Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

Résumé

Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Résumé

Les fonctions de méristème apical (SAM) pousse comme un réservoir des cellules souches conservées et il génère presque tous les tissus hors sol pendant le développement post-embryonnaire. L’activité et la morphologie des SAMs déterminent des caractéristiques agronomiques importants, tels que l’architecture de shoot, taille et nombre d’organes reproducteurs et surtout, le rendement en grain. Ici, nous fournissons un protocole détaillé permettant d’analyser aussi bien la morphologie de la surface et la structure cellulaire interne du vivant SAMs provenant de différentes espèces par le biais de microscope confocal à balayage laser. Tout le processus depuis la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images de haute résolution en trois dimensions (3D) peut être accompli au sein aussi court que 20 minutes. Nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement l’inflorescence SAMs de l’espèce modèle, mais aussi les méristèmes végétatives de différentes cultures, fournissant un outil simple mais puissant pour étudier l’organisation et le développement de méristèmes dans différentes espèces de plantes.

Introduction

Le méristème de la plante contient un réservoir de cellules souches indifférenciées et maintient en permanence la croissance des organes végétaux et développement¹. Pendant le développement post-embryonnaire, presque tous les tissus hors sol d’une plante sont dérivés de méristème apical (SAM). Dans les cultures, l’activité et la taille de la SAM et ses dérivées méristèmes floraux sont étroitement associées aux nombreuses caractéristiques agronomiques telles que shoot architecture, production de fruits et rendement en graines. Par exemple, chez la tomate, un SAM élargi entraîne une augmentation de la pousse et l’inflorescence ramification et donc des résultats dans la production d’appoint fleurs et fruits organes². Chez le maïs, une augmentation de taille de SAM mène à un plus grand nombre de graines et le rendement total^3,4. Chez le soja, l’indétermination de méristème est également étroitement associée à l’architecture de shoot et rendement⁵.

La morphologie et l’anatomie de SAMs peuvent être caractérisés par plusieurs méthodes différentes, y compris la coupe/coloration histologique et le scanning electron microscopy (SEM)⁶, qui ont grandement contribué à améliorer la recherche de méristème en fournissant la vue en coupe ou une vue de surface tridimensionnelle (3D) de SAMs. Toutefois, les deux méthodes prennent beaucoup de temps, impliquant plusieurs étapes expérimentales de la préparation de l’échantillon à l’acquisition de données, et ces méthodes dépendent principalement des échantillons fixes. Les progrès récents en microscopie confocale à balayage laser ont réussi à surmonter ces limitations et nous fournissent un outil puissant pour étudier la structure cellulaire et les processus de développement de l’usine tissus et organes^7,8. Par optique plutôt que le tissu physique sectionnement, confocale microscopie permet la collecte d’une série d’images de z-pile et la reconstruction 3D subséquente de l’échantillon par le biais de logiciels d’analyse image.

Ici, nous décrivons une procédure efficace pour étudier à l’intérieur et des structures superficielles des vivants SAMs de différents plant des essences à l’aide de laser, microscopie confocale, qui potentiellement permet aux chercheurs d’accomplir tous les expérimentale processus au sein aussi court que 20 minutes. Différente des autres méthodes publiées pour l’imagerie confocale direct d’Arabidopsis inflorescence SAMs^{9,10,11,12,13,14, 15} et Arabidopsis fleurs^12,13, nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement les méristèmes d’inflorescence de l’espèce modèle mais aussi de la pousse végétative méristèmes apicaux de différentes cultures, telles que la tomate et le soja. Cette méthode ne repose pas sur des marqueurs fluorescents transgéniques et peut potentiellement être appliquée afin d’étudier les méristèmes de beaucoup de différentes espèces et cultivars. En outre, nous présentons également l’étapes permettant d’afficher et d’analyser les différentes SAMs dans une vue 3D de traitement d’image simple. Pris ensemble, cette méthode simple facilitera les chercheurs à mieux comprendre la structure et le processus de développement des méristèmes d’organismes modèles et des récoltes.

Protocole

1. préparation de plats médias et imagerie

1. Plaques de MS : ajouter 0,5 x milieu de Murashige et Skoog MS moyen, 1 % d’agar dans l’eau désionisée et ensuite ajuster le pH de 5,8 à l’aide de la solution d’hydroxyde de potassium (facultatif : ajouter 1 % de saccharose pour la culture de plantes à long terme). Plaques d’autoclave et verser.
2. Imagerie des plats : remplir des boîtes de pétri en plastique (6 cm de large, 1,5 cm de profondeur) de 0,5 à 0,8 cm avec 1,5 % agarose fondu.

2. croissance de la plante

1. Croissance d’Arabidopsis
   1. Semer les graines stérilisées sur plaques de MS et placer les plaques sous 4 ° C pendant deux jours. Déplacez-vous MS plaques pour une courte journée (8 h lumière / 16 h d’obscurité), à 22 ° C pendant deux semaines.
   2. Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une journée courte (8 h lumière / 16 h d’obscurité) à 22 ° C pendant quatre semaines.
   3. Transférer les plantes de lumière continue, à 22 ° C pour induire le passage de la végétative à la phase de reproduction et d’imagerie de l’inflorescence SAMs.
2. Croissance de tomate et de soja
   1. Incuber les graines recouvertes de papier filtre mouillé en dessous de 28 ° C jusqu'à ce qu’elles germent.
   2. Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une longue journée (16 h lumière / obscurité de 8 h) à 25 ° C pendant une semaine ou plus pour l’imagerie des SAMs végétatives.

3. dissection de l’apex caulinaire

1. Dissection de l’apex caulinaire inflorescence
   1. Couper l’apex inflorescence avec tige principale 1-2 cm de la plante Arabidopsis boulonnée avec une lame de rasoir. Tenez la partie basale de la tige principale et prélever des organes de fleur anciennes autant que possible de la tige principale en disséquant sur le pédoncule avec une pince de bijoux.
      Attention : Évitez les doigts coupe lorsque vous utilisez une lame de rasoir. Jeter les lames de rasoir usagées contenant un bon pour objets tranchants.
   2. Tenir la tige attachée de l’apex de la tige avec une pince de bijoux ou de doigts dans le domaine de la stéréomicroscope, continuer à retirer le reste des fleurs jusqu'à ce que presque l’ensemble SAM peut considérer des oculaires. Retirez les pédoncules clairement à la jonction de la tige principale.
2. Dissection de l’apex de la pousse végétative
   1. Pour afficher les SAMs végétatives de tomate ou de soja, disséquer les cotylédons, les feuilles et les racines des plantes.
   2. Tenez l’hypocotyle des plantes sous le stéréomicroscope et disséquer davantage sur les primordiums foliaires couvrant les SAMs végétatives à l’aide de pinces à bijoux.

4. coloration

1. Pour visualiser directement les cellules dans Sam, utilisez fraîchement préparé propidium solution d’iodure (PI) pour colorer les parois cellulaires. Dissoudre la poudre dans l’eau désionisée stérile PI, faire la solution colorante 1mL PI à la concentration de 1 mg/mL et stocker la solution de PI en tubes de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium.
2. Pipetter 50 µL de solution de PI dans un endroit propre et vide de Pétri et trempette toute disséqué shoot apex en colorant pendant 2 min. rincer l’apex colorés deux fois dans l’eau désionisée stérile. Pendant le processus de coloration, immergez l’inflorescence entière SAM ou SAM végétatif dans la solution de PI pour réaliser la coloration uniforme.

5. collection d’images

Remarque : pour cette méthode, tous les Sam sont imagées à l’aide d’un microscope confocal vertical et avec un 20 x lentille de pendage vers l’eau. Comme décrit dans d’autres protocoles^9,12,13,15, il est également possible de l’image à l’aide d’un microscope inversé de SAMs. En outre, l’imagerie direct est possible à l’aide de différentes marques de microscopes confocaux, avec les mêmes étapes de préparation d’échantillon. Dans cette étude, les étapes d’imagerie sont décrites en détail à titre d’exemple.

1. Percer un trou au centre d’un plat d’imagerie avec une pincette et coller l’apex caulinaire colorées dressées dans le milieu.
2. Remplissez le plat d’imagerie d’eau déionisée stérile afin d’immerger complètement l’échantillon. Visualisation du microscope stéréo, pipette de haut en bas pour enlever les bulles d’air piégées autour du méristème. Ensuite, réglez l’angle de la tige dans la gélose pour s’assurer que le SAM est entièrement visible de directement au-dessus.
3. Placez le plat d’imagerie sur la scène de l’échantillon du microscope confocal. Lentille d’eau à pendage et descendre la platine du microscope échantillon pour laisser l’extrémité de la lentille tremper dans l’eau.
4. Ouvrez le logiciel de microscope confocal et recherchez le SAM dans le fond clair dans les oculaires. Déplacer la SAM échantillon droite au-dessous de l’objectif en ajustant le contrôleur XY, puis se concentrer sur la SAM d’oculaires en ajustant avec prudence le contrôleur Z.
5. Activer la fonction de l’acquisition du logiciel de microscope confocal (voir Table des matières), démarrer le mode direct pour afficher l’exemple de l’écran d’ordinateur et configurer tous les paramètres de l’expérience de balayage au laser.
   1. Lors du réglage des paramètres, utilisez Gamme indicateur fonction pour définir si le signal est saturé ou non.
   2. Éventuellement, appliquez la fonction réutiliser pour recharger tous les paramètres depuis le fichier sélectionné confocal.
      NOTE : A suggéré d’imagerie paramètres : Laser ligne (excitation) : 515 nm ou 561 nm ; Émission 570-650 nm ; sténopé : 1 unité aérée (UA) ; Gain : 600-750, mode de numérisation : encadrer ; Taille d’image : 512 X 512 ou 1024 X 1024 ; vitesse de numérisation : du 7 au Max ; Direction de numérisation : bidirectionnelle ; Numéro de l’établissement d’une moyenne : 2-4 ; Avec une moyenne de méthode : moyenne ; Profondeur de couleur : 16 bits ; Intervalle de balayage : 0,5 à 1 µM. De plus, optimiser tous ces paramètres selon la nature des échantillons de plantes différentes et aux besoins spécifiques d’imagerie.

6. traitement de l’image

1. Pour visualiser les vues de coupe transversale et orthogonales optique, utilisez le même logiciel commercial pour l’acquisition d’imagerie. Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu ortho, sélectionnez ortho. Puis sélectionnez soit la position x, z et y position position de l’image et enregistrer les images que les fichiers tiff.
   1. Éventuellement, sélectionnez distance 3D fonction pour définir la distance physique entre deux points qui ont été sélectionnés par la cheminée de l’images confocales.
   2. Vous pouvez également utiliser Fidji/Image J, le paquet de traitement image ressource ouverte pour visualiser les vues de la section transversale et orthogonales.
   3. Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu image, sélectionnez piles et puis sélectionnez vues orthogonales.
   4. Sélectionnez XY, YZet XZ avions en position médiane et enregistrez sous les images au format Tiff.
2. Pour visualiser une projection 3D transparente, utilisez le même logiciel.
   1. Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez Transparent pour générer une vue de projection 3D.
   2. Éventuellement, cliquez sur menu 3D, sélectionnez apparenceet sélectionnez transparence pour ajuster les trois paramètres de la projection dont seuil, rampe et Maximum pour la transparence de la 3D image.
   3. Cliquez sur le menu 3D, sélectionnez apparence, puis lumière pour régler la luminosité de l’image 3D.
   4. Exporter les images projetées et les enregistrer comme des fichiers Tiff.
3. Pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale, ouvrez les fichiers confocal avec le même logiciel et cliquez sur le menu 3D.
   1. Sélectionnez le menu 3D et maximale.
   2. Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale.
   3. Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Image et sélectionnez piles.
   4. Sélectionnez le projet 3D et enregistrez sous les images au format Tiff.
4. Pour la visualisation de la profondeur de codage d’afficher des images 3D, utilisez le même logiciel.
   1. Cliquez sur le menu 3D , puis sélectionnez apparence.
   2. Sélectionnez spécial , puis sélectionnez la Profondeur de codage.
   3. Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la profondeur vue de codage.
   4. Ouvrez les fichiers confocale, cliquez sur le menu image, sélectionnez Hyperstack.
   5. Sélectionnez le code temporel-couleur et enregistrer en tant que des images au format Tiff.
      NOTE : La profondeur de codage z-pile aussi est possible via le plugin Z Code Stack pour Fidji.
5. Pour visualiser la 3D rotation vue tel qu’indiqué (film 1 et 2 de film), utiliser le même logiciel (voir la Table des matières).
   1. Ouvrir les fichiers confocale, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez série.
   2. Sélectionnez rendu sérieet sélectionnez l’une des quatre options notamment tourner autour de x, y faire demi-tour, début et finet liste Position.
   3. Enregistrer la série de rendu que les fichiers AVI.
   4. Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la vue 3D rotation.
   5. Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Imageet sélectionnez Stacks.
   6. Sélectionnez le projet 3D et enregistrer des vidéos au format AVI.

Résultats

Pour évaluer l’efficacité de notre protocole et d’étudier la morphologie des méristèmes de différentes espèces, nous avons effectué des expériences d’imagerie confocale direct sur le méristème de l’inflorescence de l’Arabidopsis et les méristèmes végétatives de tomate et soja. Dans cette étude, Arabidopsis écotype Landsberg erecta, cultivar de tomate Micro-Tom et le cultivar de soja Williams 82 ont été utilisés comme exemples.

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Discussion

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie simple qui peut être appliquée à l’étude des méristèmes apicaux de différentes plantes avec une modification mineure, ouvrant une nouvelle voie pour étudier la régulation de méristème à des stades végétatifs et reproducteurs de plantes modèles et cultures. Contrairement à la SEM et les méthodes de coloration histologiques, ce protocole peut aider à révéler la surface vue tant les structures cellulaires internes des SAMs, sans la nécessité d’une fixat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software