ve seriyiseçin.
   2. Serisi Renderseçin ve Turn x, y çevirmek, başlangıç ve bitişve pozisyon listeside dahil olmak üzere dört seçenekten birini seçin.
   3. Render serisi AVI dosyaları olarak kaydedin.
   4. Alternatif olarak, Fiji/resim J 3D döndürme görünümü görselleştirmek için kullanın.
   5. Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünütıklatın ve yığınlarseçin.
   6. 3D proje örneği seçin ve AVI formatında videolar kaydedin.

Sonuçlar

Bizim protokolünün etkinliği değerlendirmek ve sürgen morfolojisi farklı türlerden keşfetmek için biz önümüzdeki meristem Arabidopsis --dan ve--dan bitkisel sürgen confocal canlı görüntüleme deneyler gerçekleştirdiyseniz hem domates ve soya. Bu çalışma, Arabidopsis ecotype Landsberg erecta, domates çeşidinde mikro-Tom ve soya çeşidinde Williams 82 örnek olarak kullanılmıştır.

Tartışmalar

Burada, meristem düzenleme modeli bitkiler bitkisel ve üreme aşamalarında eğitim için yeni bir cadde açılış sürgün apikal sürgen çalışma odasına küçük değişiklik, farklı bitkilerle uygulanabilir basit bir görüntüleme yöntemi açıklamak ve bitkileri. SEM ve histolojik boyama yöntemleri aksine, bu protokolü yüzey görünümü ve emek yoğun örnek fiksasyon ve/veya doku adımları kesit için gerek kalmadan SAMs iç Hücresel yapıları ortaya çıkarmak yardımcı olabilir. Bu iletişim kura...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software