Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante

Riepilogo

Questo protocollo presenta come immagine live e analizzare i meristemi apicali di sparare da specie diverse di piante mediante microscopia confocale a scansione laser.

Abstract

Le funzioni del meristema apicale (SAM) di sparare come un serbatoio di cellule staminali conservate ed esso genera aboveground quasi tutti i tessuti durante lo sviluppo postembrionale. L'attività e la morfologia dei Mas determinare importanti caratteristiche agronomiche, quali sparare architettura, dimensioni e numero di organi riproduttivi e soprattutto, la produzione di granella. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per analizzare sia la morfologia superficiale e la struttura cellulare interna del vivente SAMs da specie diverse attraverso il microscopio confocale a scansione laser. L'intera procedura dalla preparazione del campione per l'acquisizione di immagini tridimensionali ad alta risoluzione (3D) può essere eseguita entro 20 minuti più breve. Dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo l'infiorescenza SAMs delle specie modello ma anche meristemi vegetativi da colture diverse, fornendo uno strumento semplice ma potente per studiare l'organizzazione e lo sviluppo di Meristemi attraverso diverse specie vegetali.

Introduzione

Il meristema pianta contiene un pool di cellule staminali indifferenziate e continuamente sostiene la crescita delle piante dell'organo e sviluppo¹. Durante lo sviluppo postembrionale, quasi tutti i tessuti fuori terra di un impianto sono derivati da sparare meristema apicale (SAM). Nelle colture, l'attività e la dimensione del database SAM e sua derivati meristemi floreali sono strettamente associati con molte caratteristiche agronomiche come sparare architettura, produzione di frutta e il rendimento della semente. Ad esempio, nel pomodoro, una SAM allargato causa un aumento le riprese e la ramificazione di infiorescenza e così risultati nel generare extra fiore e frutta organi². Nel mais, un aumento nella dimensione di SAM conduce ad un più alto numero di inizializzazione e la resa totale^3,4. Nella soia, l'indeterminatezza del meristema è anche strettamente associato con l'architettura di sparare e resa⁵.

La morfologia e l'anatomia dei Mas può essere caratterizzate da diversi metodi, tra cui sezionamento/colorazione istologica e scansione microscopia elettronica (SEM)⁶, entrambi i quali notevolmente hanno avanzato la ricerca di meristema fornendo la vista in sezione o una vista tridimensionale (3D) superficie SAMs. Tuttavia, entrambi i metodi sono molto tempo, che coinvolge diversi passaggi sperimentale dalla preparazione del campione per l'acquisizione di dati, e questi metodi dipendono principalmente da campioni fissati. Gli avanzamenti recenti nella tecnica di microscopia confocale a scansione laser hanno superato questi limiti e ci forniscono un potente strumento per indagare la struttura cellulare e il processo di sviluppo di pianta tessuti e organi^7,8. Attraverso ottico piuttosto che fisico tessuto microscopia confocale, sezionamento consente la raccolta di una serie di immagini dello stack z e le successive ricostruzioni 3D del campione attraverso software di analisi di immagine.

Qui, descriviamo una procedura efficace per indagare sia all'interno e strutture superficiali del vivente SAMs da diverse piante mediante microscopia confocale, che potenzialmente permette ai ricercatori di compiere la sperimentale di scansione laser processo all'interno di più breve 20 minuti. Diverso da altri metodi pubblicati per live imaging confocale di Arabidopsis infiorescenza SAMs^{9,10,11,12,13,14, 15} e Arabidopsis fiori^12,13, Qui dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo i meristemi infiorescenza delle specie modello, ma anche la ripresa vegetativa Meristemi apicali da diverse colture, come il pomodoro e soia. Questo metodo non si basa su marcatori fluorescenti transgenici e potenzialmente può essere applicato per studiare i meristemi sparare da molte diverse specie e cultivar. Inoltre, presentiamo anche passaggi per visualizzare e analizzare diverse SAMs in una vista 3D di elaborazione delle immagini semplici. Presi insieme, questo semplice metodo faciliterà i ricercatori a comprendere meglio la struttura e il processo di sviluppo di meristemi da organismi modello e colture.

Protocollo

1. preparazione di piatti Media e imaging

1. MS Piastre: aggiungere 0,5 x Murashige & Skoog MS medi, 1% agar in acqua deionizzata e poi regolare il pH a 5,8 utilizzando la soluzione di idrossido di potassio (facoltativo: aggiungere 1% di saccarosio per la coltivazione di piante a lungo termine). Piastre di autoclave e versare.
2. Piatti di imaging: riempire di plastica di Petri (6 cm di larghezza, profondità 1,5 cm) a 0,5-0,8 cm con 1,5% di agarosio fuso.

2. pianta crescita

1. Crescita di Arabidopsis
   1. Seminare i semi sterilizzati sulle piastre di MS e posizionare le piastre inferiori a 4 ° C per due giorni. Quindi, spostare MS Piastre un giorno breve (8 h luce / 16h scuro), a 22 ° C per due settimane.
   2. Trapiantare le piantine al suolo e farli crescere in una giornata breve (8 h luce / 16h scuro) a 22 ° C per quattro settimane.
   3. Trasferire gli impianti a luce continua, a 22 ° C per indurre la transizione dalla vegetativa alla fase riproduttiva e per l'infiorescenza SAMs di imaging.
2. Crescita del pomodoro e della soia
   1. Incubare i semi coperti con carta da filtro bagnata sotto 28 ° C, finche ' non germinano.
   2. Trapiantare le piantine al suolo e farli crescere in una lunga giornata (16 h luce / buio 8h) a 25 ° C per una settimana o più per il SAMs vegetativo di imaging.

3. dissezione dell'apice del germoglio

1. Dissezione dell'apice sparare infiorescenza
   1. Tagliare l'apice di sparare infiorescenza insieme con il gambo principale 1-2 cm dalle piante di Arabidopsis imbullonate con una lama di rasoio. Tenere la parte basale del fusto principale e togliere come molti più vecchi organi di fiore come possibile dal gambo principale dissecando fuori i peduncoli con il forcipe di gioielli.
      Attenzione: Evitare le dita di taglio quando si utilizza una lama di rasoio. Smaltire l'usate lame di rasoio per una corretta dei taglienti.
   2. Tenere il gambo allegato dell'apex sparare con gioielli forcipe o le dita nel campo dello stereomicroscopio, continuare a rimuovere il resto dei fiori fino a quasi l'intera SAM può essere vista dagli oculari. Rimuovere i peduncoli chiaramente alla giunzione del gambo principale.
2. Dissezione dell'apice vegetativo sparare
   1. Per visualizzare il SAMs vegetativo da pomodoro o soia, sezionare i cotiledoni, foglie e radici delle piante.
   2. Tenere gli ipocotili delle piante sotto lo stereomicroscopio e sezionare ulteriormente i primordi fogliari che copre il SAMs vegetativo utilizzando pinze gioielli.

4. colorazione

1. Per visualizzare direttamente le cellule in SAMs, usare preparate propidio ioduro (PI) soluzione per macchiare le pareti cellulari. Sciogliere la polvere di PI in acqua deionizzata sterile, fare soluzione colorante 1mL PI alla concentrazione di 1 mg/mL e conservare la soluzione PI in tubo del microcentrifuge coperto con carta stagnola.
2. Pipettare 50 µ l di soluzione di PI in un ambiente pulito e Petri vuota e tuffo tutta dissecato sparare apice in tintura per 2 min risciacquo all'apice macchiato sparare due volte in acqua deionizzata sterile. Durante il processo di colorazione, immergere l'infiorescenza intero SAM o SAM vegetativa nella soluzione PI per ottenere la colorazione uniforme.

5. immagine collezione

Nota: per questo metodo, tutti i Sam sono Imaging utilizzando un microscopio confocale in posizione verticale e con un 20x lente di immersione in acqua. Come descritto in altri protocolli^9,12,13,15, è anche possibile immagine SAMs utilizzando un microscopio invertito. Inoltre, l'imaging diretta può avvenire utilizzando diverse marche di microscopi confocali, con la stessa procedura di preparazione del campione. In questo studio, la procedura di imaging è descritti in dettaglio come un esempio.

1. Perforare un foro al centro di un piatto di imaging utilizzando forcipe e bastone l'apice di sparare macchiato in posizione verticale nel mezzo.
2. Riempire il piatto imaging con acqua deionizzata sterile per immergere completamente il campione. Osservazione dal microscopio stereo, pipetta su e giù per rimuovere le bolle d'aria intrappolate intorno il meristema. Quindi, regolare l'angolo del tronco in agar per assicurarsi che il SAM è completamente visibile dalla direttamente sopra.
3. Mettere il piatto imaging sul palco campione del microscopio confocale. Acqua-immersione lente di abbassare e alzare il tavolino del microscopio campione per lasciare che la punta della lente tuffo in acqua.
4. Aprire il software di microscopio confocale e localizzare il SAM il campo chiaro in oculari. Spostare il SAM campione a destra sotto la lente dell'obiettivo attraverso la regolazione del controller XY, quindi concentrarsi su SAM da oculari attraverso la regolazione con cautela il controller Z.
5. Azionare la funzione di acquisizione del software microscopio confocale (Vedi Tabella materiali), avviare la modalità Live per visualizzare l'esempio dallo schermo del computer e impostare tutti i parametri per l'esperimento di scansione laser.
   1. Quando si regolano i parametri, è possibile utilizzare Gamma indicatore funzione per definire se il segnale è saturo o non.
   2. Facoltativamente, applicare la funzione di riutilizzare per ricaricare tutte le impostazioni di parametro dal file selezionato confocale.
      Nota: Ha suggerito i parametri di imaging: Laser line (eccitazione): 515 nm o 561 nm; Emissione: 570-650 nm; Pinhole: 1 unità arioso (AU); Guadagno: 600-750, modalità di scansione: telaio; Misura telaio: 512 X 512 o 1024 X 1024; velocità di scansione: da 7 a Max; Direzione di scansione: bi-direzione; Media numero: 2-4; Con una media di metodo: dire; Profondità di bit: 16 Bit; Intervallo di scansione: 0,5-1 µM. Ottimizzare ulteriormente, tutti questi parametri in base alla natura dei campioni differenti della pianta e le specifiche esigenze di imaging.

6. image processing

1. Per la visualizzazione di viste di sezione trasversale e ortogonali ottico, è necessario utilizzare lo stesso software commerciale per l'acquisizione di immagine. Aprire il file originale confocale, fai clic su menu ortho, selezionare ortho. Quindi selezionare una delle due posizioni x, z e y posizione posizione dell'immagine e salvare le immagini come file tiff.
   1. Facoltativamente selezionare funzione distanza 3D per definire la distanza fisica tra due punti che sono stati selezionati dallo stack delle immagini confocale.
   2. In alternativa, utilizzare Fiji/Image J, il pacchetto di elaborazione di immagine risorse open per visualizzare le viste di sezione trasversale e ortogonali.
   3. Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immagine, selezionare stack e quindi selezionare viste ortogonali.
   4. Selezionare XY, YZe XZ piani in posizione centrale e salvare come immagini in formato Tiff.
2. Per visualizzare una proiezione 3D trasparente, utilizzare lo stesso software.
   1. Aprire il file originale confocale, fai clic su menu 3De selezionate trasparente per generare una vista di proiezione 3D.
   2. Facoltativamente fare clic su menu 3D, selezionare aspettoe quindi selezionare trasparenza per regolare tre parametri della proiezione tra cui soglia, rampa e massimo per la trasparenza del 3D immagine.
   3. Fai clic su menu 3D, selezionare aspetto, quindi luce per regolare la luminosità dell'immagine in 3D.
   4. Esportare le immagini proiettate e salvarli come file Tiff.
3. Per visualizzare una proiezione 3D intensità massima, aprire i file confocale con lo stesso software e fare clic sul menu 3D.
   1. Selezionare menu 3D e massima.
   2. In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare una proiezione 3D intensità massima.
   3. Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immagine e selezionate pile.
   4. Selezionare progetto 3D e salvare come immagini in formato Tiff.
4. Per visualizzare la profondità di visualizzazione delle immagini 3D di codifica, è possibile utilizzare lo stesso software.
   1. Fare clic su menu 3D e selezionare aspetto.
   2. Selezionare speciali e Profondità di codifica.
   3. In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare la profondità di codifica vista.
   4. Aprire i file confocale, fare clic sul menu immagine, selezionare Hyperstack.
   5. Selezionare codice temporale-colore e salvare come immagini in formato Tiff.
      Nota: La profondità z-stack codifica possono essere acquisiti anche attraverso il plugin Z codice Stack per Fiji.
5. Per la visualizzazione 3D vista di rotazione come indicato (film 1 e 2 di film), utilizzare lo stesso software (Vedi la Tabella materiali).
   1. Aprire i file confocale, fai clic su menu 3De selezionare serie.
   2. Selezionare il rendering di seriee selezionare una delle quattro opzioni tra cui girare intorno a x, girare intorno a y, inizio e fineed elenco posizione.
   3. Salvare la serie di rendering dei file AVI.
   4. In alternativa, è possibile utilizzare J Fiji/immagine per visualizzare la vista di rotazione 3D.
   5. Aprire il file originale confocale con Fiji, fare clic sul menu immaginee selezionate pile.
   6. Selezionare progetto 3D e salvare come video in formato AVI.

Risultati

Per valutare l'efficienza del nostro protocollo e per esplorare la morfologia dei meristemi da specie diverse, abbiamo effettuato esperimenti dal vivo imaging confocale sul meristema infiorescenza da Arabidopsis e meristemi vegetativi da pomodoro e soia. In questo studio, Arabidopsis ecotipo Landsberg erecta, cultivar di pomodoro Micro-Tom e cultivar di soia 82 Williams sono stati usati come esempi.

Vi...

Discussione

Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging che possa essere applicato allo studio dei meristemi apicali di sparare da diverse piante con piccole modifiche, aprendo una nuova strada per studiare la regolazione del meristema in fasi sia vegetativi e riproduttivi in piante modello e colture. In contrasto con il SEM e metodi di colorazione istologici, questo protocollo può aiutare a rivelare sia vista di superficie e interne strutture cellulari di SAMs, senza la necessità di alta intensità di lavoro esempio fissazione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software