Konfokale Live Imaging von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt Informationen zum live-Bild und analysieren schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie.

Zusammenfassung

Die schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM) Funktionen wie einem konservierten Stammzell-Reservoir und es erzeugt fast alle oberirdischen Gewebe während der postembryonic Entwicklung. Die Aktivität und Morphologie von SAMs bestimmen wichtige agronomische Merkmale, wie schießen Architektur, Größe und Anzahl der Geschlechtsorgane, und vor allem Kornertrag. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Analyse der Morphologie der Oberfläche und die internen Zellstruktur des lebendigen SAMs aus verschiedenen Arten durch Laser-scanning-confocal Mikroskop. Das gesamte Verfahren von der Probenvorbereitung für den Erwerb von dreidimensionalen (3D) Bilder mit hoher Auflösung erreicht werden kann, innerhalb von 20 Minuten. Wir zeigen, dass dieses Protokoll ist für das Studium nicht nur der Blütenstand SAMs die Modell-Arten, sondern auch die vegetativen Meristeme aus verschiedenen Kulturen, bietet eine einfache, aber leistungsstarkes Tool zur Untersuchung der Organisation und Entwicklung von hocheffizienten Meristeme über verschiedene Pflanzenarten.

Einleitung

Die Pflanze Meristem enthält einen Pool von undifferenzierten Stammzellen und kontinuierlich erhält die Orgel Pflanzenwachstum und Entwicklung¹. Während der postembryonic Entwicklung stammen fast alle oberirdischen Gewebe einer Pflanze aus schießen Sprossapikalmeristem Meristem (SAM). In Kulturen sind die Aktivität und die Größe des SAM und seine abgeleiteten floral Meristeme viele agronomischen Eigenschaften wie Shooting Architektur, Obstbau und Samen Ertrag fest zugeordnet. Beispielsweise führt eine vergrößerte SAM in Tomate, eine Zunahme der schießen und Blütenstand Verzweigungen und damit Ergebnisse bei der Schaffung von zusätzlichen Blüte und Frucht Organe². Bei Mais führt eine Zunahme SAM Größe zu einer höheren Ausgangszahl und Gesamtausbeute^3,4. In Soja Meristem Unbestimmtheit ist auch eng verbunden mit der Shooting-Architektur und⁵.

Die Morphologie und Anatomie von SAMs können durch verschiedene Methoden, einschließlich der histologischen Schnitt/Färbung und Rasterelektronenmikroskopie (SEM)⁶, Scannen charakterisiert werden, die beide Meristem-Forschung durch die Bereitstellung von stark fortgeschrittenen haben die Schnittansicht oder eine dreidimensionale (3D) Oberflächenansicht von SAMs. Beide Methoden sind zeitaufwendig, an denen mehrere experimentelle Schritte von der Probenvorbereitung für die Datenerfassung, jedoch und diese Methoden hängen vor allem von örtlich festgelegten Proben. Jüngste Fortschritte in der Laser-scanning-Technik der konfokalen Mikroskopie haben diese Grenzen überwinden und uns ein mächtiges Werkzeug, um die Zellstruktur und Entwicklungsprozess des pflanzlichen Geweben und Organen^7,8zu untersuchen. Durch optische anstatt physische Gewebe strukturierendes, konfokale Mikroskopie ermöglicht die Sammlung eine Reihe von Z-Stapel Bilder und die anschließende 3D-Rekonstruktion der Probe durch Bildanalyse-Software.

Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Untersuchung sowohl innen und Oberflächenstrukturen des lebendigen SAMs aus verschiedenen Pflanzenarten mit Laser-scanning-konfokalen Mikroskopie, wodurch potentiell Forscher, die experimentell zu erreichen Prozesse innerhalb von 20 Minuten. Anders als bei anderen veröffentlichten Methoden für live konfokale Abbildung von Arabidopsis Blütenstand SAMs^{9,10,11,12,13,14, 15} und Arabidopsis Blumen^12,13, hier zeigen wir, dass dieses Protokoll ist sehr effizient für das Studium nicht nur den Blütenstand Meristeme der Modell-Arten, sondern auch die vegetativen schießen Sprossapikalmeristem Meristeme aus verschiedenen Kulturen, wie Tomaten und Soja. Diese Methode setzt nicht auf transgene fluoreszierenden Marker und kann potenziell angewendet werden, um das Shooting Meristeme aus vielen verschiedenen Arten und Sorten zu studieren. Darüber hinaus führen wir auch einfache Bildverarbeitung Schritte zum Anzeigen und analysieren von verschiedenen SAMs in einer 3D-Ansicht. Zusammengenommen wird diese einfache Methode Forscher besser zu verstehen, die Struktur und Entwicklungsprozess des Meristeme von Modellorganismen und Kulturen erleichtern.

Protokoll

(1) Medien und Bildgebung Gerichte-Vorbereitung

1. MS Teller: 0,5 x Murashige & Skoog MS mittlere, 1 % Agar in entionisiertem Wasser hinzufügen und dann justieren pH bis 5.8 mit Kalilauge (Optional: Fügen Sie 1 % Saccharose für langfristige Pflanzenbau). Autoklaven und gießen Sie Platten.
2. Imaging-Gerichte: füllen Sie Kunststoff Petrischalen (6 cm breit, 1,5 cm tief) auf 0,5-0,8 cm mit 1,5 % flüssige Agarose.

(2) Pflanzenwachstum

1. Arabidopsis Wachstum
   1. Sterilisierte Saat auf MS Teller und Platten unter 4 ° C für zwei Tage. Verschieben Sie dann MS-Platten in ein kurzer Tag (8 h Licht / dunkel 16 h), bei 22 ° C für zwei Wochen.
   2. Transplantation Sämlinge zu Boden und wachsen sie in einer kurzen Tage (8 h Licht / dunkel 16 h) bei 22 ° C für vier Wochen.
   3. Übertragen Sie Pflanzen auf Dauerlicht bei 22 ° C, den Übergang von der vegetativen zur reproduktiven Phase und für die Belichtung der Blütenstand SAMs zu induzieren.
2. Tomaten und Soja Wachstum
   1. Inkubieren Sie die Samen mit nassem Filterpapier unter 28 ° C bedeckt, bis sie Keimen.
   2. Transplantation Sämlinge zu Boden und wachsen sie in einem langen Tag (16 h Licht / dunkel 8 h) bei 25 ° C für eine Woche oder länger für die vegetative SAMs-Bildgebung.

(3) Dissektion des Shooting apex

1. Dissektion des Blütenstandes Shooting apex
   1. Geschnitten Sie die Blütenstand Shooting Spitze zusammen mit 1-2 cm Hauptstamm aus verschraubten Arabidopsis -Pflanzen mit einer Rasierklinge. Halten Sie den basalen Teil des Haupttriebes und entfernen Sie möglichst viele ältere Blume Organe wie möglich aus den Hauptstamm durch sezieren, die fruchtbaren mit Schmuck Pinzette.
      Achtung: Vermeiden Sie schneiden Finger bei der Verwendung einer Rasierklinge. Entsorgen Sie gebrauchte Rasierklingen zu einer richtigen Scharfbehälter.
   2. Halten Sie den beigefügten Stiel des Apex Shooting mit Schmuck Zange oder Finger auf dem Gebiet der Stereomikroskop, weiter, den Rest der Blüten zu entfernen, bis fast die ganze SAM von den Okularen betrachtet werden kann. Entfernen Sie fruchtbaren eindeutig an der Kreuzung des Haupttriebs.
2. Dissektion des vegetativen Shooting apex
   1. Zum Anzeigen der vegetativen SAMs aus Tomaten oder Soja sezieren, die Keimblätter, Blätter und Wurzeln der Pflanzen.
   2. Halten Sie die Hypocotyle der Pflanzen unter dem Stereomikroskop und weiter zu sezieren Sie, die Leaf Primordia deckt die vegetativen SAMs mit Schmuck Pinzette.

(4) Färbung

1. Um Zellen in SAMs direkt sichtbar zu machen, verwenden Sie frisch zubereitete Propidium Jodid (PI) Lösung, um Zellwände zu beflecken. Lösen Sie PI-Pulver in sterilen, deionisiertes Wasser auf, 1mL PI Färbelösung bei der Konzentration von 1 mg/mL und speichern Sie die PI-Lösung in Microcentrifuge Schlauch mit Aluminiumfolie abgedeckt.
2. Pipette 50 µL-PI-Lösung in einem sauberen und leere Petrischale und Dip die gesamte seziert schießen Apex in Farbstoff für 2 min. Spülen gefärbten Shooting Apex zweimal in sterilen, deionisiertes Wasser. Tauchen Sie bei der Färbung die ganze Blütenstand SAM oder vegetativen SAM in die PI-Lösung, die einheitliche Färbung zu erreichen.

5. die Bildsammlung

Hinweis: für diese Methode, alle die SAMW sind abgebildet mit einem aufrechten confocal Mikroskop und mit 20 x Objektiv Wasser eintauchen. Wie in anderen Protokollen^9,12,13,15beschrieben, ist es auch möglich, Bild mit einem inversen Mikroskop SAMs. Darüber hinaus kann die live Bildgebung mit verschiedenen Marken von konfokalen Mikroskopen mit der gleichen Probe vorbereitenden Maßnahmen erreicht werden. In dieser Studie sind die bildgebenden Schritte im Detail exemplarisch beschrieben.

1. Stechen Sie ein Loch in der Mitte ein bildgebendes Gericht mit Pinzette und halten Sie gefärbten Shooting Apex im Medium aufrecht.
2. Steril, deionisiertes Wasser komplett eintauchen die Probe füllen Sie die bildgebende Schüssel ein. Aus dem Stereo-Mikroskop betrachten, gefangen Pipette rauf und runter, um Luftblasen zu entfernen um die Meristem. Dann stellen Sie den Winkel des Vorbaus im Agar um sicherzustellen, dass die SAM direkt oberhalb von vollständig zu sehen ist.
3. Ort der bildgebenden Gericht auf der Probe-Bühne des confocal Mikroskop. Heben Sie Probe Mikroskoptisch zu lassen, die Spitze der Linse Dip ins Wasser und senken Sie Wasser eintauchen Objektiv.
4. Öffnen Sie die confocal Mikroskop-Software und suchen Sie die SAM im Hellfeld in die Okulare. Bewegen Sie der SAM Probe direkt unter das Objektiv durch die Justage der XY-Regler, dann konzentrieren Sie sich auf die SAM aus Okulare durch vorsichtig anpassen des Z-Controllers.
5. Die Übernahme-Funktion in der konfokalen Mikroskop-Software zu betreiben (siehe Tabelle der Materialien), Start der Live-Modus , um die Probe aus dem Computer-Bildschirm anzeigen, und richten Sie alle Parameter für die Laser-scanning-Experiment.
   1. Wenn Sie die Parameter anpassen, Reichweitenanzeige Funktion festlegen, ob das Signal oder nicht gesättigt ist.
   2. Optional, wendet die Wiederverwendung Funktion um die Parameter-Einstellungen aus der ausgewählten konfokale Datei neu zu laden.
      Hinweis: Parameter Bildgebung vorgeschlagen: Laser-Linie (Anregung): 515 nm oder 561 nm; Emission 570-650 nm; Lochkamera: 1 luftig Einheit (AU); Gewinn: 600-750-Scan-Modus: Rahmen; Rahmenhöhe: 512 X 512 oder 1024 X 1024; Scan-Geschwindigkeit: 7 bis Max; Abtastrichtung: Bi-Richtung; Durchschnittlichen Anzahl: 2-4; Im Durchschnitt Methode: bedeuten; Bit-Tiefe: 16-Bit; Scan-Intervall: 0,5-1 µM. Weiter, all diese Parameter basierend auf der Art verschiedene Pflanzenproben und bildgebenden Bedürfnisse zu optimieren.

6. Bildbearbeitung

1. Zur Visualisierung von optischen orthogonal und quer Schnittansichten, verwenden Sie die gleiche kommerzielle Software für die Bildbearbeitung Erwerb. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale, ortho Menü, wählen Sie ortho. Wählen Sie dann entweder X-Position, y-Position und z position des Bildes, und speichern Sie die Bilder als TIFF-Dateien.
   1. Wählen Sie optional 3D Abstandsfunktion die räumliche Distanz zwischen zwei Punkten zu definieren, die aus dem Stapel der konfokalen Bilder ausgewählt wurden.
   2. Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, das offene Ressource Bild Verarbeitung-Paket, die orthogonal und quer Schnittansichten zu visualisieren.
   3. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild", wählen Sie Stapel und dann Draufsichten.
   4. XY, YZund XZ Ebenen in die mittlere Position auswählen und als Bilder im TIFF-Format speichern.
2. Zur Visualisierung einer transparente 3D-Projektion, verwenden Sie die gleiche Software.
   1. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale, klicken Sie auf 3D Menü, und wählen Sie Transparent , erstellen Sie eine Projektionsansicht 3D.
   2. Klicken Sie optional auf 3D Menü, wählen Sie aussehenund dann Transparenz , drei Parameter der einschließlich Schwelle, Rampe und maximale Transparenz der 3D Projektion Bild.
   3. Klicken Sie auf 3D Menü, wählen Sie aussehen, und Licht , die Helligkeit des 3D Bildes einzustellen.
   4. Exportieren Sie die projizierten Bilder und speichern Sie sie als TIFF-Dateien.
3. Zur Visualisierung von 3D Beihilfehöchstintensität Projektion, öffnen Sie die konfokalen Dateien mit der gleichen Software zu, und klicken Sie auf das 3D-Menü.
   1. Wählen Sie 3D Menü und maximale.
   2. Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, um eine maximale Intensität 3D Projektion zu visualisieren.
   3. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild" und wählen Sie Stapel aus.
   4. 3D Projekt auswählen und als Bilder im TIFF-Format speichern.
4. Zur Visualisierung der Tiefe Blick auf die 3D-Bilder-Codierung, verwenden Sie die gleiche Software.
   1. Im 3D Menü und wählen Sie im Erscheinungsbild.
   2. Wählen Sie spezielle und Tiefe Kodierung.
   3. Alternativ können Sie Fidschi/Bild J, um die Tiefe Ansicht-Codierung zu visualisieren.
   4. Öffnen Sie die konfokalen Dateien zu, klicken Sie auf Menü "Bild", wählen Sie Hyperstack.
   5. Wählen Sie Temporal - Farbcode und als Bilder im TIFF-Format speichern.
      Hinweis: Die Tiefe Codierung Z-Stapel kann auch durch das Plugin Z-Code-Stack für Fidschi erreicht werden.
5. Zur Visualisierung von 3D Drehung Ansicht wie gezeigt (Film 1 und Film 2), die gleiche Software verwenden (siehe Tabelle der Materialien).
   1. Öffnen Sie die konfokalen Dateien, klicken Sie auf 3D Menüund wählen Sie Serie.
   2. Wählen Sie Serie zu machen, und wählen Sie eine der vier Optionen einschließlich X umdrehen, umdrehen y, Start- und Enddatumund Positionsliste.
   3. Speichern Sie die Render-Serie als AVI-Dateien.
   4. Alternativ können Sie Fidschi/Bild J die 3D-Drehung Ansicht zu visualisieren.
   5. Öffnen Sie die Originaldatei konfokale mit Fidschi, klicken Sie auf Menü "Bild"und wählen Sie Stapel aus.
   6. Wählen Sie 3D Projekt aus und speichern Sie als AVI-Format Videos.

Ergebnisse

Um die Effizienz unseres Protokolls zu bewerten und die Morphologie der Meristeme verschiedener Arten zu erkunden, haben wir die konfokale live-imaging-Experimente an der Blütenstand Meristem von Arabidopsis und die vegetative Meristeme aus ausgeführt. Tomaten und Soja. In dieser Studie, Arabidopsis Ökotyp Landsberg Erecta, Tomaten Sorte Micro-Tom und Sojabohnen Sorte worden Williams 82 als Beispiele benutzt.

Diskussion

Hier beschreiben wir eine einfache bildgebende Methode, die für die Untersuchung von Shoot Sprossapikalmeristem Meristeme aus unterschiedlichen Werken mit geringfügigen Änderungen angewendet werden kann öffnen einen neuen Weg um die Meristem-Verordnung an den vegetativen und reproduktiven Stadien in Modellpflanzen zu studieren und Pflanzen. Im Gegensatz zu die SEM und histologische Färbung Methoden helfen dieses Protokolls Oberflächenansicht und interne Zellstrukturen von SAMs, ohne die Notwendigkeit für arbeitsin...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Phyto	Dot Scientific Inc.	DSA20300-1000
Agarose	Dot Scientific Inc.	AGLE-500
Forceps	ROBOZ	RS-4955	Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope	Zeiss
Murashige & Skoog MS medium	Dot Scientific Inc.	DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens	Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm	CELLTREAT Scientific Products	229694	Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15	CELLTREAT Scientific Products	229665	Use as imaging dishes
Propagation Mix	Sungro Horticulture
Propidium iodide	Acros Organics	440300250	1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade	PERSONNA	62-0179	For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Tissue	VWR	82003-820
Zen black	Zeiss		Image acquisition software