다른 식물 종에서 촬영 정점 Meristems의 confocal 라이브 영상

요약

이 프로토콜 라이브 이미지 촬영 정점 meristems 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 다른 식물 종에서 분석 하는 방법을 제공 합니다.

초록

줄기 세포 보존된 저수지와 그것으로 촬영 정점 분열 조직 (SAM) 함수 postembryonic 개발 하는 동안 거의 모든 지상 직물을 생성 합니다. 활동 및 SAMs의 형태학 생식 기관, 그리고 가장 중요 한 것은, 곡물 수확량의 촬영 아키텍처, 크기와 같은 중요 한 농경 특성을 결정합니다. 여기, 우리는 레이저 confocal 현미경 검사를 통해 표면 형태와 다른 종에서 살아있는 SAMs의 내부 세포의 구조를 분석 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 내에서 높은 해상도의 3 차원 (3D) 이미지 수집 샘플 준비에서 모든 절차를 수행할 수 있습니다 짧은 20 분. 이 프로토콜은 고효율 화 서 조직과의 개발을 공부 하는 간단 하지만 강력한 도구를 제공 하는 모델 종 뿐만 아니라 다른 작물에서 식물 meristems의 SAMs 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 다른 식물 종에 걸쳐 meristems입니다.

서문

식물 분열 조직 미 분화 줄기 세포의 수영장을 포함 하 고 지속적으로 격려 하 고 식물의 기관 성장과 개발¹. Postembryonic 개발 하는 동안 식물의 거의 모든 지상 직물은 싹 정점 분열 조직 (SAM)에서 파생 됩니다. 작물, 활동 및 SAM과 그 파생된 꽃 meristems의 크기는 촬영 아키텍처, 과일 생산, 씨 수확량 등 많은 농경 특성 밀접 하 게 연관 된다. 예를 들어 토마토, 확대 샘 하면 촬영 및 꽃이 핌 분기, 증가 하 고 따라서 여분의 꽃 및 과일 장기²생성 결과. 옥수수에서 SAM 크기 증가 더 높은 씨 수 및 총 수익률^3,4이끌어 낸다. 콩, 분열 조직 불확정성 촬영 아키텍처에 밀접 하 게 연관 이며 또한⁵항복.

형태학 및 SAMs의 여러 가지 방법으로, 조직학 단면/얼룩 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)⁶를 포함 하 여 둘 다 크게 제공을 통해 분열 조직 연구 고급 나타낼 수 있다 중 단면 보기 또는 SAMs의 3 차원 (3D) 표면 보기. 그러나, 두 방법 모두 시간이 걸리고, 데이터 수집, 샘플 준비에서 몇 가지 실험 단계를 포함 되며 이러한 메서드는 주로 고정된 샘플에 따라 달라 집니다. 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 기술에서에서의 최근 발전 이러한 한계를 극복 하 고 세포의 구조 및 식물 조직 및 장기^7,8의 발달 과정을 조사 하는 강력한 도구를 제공. 통해 물리적 조직 보다 광 단면, confocal 현미경 검사 법 수 수 일련의 z-스택 이미지 및 이미지 분석 소프트웨어를 통해 샘플의 후속 3D 재구성의 컬렉션.

여기, 우리 둘 다 내부 조사에 대 한 효율적인 절차에 설명 하 고 다른 생활 SAMs의 표면 구조 식물 종 레이저 confocal 현미경 검사 법, 잠재적으로 모든 실험을 수행 하는 연구를 수 있는 스캔을 사용 하 여 프로세스 내에서 20 분으로 짧은. 애기 꽃이 핌 SAMs^{9,10,11,12,,1314의 라이브 confocal 영상에 대 한 다른 게시 된 방법에서 다른 15} 와 애기 꽃^12,13, 여기이 프로토콜은 매우 효율적인 모델 종 뿐만 아니라 식물 촬영의 꽃이 핌 meristems 뿐만 아니라 공부에 대 한 설명 토마토, 콩 등 다른 작물에서 정점 meristems. 이 방법은 유전자 변형 형광 표식에 의존 하지 않는 하 고 잠재적으로 많은 다른 종 및 재배 품 정에서 촬영 meristems 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 간단한 이미지 보기 및 3D 뷰에서 다른 SAMs를 분석 하기 위한 단계를 처리 소개 합니다. 함께 찍은,이 간단한 방법을 더 나은 구조와 모형 유기 체 및 작물에서 meristems의 발달 과정을 이해 하는 연구를 촉진 한다.

프로토콜

1. 미디어와 이미징 요리 준비

1. MS 판: 이온된 물으로 重 & Skoog MS 중간, 1% 천 x 0.5를 추가 하 고 다음 pH 5.8 수산화 칼륨 솔루션을 사용 하 여를 조정 (선택 사항: 장기 식물 성장에 대 한 1% 자당을 추가). 오토 클레이 브 및 부 접시입니다.
2. 요리를 이미징: 0.5-0.8을 플라스틱 페 트리 접시 (6 c m, 깊이 1.5 c m)를 채우기 1.5% 녹은 agarose와 cm.

2. 식물 성장

1. 애기 성장
   1. MS 판에 소독된 씨앗을 뿌리 다 고 2 일에 대 한 접시 4 ° C이 하를 배치 합니다. 그런 다음 짧은 데 MS 판 이동 (8 h 빛 / 어둠 16 h), 2 주 동안 22 ° C에서.
   2. 토양에 모 종을 이식 하 고 짧은 하루에 그들을 성장 (8 h 빛 / 어둠 16 h) 4 주 동안 22 ° C에서.
   3. 식물 생식 단계 및 꽃이 핌 SAMs 이미징는 식물에서 전환 유도에 22 ° C에서 연속 빛을 전송 합니다.
2. 토마토와 콩 성장
   1. 그들은 발 아까지 젖은 필터 종이 28 ° C 미만으로 덮여 씨앗을 품 어.
   2. 토양에 모 종을 이식 하 고 긴 하루에 그들을 성장 (16 h 빛 / 8 h 어두운) 식물 SAMs 이미징에 대 한 1 주일 이상 25 ° C에서.

3입니다. 촬영 꼭대기의 해 부

1. 화 서 촬영 꼭대기의 해 부
   1. 면도날으로 볼트 애기 식물에서 1-2 cm 주요 줄기와 함께 꽃이 핌 촬영 꼭대기를 잘라. 주요 줄기의 기저 부분 누른 보석 집게와는 peduncles 개 해 부에 의해 주요 줄기에서 가능한 많은 더 오래 된 꽃 장기를 제거 합니다.
      주의: 면도날을 사용 하 여 절단 손가락을 피하십시오. 적절 한 sharps의 컨테이너를 사용된 하는 면도날의 처분.
   2. 보석 포 셉 또는 분야는 stereomicroscope의 손가락 촬영 꼭대기의 연결 된 줄기를 잡고, 꽃의 나머지 부분을 제거 하는 거의 전체 SAM는 접 안경에서 볼 수 있습니다 때까지 계속. 주요 줄기의 교차점에서 명확 하 게 peduncles 제거 합니다.
2. 식물 촬영 꼭대기의 해 부
   1. 토마토 또는 콩 식물 SAMs를 보려면 cotyledons, 밖으로 해 부, 및 식물에서 뿌리.
   2. 아래는 stereomicroscope 식물의 hypocotyls 고 추가 취재 보석 집게를 사용 하 여 식물 SAMs 잎 primordia 밖으로 해 부.

4. 얼룩

1. SAMs에 세포를 직접 시각화 하려면 갓된 propidium 요오드 화물 (PI) 솔루션을 사용 하 여 세포 벽 얼룩. 살 균 이온에 PI 분말 분해, 1 mL PI 얼룩 솔루션 1 mg/mL의 농도에서 만들고 알루미늄 호 일로 덮여 microcentrifuge 관에서 PI 솔루션을 저장.
2. 50 µ L PI 솔루션에서 깨끗 한 플라스틱 하 고 빈 페 트리 접시와 딥 전체 해 부 촬영 정점 2 분 린스에 대 한 염료로 얼룩진된 촬영 정점 살 균, 이온을 제거 된 물에 두 번. 착 색 과정은 전체 화 서 샘 또는 식물 샘 균일 한 얼룩을 달성 하기 위해 PI 솔루션에 젖어.

5. 이미지 모음

물 담그고 렌즈 x 20는 SAMs는 똑바로 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 모두이 방법에 대 한 참고:와. 다른 프로토콜^9,12,,1315에 설명 된 대로 그것은 또한 가능한 이미지 SAMs는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여. 또한, 라이브 영상 같은 샘플 준비 단계 confocal 현미경의 다른 브랜드를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 이 연구에서 이미징 단계 예를 들어 자세히 설명 합니다.

1. 집게를 사용 하 여 이미징 접시의 중앙에 구멍을 뚫 고 매체에 얼룩진된 촬영 꼭대기를 직 립 스틱.
2. 샘플을 완전히 몰입할 수 살 균, 이온을 제거 된 물으로 이미징 접시를 채우십시오. 스테레오 현미경에서 보기, 피 펫 여기저기 기포를 제거 하는 분열 조직 주위 갇혀. 그런 다음, 샘 바로 위에 완벽 하 게 볼 수 있는지 확인 한 천에서 줄기의 각도 조정 합니다.
3. 공초점 현미경의 샘플 단계에 이미징 접시를 놓습니다. 낮은 물 찍기 렌즈 하며 현미경 샘플 단 물으로 렌즈 딥의 팁을 하도록 합니다.
4. 공초점 현미경 소프트웨어 열고는 접 안경에 명시에는 샘을 찾습니다. XY 컨트롤러 조정 통해 대물 렌즈 아래 샘 샘플 오른쪽 이동 후 Z 컨트롤러를 조심 스럽게 조정 통해 접 안경에서 샘에 초점.
5. 공초점 현미경 소프트웨어에 인수 함수 작동는 라이브 모드 컴퓨터 화면에서 샘플을 확인 하 고 실험을 스캔 하는 레이저에 대 한 모든 매개 변수를 설정 하는 ( 테이블의 자료참조) 시작.
   1. 매개 변수를 조정할 때는 범위 표시기 기능을 사용 하 여 신호 포화 여부를 정의 하.
   2. 필요에 따라 선택한 confocal 파일에서 모든 매개 변수 설정을 다시 로드 하려면 다시 사용할 함수를 적용 합니다.
      참고: 매개 변수를 이미징 제안: 선 (여기) 레이저: 515 nm 또는 561 nm; 방출 570-650 nm; 홀: 1 공기 단위 (AU); 이득: 600-750, 스캔 모드: 프레임; 프레임 크기: 512 X 512 또는 1024 X 1024; 스캔 속도: 최대; 7 검색 방향: 양방향-방향; 평균 번호: 2-4; 평균 방법: 의미; 비트 깊이: 16 비트; 스캔 간격: 0.5-1 µ M. 또한, 다른 식물 샘플 및 특정 이미징 요구의 성격에 따라 이러한 모든 매개이 변수를 최적화 합니다.

6. 이미지 처리

1. 광학 직교 및 가로 섹션 보기 시각화, 영상 획득에 대 한 같은 상용 소프트웨어를 사용 합니다. 원래 confocal 파일을 열고, 수직 메뉴 클릭, 직교 선택. 다음 선택 중 하나 x 위치, y 위치 및 z 이미지의 위치 이미지를 tiff 파일로 저장.
   1. 3D 거리 함수 스택에서 공초점 이미지의 선정 된 두 점 사이의 실제 거리를 정의를 선택 합니다.
   2. 또는 피지/이미지 J, 직교 및 가로 섹션 보기를 시각화 하기 위해 오픈 리소스 이미지 처리 패키지를 사용 하 여.
   3. 피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴를 클릭, 스택 선택한 다음 직교 보기를 선택 하십시오.
   4. 중간 위치에 XY, YZ, 및 XZ 평면을 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장.
2. 3D 투명 한 투영을 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어를 사용 합니다.
   1. 원래 confocal 파일, 3D 메뉴를 클릭 열고 선택 투명 3D 투영 뷰를 생성 하.
   2. 필요에 따라 3D 메뉴를 클릭, 모양을 선택한 후 투명도 임계값, 램프 및 최대 를 포함 하 여 3D의 투명성에 대 한 투영의 3 개의 매개 변수를 조정 이미지입니다.
   3. 3D 메뉴 모양, 선택한 빛 3D 이미지의 밝기를 조정 하려면 선택 합니다.
   4. 영사 된 이미지를 내보내고 Tiff 파일로 그들을 저장.
3. 3 차원 최대 강도 프로젝션, 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어와 함께 confocal 파일을 열고 3D 메뉴를 클릭 합니다.
   1. 3D 메뉴 를 선택 하 고 최대선택 하십시오.
   2. 또는 피지/이미지 J를 사용 하 여 3D 최대 강도 투영을 시각화.
   3. 피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴 를 클릭 하 고 스택을 선택 합니다.
   4. 3D 프로젝트 를 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장 합니다.
4. 3D 이미지의 보기를 코딩 하는 깊이 시각화에 대 한 동일한 소프트웨어를 사용 합니다.
   1. 3D 메뉴 를 클릭 하 고 선택 하는 모습.
   2. 특별 한 선택 하 고 깊이 코딩.
   3. 또는 피지/이미지 J을 사용 하 여 보기를 코딩 하는 깊이 시각화.
   4. 오픈 confocal 파일, 클릭 이미지 메뉴 Hyperstack선택합니다.
   5. 측 색 코드 를 선택 하 고 이미지를 Tiff 형식으로 저장.
      참고: 깊이 코딩 z-스택 또한 얻을 수 있습니다 플러그인 Z 코드 스택 피지를 통해.
5. 3D 시각화 표시 (영화 1 및 영화 2), 회전 보기 동일한 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조).
   1. Confocal 파일을 열고, 3D 메뉴를 클릭 하 고 시리즈를 선택 합니다.
   2. 렌더링 시리즈를선택 하 고 x, y를 돌아서, 시작과 끝, 그리고 돌아서 위치 목록을 포함 하 여 4 개의 옵션 중 하나를 선택 합니다.
   3. AVI 파일로 렌더링 시리즈를 저장 합니다.
   4. 또는 피지/이미지 J를 사용 하 여 3D 회전 보기 시각화.
   5. 피지와 원래 confocal 파일을 열고, 이미지 메뉴를 클릭 하 고 스택을 선택 합니다.
   6. 3D 프로젝트 를 선택 하 고 AVI 포맷 비디오로 저장.

결과

우리의 프로토콜의 효율성을 평가 하 고 하 여는 meristems의 형태를 다른 종, 우리 애기 에서 화 서 분열 조직에서 식물 meristems에 confocal 라이브 이미징 실험을 수행 했습니다. 둘 다 토마토와 콩입니다. 이 연구, 애기 ecotype 란 츠 베르크 erecta, 토마토 품종 마이크로 톰, 콩 품종에서 윌리엄스 82 예제로 사용 되었습니다.

토론

여기, 우리가 설명 사소한 수정, 다른 식물에서 촬영 정점 meristems의 연구에 적용할 수 있는 간단한 이미징 방법 모델 식물에서 식물 및 생식 단계에서 분열 조직 규칙을 공부 하는 새로운 길을 열기와 작물입니다. 현미경 및 조직학 얼룩 방법을 달리이 프로토콜 표면 보기와 노동 집약적인 샘플 고정 및/또는 단계를 구분 하는 조직에 대 한 필요 없이 SAMs의 내부 세포 구조를 공개 도울 수 있다. 이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software