הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

Summary

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

Abstract

כל בעלי החיים, מולדת חסינות מספקת של הגנה חזקה ומיידית נגד קשת רחבה של פתוגנים. תגובות חיסוניות ההורמונאלית וסלולריות הענפים העיקריים של מולדת חסינות הינם רבים הגורמים ויסות התגובות הללו אבולוציונית נשמרים בין חסרי חוליות, יונקים. Phagocytosis, היא מרכיב מרכזי של מולדת חסינות תאית, מבוצעת על ידי תאים מיוחדים דם של המערכת החיסונית. זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, התפתחה מודל גנטי חזק כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים ואת ההשפעות הפיזיולוגיות של phagocytosis בבעלי חיים שלם. כאן אנחנו מדגימים מבוססת על הזרקת phagocytosis ויוו assay לכמת את ספיגת החלקיקים ואת הרס על ידי דרוזופילה כדוריות הדם, hemocytes. ההליך מאפשר לחוקרים הבקרה בדיוק את ריכוז החלקיקים ואת המינון, מאפשר להשיג תוצאות מאוד לשחזור בתוך זמן קצר. הניסוי הוא כמותי, קל לביצוע, וניתן להחילם על המסך עבור גורמים מארח את זיהוי פתוגן השפעת ספיגת, סיווג.

Introduction

מערכות ההגנה החיסוניות מולדת יוצרים את השורה הראשונה של הגנה מפני חיידקים פתוגניים. תגובות אלה ניתן לחלק באופן פונקציונלי לתוך ההורמונאלית וסלולריות מולדת חסינות, אשר שניהם נמצאים מתווך על ידי קולטנים זיהוי התבנית בקידוד germline (PRRs) לחוש פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs)¹. רבים מן המסלולים איתות ומנגנונים אפקטור של מולדת חסינות נשמרים יונקים, חסרי חוליות, כגון של תולעים נימיות, Caenorhabditis elegans, זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster². זבוב הפירות התפתחה מערכת חזקה ללמוד מארח הגנה מפני מיקרואורגניזמים זיהומיות³. דרוזופילה הוא צייתן גנטית, בקלות ובזול גדלו במעבדות, ויש לו זמן דור קצר. יתר על כן, זבוב הפירות המוצגים ההגנה היעילה ביותר נגד מערך של חיידקים, המאפשר הבחינה של המארח חסינות מפני גורמי מחלה ויראלי, חיידקי, פטרייתי או טפילים.

דרוזופילה immunologists היסטורית מסויימת קדימה מסכי גנטי, הגנום כולו בתיווך RNA הפרעה (RNAi) הקרנה של שורות תאים חרקים, קיימים זנים לעוף מוטנטים לבחון מולדת חסינות – המוביל זיהוי ואפיון של מספר המסלולים החיסונית ההורמונאלית אבולוציונית שנשמרת^4,5,6,7,8. התגובה החיסונית מולדת ההורמונאלית, ניתן לטעון, הכי טוב מאופיין ההגנה החיסונית של זבובי פירות. לאחר ההדבקה, התגובה ההורמונאלית מוביל ייצור ושחרור מערכתית של פפטיד מיקרוביאלית (כח) מולקולות לתוך hemolymph, הדם המקביל בחרקים. מגברים המיוצרים על ידי אגרה מאוד שנשמרת Imd מסלולי איתות. מסלול אגרה זה הומולוגי ל בתרבית של קולטן TLR/IL-1R איתות, מסלול Imd הומולוגי ל הגידול נקרוזה מקדם יונקים-אלפא איתות. ב . דרוזופילה, אגרה איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם חיוביים, פטריות ו viru דרוזופילה Xs^6,9,10 , Imd איתות הנגרמת על ידי חיידקים גראם שליליים^{11 ,12}.

חסינות תאית, המורכב כימוס, melanization ו- phagocytosis של פתוגנים פולשני, שביצעו תאי דם מיוחד הנקרא hemocytes¹³. ישנם שלושה סוגים של hemocytes זבוב הפירות: קריסטל תאים, lamellocytes ו- plasmatocytes¹³. קריסטל תאים, אשר מהווים 5% של hemocytes במחזור של הזחלים, שחרור אנזימים proPhenoloxidase (צע) שמוביל melanization של פתוגנים ורקמות מארח באתרים הפצע. Lamellocytes, אשר לא כלל נמצאים העוברים בריאים או הזחלים, הם תאים חסיד הכומסים חפצים זרים. תאים אלה הם המושרה על pupariation או כאשר הביצים צרעה parasitizing מופקדים הזחלים. Plasmatocytes phagocytic, אשר מהווים 95% של מחזורי hemocytes של הזחלים, כל שנותר hemocytes אצל מבוגרים, לשחק תפקיד רקמת שיפוץ במהלך הפיתוח ולשמש, ראוי לציין, התא אפקטור הראשי של חסינות תאית דרוזופילה .

Phagocytosis קו מיידית וגם קריטיים של ההגנה החיסונית מולדת; חיידקים זה לפרוץ את מחסום האפיתל של המארח במהירות אפף, חוסל על ידי תאי דם phagocytic (לסקירה מקיפה של ביולוגיה של התא של phagocytosis ראה אסמכתא ¹⁴). תהליך זה הוא יזם בעת זיהוי תבניות מקודד germline רצפטורים (PRRs) על hemocytes מזהה את הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs) של חיידקים. פעם קשור אל המטרות שלהם, PRRs ליזום cascades איתות להוביל להיווצרות של pseudopods דרך אקטין שיפוצים שלד התא. Pseudopods מקיפים תא החיידק, אשר לאחר מכן נבלע, הפנימו לתוך אברון המתהווה, phagosome. חיידקים מושמדים כמו phagosome עובר התהליך של התבגרות phagosome כאשר phagosome הוא הנסחר לכיוון הפנים של hemocyte acidifies דרך סדרה של אינטראקציות עם lysosomes. חוץ גופית ו תא לימודי ביולוגיה בתרבית של תאי העיקרי היה אינסטרומנטלי זיהוי ואפיון הגורמים לווסת phagocytosis, כגון בתרבית של קולטן Fc-גמא ו- C3b קולטנים^15,16. ובכל זאת, היכולת לבצע מסכי בקנה מידה גדול או לימודים ויוו מוגבלים במערכות יונקים.

כאן נציג של assay ויוו עבור phagocytosis ב זבובי פירות למבוגרים, אשר מבוססת על הליך הוצג לראשונה על ידי המעבדה של דוד שניידר 2000¹⁷. המעבדה שניידר הראה כי hemocytes sessile אכילת הכלי הגבי בטן בקלות phagocytose חרוזי פוליסטירן וחיידקים. כדי להמחיש phagocytosis, זבובים מוזרקים עם חלקיקים fluorescently שכותרתו (כגון e. coli המסומנת fluorescein isothiocyanate (e. coli -FITC)), מודגרות במשך 30 דקות לאפשר זמן hemocytes להחריב את החלקיקים, ולאחר מכן הזריקו trypan blue, אשר המרווה את זריחה של חלקיקים לא phagocytosed במהלך תקופת הדגירה. כלי הגבי לעוף ואז עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. את העבודה הזו, באמצעות ניסוי פשוט יחסית, הדגימו כי hemocytes phagocytose חיידקים, חרוזים לייטקס, הזה phagocytosis חיידקי יכול להיות מעוכב מראש הזרקת טס עם חרוזים לייטקס, ואת זה לא טס בלי הסלולר והן ההורמונאלית תגובות חיסוניות רגישים אפילו e. coli. וזמינותו שהובאו בדו ח זה מתבסס על העבודה של המעבדה שניידר לכמת phagocytosis ויוו על ידי מדידת עוצמת קרינה פלואורסצנטית של חלקיקים נבלע על ידי כלי הגבי הקשורים hemocytes.

בדומה את הגישה במערכות יונקים, גנטיקאים דרוזופילה השתמשו בתחילה ברמת הגנום RNAi במבחנה מסכי לזיהוי גנים הדרושים עבור התגובה החיסונית הסלולר^{18,19,20 ,21,22,23}. עם זאת, התפתחות וזמינותו phagocytosis ויוו למבוגרים מופעלת ניסויים מעקב יבוצע בקלות אצל בעלי חיים שלמה, ובכך מאפשר לחוקרים לוודא הביולוגי את התפקיד של הגורמים שזוהו במחקרים במבחנה. כזה היה המקרה עם הקולטן transmembrane אוכל, אשר זיהה לראשונה את כל קולטן חיידקי במסך RNAi באמצעות S2 תאים²⁴ מוצג מאוחר יותר כדי לתווך Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, , Staphylococcus aureus (S. aureus) phagocytosis מבוגרים²⁵.

במעבדה מועסקים וזמינותו phagocytosis ויוו מסכי גנטי קדימה ולימודים הגנום כולו האגודה (באמצעות את דרוזופילה גנטי הפניה לוח (DGRP)) לזיהוי הרומן גנים המווסתים phagocytosis ב hemocytes למבוגרים. מחקרים אלה הובילו איפיון קולטני PGRP-SC1A, PGRP-SA²⁶, את שלפוחית תאיים סחר חלבון Rab14²⁷, גלוטמט טרנספורטר פוליפמוס²⁸ו RNA-מחייב חלבון פוקס-1²⁹.

אנו צופים מסכי לעתיד שילוב של phagocytosis ויוו עלול להוביל הזיהוי של גנים נוספים חשובים עבור התגובה החיסונית הסלולר דרוזופילה. המסכים באמצעות וסודרו באופן מלא שורות המפגרים, כגון DGRP או את דרוזופילה סינתטי האוכלוסייה משאבים (DSPR), ניתן לזהות משתנים טבעיים המשפיעים על התפתחות phagocytosis או hemocyte. יתר על כן, הטכניקה בפרשה מינים אחרים של דרוזופילה או בשימוש למשאבי קהילה חדש המסך, כגון האוסף של 250 מינים דרוזופילה , נשמר על ידי נבחרת דרוזופילה מינים מניות מרכז (NDSSC ) בקורנל. ניסויים אלה יכולים להתבצע באמצעות fluorescently-ידי חיידקי או פטרייתי קיר bioparticles זמינים מסחרית או יכול להתבצע באמצעות מספר כלשהו של חיידקי או פטרייתי מינים – סיפק החיידק מבטאת את סמני פלורסנט .

Protocol

1. מכינים את חלקיקי Fluorescein להזרקה

1. לשקם 10 מ ג של חיידקים זמינים מסחרית, חום-נהרג חלקיקים המסומנת fluorescein (ראה טבלה של חומרים) כדי ריכוז מניות של 10 מ"ג/מ"ל על-ידי הוספת 990 µL עקר 1 x PBS אזיד הנתרן 50 מ מ µL 10. מערבולת לערבב.
   1. לחלק לשימוש יחיד aliquots µL 8 צינורות 0.2 מ"ל ולאחסן בקופסא כהה ב 4 ° C כדי למזער את רגישות לאור המשויך.
      הערה: משמר אזיד הנתרן הוא אופציונלי והוא יכול להיות מושמט אם המניות 10 מ"ג/מ"ל נעשים עם PBS עקר 1 x 1 מ"ל, aliquoted, ומאוחסן ב-20 ° C.
2. להפוך את פתרון 10 מ"ל של 5% מאכל ב- PBS 1 x על ידי ערבוב 500 µL מזרק מסונן אוכל ירוק צביעה ו- 9.5 mL x 1 סטרילי PBS.
3. רחץ חלקיקים לפני הזרקת להסיר אזיד הנתרן. מיקס 42 µL 1 סטרילי-PBS ו- µL 8 של 10 מ"ג/מ"ל בשפופרת 1.7 מ. צנטריפוגה-מהירות מקסימלית 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
   1. הסר את תגובת שיקוע, להוסיף 50 µL 1 x PBS צנטריפוגה בכל מהירות מקסימלית 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. חזור על שלבים 1.3 ו 1.3.1 x 2, עבור סכום כולל של 3 מנקי.
   3. לאחר השטיפה הסופית למחוק את תגובת שיקוע, מחדש להשעות חלקיקי 1.6 מ"ג/מ"ל ב- 50 µL של 5% מאכל ב- 1 x PBS.
   4. לעטוף את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן מפני אור. לאחסן ב 4 ° C, למחוק לאחר שבוע אחד.

2. מכינים את הזרקת תחנת וזבובים

1. להכין משטח הזרקה. כדי להזריק עד 4 אחרים של זבובים באותו זמן, שימוש בקלטת מעבדה כדי לחלק זבוב₂ CO מלבני פאד לתוך 4 סעיפים. על הספסל ליד המיקרוסקופ, לייעד שטחים כדי למקם את הבקבוקונים ברגע זבובים גויסו על משטח (אחד לכל פינה של כרית).
2. מכינים צלוחיות של גיל-מתאימים, 4-7 ימים-זקן, זבובים להזרקה. עבור כל זן להיבדק, להעביר 5 זכרים ונקבות 5 לתוך בקבוקון טריים, עם תוויות של אוכל מוכן לטוס ולשמור על 25 מעלות צלזיוס.
3. להכין את מזרק פנאומטיים (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הגדרת המכשיר מצב מתוזמן -100 מילישניות (צרורות קצרים של גז בלחץ לגרש את הנוזל – המאפשר את המשלוח של אמצעי אחסון תת-nanoliter).
4. הכינו את שקופיות מיקרוסקופ. לחתוך רצועות 1.5 אינץ של איזולירבנד, מקפלים לתוך לולאה עם הצד דבק החוצה, ולמקם לשקופית שכותרתו מיקרוסקופ.

3. מכינים מחטים נימי זכוכית

1. משוך זכוכית מחטים (נימים זכוכית קיר דק) באמצעות של פולר המחט.
   1. להחזיק את המחט מתחת למיקרוסקופ מיקרומטר, שבור את הקצה באמצעות מלקחיים נירוסטה הצבע בסדר #5. 100 מיקרומטר טיפים מספיקים לחדור לקוטיקולה של הזבוב תוך מזעור ופצעו.
   2. למדוד את עוצמת הקול של נוזל זה יוזרקו כל זבוב. לטעון את המחט עם 5% סטרילי מאכל ב- PBS 1 x ולגרש את הנוזל על טיפה של שמן מינרלי-מיקרומטר הבמה 0.01 מ מ.
      הערה: אם ה-droplet נוזלי כדורית, עוצמת הקול של picoliters מחושבת (גודל)³/1910. ³⁰ מחט בקוטר 100 מיקרומטר יפלוט ~ 2 nL ב-100 מילישניות.

4. להזריק זבובים

1. פיפטה µL 10 חלקיקים 1.6 מ"ג/מ"ל אל כיכר קטנה של מצלמות-מיקרוסקופים.
   1. משוך את הנוזל לתוך המחט והר בתוך הצינור מזרק (ראה טבלה של חומרים).
   2. עזים ומתנגד זבובים עם CO₂ , סדר אותם בשורה באזור המיועד שלהם על flypad, עם הצד הבטני למעלה וראשי הפונה לכיוון החלק הקדמי של משטח. מניחים צלוחיות באזורים המתאימים על הספסל.
   3. להזריק זבובים בפינה העליונה של הבטן עם משאבות 5, 100 ms של נוזל (~ 10 nL סה כ).
   4. להעביר את הזבובים מוזרק הבקבוקונים המתאים, שים לב הפעם על המבחנה. לשמור על 25 מעלות צלזיוס.
2. לטעון מחט חדשה עם 0.4% Trypan Blue פתרון.
3. הגדר את מזרק פנאומטיים מגודרת, אשר מאפשר זרם קבוע של אוויר כדי לדחוף את הנוזלים המחט.
4. עזים ומתנגד זבובים אחרי שנחו למשך 30 דקות, להזריק Trypan Blue עד הבטן נפוחה ומלאים.
   הערה: כאשר בחינת ההבשלה phagosome עם חלקיקים עם צבע pH רגיש תוויות, לאפשר זבובים לנוח לשעה, לא להזריק trypan blue לפני הרכבה זבובים.
5. הר זבובים על שקופיות מיקרוסקופ עם איזולירבנד, בצד הגחוני למטה. לדחוף את הכנפיים לצד של הזבוב ולאבטח אותם לקלטת. בנוסף, בעדינות לדחוף את הראש לתוך הקלטת כדי להבטיח כי הזבוב לא יזוז.
6. מיד לעבור שלב 5.

5. הדמיה זבובים

1. התמונה זבובים, אחד בכל פעם, 25 x או 32 x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה המצורפת ממצלמה דיגיטלית, מחשב (ראה טבלה של חומרים). להתמקד בכלי הגבי של הזבוב באמצעות תוכנת מחשב עבור המצלמה הדיגיטלית.
2. להקליט את זמן החשיפה ואת ההגדלה בין ניסויים.
   הערה: איבוד תחושת אחרים היא מקור פוטנציאלי של שגיאה כאשר מצלמים זנים מרובים במכה אחת. כדי להימנע המטעות זבובים, רשום את מספר התמונה התצלום הראשון והאחרון לטוס עבור כל גנוטיפ.

6. לכימות, נורמליזציה של קרינה פלואורסצנטית

1. לפתוח את התוכנה ופתח תמונה אחת בכל פעם.
   1. למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית של כלי השיט הגבי. לצייר מצולע סביב הספינה הגבי. בחר מדד ולהקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתוך המצולע.
   2. קבע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רקע. להעתיק את המצולע הראשונה ולהעביר אותה לאזור סמוך לכלי השיט הגבי של הזבוב. בחר מדד עוצמת קרינה פלואורסצנטית הרשומה של אזור רקע.
   3. לנרמל את הכלי הגבי זריחה על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע:
      כלי הגבי ÷ רקע.
   4. לחשב שהממוצע מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית כלי הגבי זבובים כל זן.
   5. חזור על הניסוי 2 פעמים נוספות.
   6. שימוש תלמיד של אינטראקצית t-test כדי להשוות עוצמות קרינה פלואורסצנטית היחסי רשע זבובים שליטה ולבדוק טסה 3 ניסויים. לחשב את גודל האפקט באמצעות הנוסחה: של כהן d = (ז₁- M₂) ÷ SD_במאגר, כאשר M₁ הוא הממוצע של גנוטיפ 1 ו- M₂ הוא הממוצע של גנוטיפ 2 &
      SD _במאגר =
      כאשר SD1 הוא סטיית התקן של גנוטיפ 1 ו- SD2 הוא סטיית התקן של גנוטיפ 2.

תוצאות

תיאור סכמטי של וזמינותו phagocytosis ויוו באמצעות חלקיקים התווית על-ידי fluorescein מוצג איור 1A. זבובים הם נטענים בצד הגחוני למטה על פיסת סרט בידוד והוא קודם שני מגזרים של הבטן, איפה נמצא כלי הקיבול הגבי, נראה בבירור (איור 1B). מפתח מקורות השגיאה ניסיונ?...

Discussion

חלקיקים זמינים מסחרית, שכותרתו fluorescently משמשים כדי להעריך phagocytosis באופן כללי (0.2 µm carboxylate-השתנה microspheres) או phagocytosis של חיידקים (שכותרתו fluorescently חום - או כימית להרוג חיידקים או שמרים). כדי להעריך את ההבשלה phagosome, החוקרים יכולים לבחור חלקיקים עם צבע pH רגיש הזה שזוהר כאשר pH מקטין מ ניטראלי כדי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)