Evaluar el Cellular la respuesta inmune de la mosca de la fruta, Drosophila melanogasterutilizando un ensayo de fagocitosis en Vivo

Resumen

Este protocolo describe un ensayo de fagocitosis in vivo en adultos de Drosophila melanogaster para cuantificar fagocito reconocimiento y liquidación de las infecciones microbianas.

Resumen

En todos los animales, inmunidad innata proporciona una defensa inmediata y robusta contra un amplio espectro de patógenos. Respuesta inmune humoral y celular son las ramas principales de la inmunidad innata, y muchos de los factores de regulación de estas respuestas están conservadas evolutivamente entre los invertebrados y mamíferos. Fagocitosis, el componente central de la inmunidad celular innata, es llevado a cabo por células de sangre especializadas del sistema inmune. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha emergido como un poderoso modelo genético para investigar los mecanismos moleculares y efectos fisiológicos de la fagocitosis en animales enteros. Aquí demostramos un ensayo de fagocitosis in vivo basado en la inyección para cuantificar la absorción de partículas y la destrucción de las células sanguíneas de la Drosophila , hemocitos. El procedimiento permite a los investigadores controlar con precisión la concentración de partículas y la dosis, lo que permite obtener resultados altamente reproducibles en un corto período de tiempo. El experimento es cuantitativo, fácil de realizar y se puede aplicar a la pantalla para los factores del huésped que reconocimiento de patógeno de influencia, la absorción y separación.

Introducción

Defensas inmunes innatas forman la primera línea de defensa contra los microbios patógenos. Estas respuestas pueden dividirse funcionalmente en la inmunidad innata humoral y celular, los cuales son mediados por receptores de reconocimiento de patrón codificado del germline (PRRs) que sensación patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs)¹. Muchas de las vías de señalización y mecanismos efectores de la inmunidad innata se conservan en mamíferos e invertebrados, tales como el nematodo Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster². La mosca de la fruta se ha convertido en un potente sistema de defensa del huésped contra microorganismos infecciosos³de estudio. Drosophila es genéticamente manejable, fácilmente y a bajo costo criados en laboratorios y tiene un tiempo de generación corto. Además, la mosca de la fruta presenta eficientes defensas contra una amplia gama de microbios, lo que permite el examen de la inmunidad del anfitrión contra patógeno viral, bacteriana, micótica o parasitaria.

Inmunólogos de Drosophila han utilizado históricamente adelantadas pantallas genéticas, genoma mediada por RNA de interferencia (ARNi) proyección de líneas celulares de insectos y existían cepas de mosca mutantes para examinar la inmunidad innata – llevando a la identificación y caracterización de varias vías inmune humoral evolutivamente conservado^4,5,6,7,8. La respuesta inmune innata humoral es, sin duda, el mejor caracterizado de defensa inmune en moscas de la fruta. Después de la infección, la respuesta humoral conduce a la producción y la liberación sistémica de péptidos antimicrobianos moléculas (AMP) en la hemolinfa, la sangre equivalente en insectos. Amperios se producen por peaje altamente conservado y vías de señalización del Imd. La vía de peaje es homólogo de mamíferos receptores TLR/IL-1R de señalización, y el camino de Imd es homólogo de mamífero Tumor necrosis factor-alpha señalización. En Drosophila, peaje señalización es inducida por bacterias Gram positivas, hongos y Drosophila X virus^6,9,10 y señalización del Imd es inducida por bacterias Gram-negativas^{11 ,12}.

Inmunidad celular, compuesto de encapsulado, melanization y fagocitosis de patógenos invasivos, llevado a cabo por células especializadas de sangre llamadas hemocitos¹³. Hay tres clases de hemocitos en la mosca de la fruta: cristal células, lamellocytes y plasmatocitos¹³. Las células de cristal, que constituyen el 5% de las circulación hemocitos de larvas, liberan enzimas proPhenoloxidase (proPO) conduce a la melanization de agentes patógenos y tejidos de host en sitios de la herida. Lamellocytes, que no se encuentran normalmente en embriones sanos o las larvas, son células adherentes que encapsulan objetos extraños. Estas células son inducidas a pupariación o parasitando huevos de avispa se depositan en las larvas. Plasmatocitos fagocitarias, que constituyen el 95% de circulación hemocitos de larvas y hemocitos restantes todos en adultos, juegan un papel en la remodelación durante el desarrollo de tejido y, en particular, como la célula efectora principal de la inmunidad celular de Drosophila .

Fagocitosis de una inmediata y crucial línea de defensa inmune innata; microbios que romper la barrera epitelial del huésped son envolvió rápidamente y eliminados por las células fagocíticas de la sangre (para un examen global de biología celular de la fagocitosis ver referencia ¹⁴). Este proceso se inicia cuando el reconocimiento de patrones codificados del germline receptores (PRRs) en hemocitos reconocen patógeno asociado patrones moleculares (PMAP) de microbios. Una vez enlazado a sus objetivos, PRRs inician cascadas de señales que conducen a la formación de pseudópodos a través de la remodelación del citoesqueleto de actina. Los pseudópodos rodean el microbio, que posteriormente se hundió e interiorizado en un orgánulo naciente, el fagosoma. Microbios se destruyen como el fagosoma somete el proceso de maduración del fagosoma cuando el fagosoma es traficada hacia el interior de la hemocyte y acidifica a través de una serie de interacciones con lisosomas. En vitro y célula biología estudios en mamíferos células primarias han sido instrumentales en la identificación y caracterización de factores que regulan la fagocitosis, como los mamíferos receptor Fc gamma y receptores de C3b^15,16. Sin embargo, se limita la capacidad para ejecutar grandes pantallas o en estudios in vivo en sistemas mamíferos.

Aquí presentamos un ensayo in vivo para la fagocitosis en moscas de la fruta adultas, que se basa en un procedimiento introducido por primera vez por el laboratorio de David Schneider en 2000¹⁷. El laboratorio de Schneider demostró que los hemocitos sésiles agrupadas a lo largo de la nave dorsal abdominal fácilmente fagocitar bacterias y granos del poliestireno. Para visualizar la fagocitosis, moscas se inyectan con fluorescencia etiquetadas partículas (tales como e. coli marcados con isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), se incubó por 30 minutos para dar tiempo de hemocitos a fagocitar las partículas y luego inyectado con trypan azul, que apaga la fluorescencia de las partículas no fagocitados durante el período de incubación. Los vasos dorsales mosca entonces son reflejados usando un microscopio fluorescente invertido. Este trabajo seminal, usando un experimento relativamente sencillo, demostrado que los hemocitos fagocitar bacterias y gotas de látex, fagocitosis bacteriana pueden ser inhibidas mediante la pre-inyección de vuela con gotas de látex, y que vuela sin celular y humoral las respuestas inmunes son susceptibles a e. coli. El análisis presentado en este informe se basa en el trabajo del laboratorio de Schneider para cuantificar la fagocitosis in vivo mediante la medición de la intensidad de fluorescencia de las partículas por hemocitos de vaso dorsal asociada.

Similar a los planteamientos en sistemas mamíferos, Drosophila genetistas utilizan inicialmente genoma pantallas de ARNi en vitro para identificar los genes necesarios para la respuesta inmune celular^{18,19,20 ,21,22,23}. Sin embargo, el desarrollo del ensayo de fagocitosis in vivo adultos permitieron experimentos seguimiento fácilmente realizarse en animales enteros, así permitiendo a los investigadores a verificar los biológicos el papel de los factores identificados en los estudios in vitro. Tal fue el caso con el receptor transmembrana Eater, que fue primero identificado como un receptor bacteriano en una pantalla de RNAi usando S2 células²⁴ y entonces más adelante demostrado para mediar la Escherichia coli (e. coli), Enterococcus faecalis, y fagocitosis de Staphylococcus aureus (S. aureus) en adultos²⁵.

Nuestro laboratorio emplea el ensayo de fagocitosis in vivo en adelantados pantallas genéticas y estudios de Asociación de genoma completo (mediante el Panel de referencia genética de Drosophila (DGRP)) para identificar nuevos genes que regulan la fagocitosis en hemocitos de adultos. Estos estudios condujeron a la caracterización de los receptores PGRP-SC1A y PGRP-SA²⁶, la vesícula intracelular trata de proteína Rab14²⁷, el glutamato transportador Polifemo²⁸, proteína de unión a RNA de Fox-1²⁹.

Esperamos que futuras pantallas incorporando la fagocitosis in vivo podrían conducir a la identificación de genes adicionales que son importantes para la inmunorespuesta celular en Drosophila. Pantallas con líneas endogámicas secuenciado completamente, como la DGRP o el recurso Drosophila de población sintética (DSPR), pueden identificar variantes naturales que afecta al desarrollo de la fagocitosis o hemocyte. Además, la técnica podría adoptada en otras especies de Drosophila o utiliza recursos de comunidad nueva pantalla, como la colección de 250 especies de Drosophila mantenida por la nacional Drosophila especie Stock Center (NDSSC ) en Cornell. Estos experimentos pueden llevarse a cabo utilizando marcada con fluorescencia bacteriano o fungicida pared biopartículas que están disponibles comercialmente o se pueden realizar usando cualquier número de especies bacterianas o por hongos – siempre que el microbio expresa marcadores fluorescentes .

Protocolo

1. preparar partículas de fluoresceína para la inyección

1. Reconstituir 10 mg de bacterias disponibles comercialmente, muertos de calor las partículas marcadas con fluoresceína (véase Tabla de materiales) a una concentración stock de 10 mg/mL mediante la adición de 990 μl estériles de 1 x PBS y 10 μl 50 mM de azida sódica. Vortex para mezclar.
   1. Dividir en 8 partes alícuotas μL en tubos de 0.2 mL de un solo uso y guardar en una caja oscura a 4 ° C para minimizar la sensibilidad asociada a la luz.
      Nota: Azida de sodio conservante es opcional y puede omitirse si se realizan acciones de 10 mg/mL con 1 mL estéril de 1 x PBS, alícuotas y almacenado a-20 ° C.
2. Hacer una solución de 10 mL de colorante de 5% en PBS 1 x mezclando 500 μl jeringa filtran alimento verde para colorear y 9,5 mL estéril de 1 x PBS.
3. Lavar las partículas antes de la inyección para eliminar la azida de sodio. Μl de la mezcla 42 estéril 1 x PBS y 8 μl de 10 mg/mL en un tubo de 1,7 mL. Centrifugar a velocidad máxima durante 2,5 min a temperatura ambiente.
   1. Eliminar el sobrenadante, agregar 50 μl de 1 x PBS y centrifugar a máxima velocidad durante 2,5 min a temperatura ambiente.
   2. Repita los pasos 1.3 y 1.3.1 x 2, para un total de 3 lavados.
   3. Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las partículas a 1,6 mg/mL en 50 μl de colorante de 5% en PBS 1 x.
   4. Envuelva el tubo de papel de aluminio para proteger de la luz. Almacenar a 4 ° C, desechar después de 1 semana.

2. preparar la estación de inyección y moscas

1. Preparar el botón de inyección. Para inyectar hasta 4 genotipos de moscas al mismo tiempo, use cinta de laboratorio para dividir una rectangular CO₂ fly cojín en 4 secciones. En el Banco cerca del microscopio, designar áreas para colocar los frascos una vez que las moscas han sido alineadas en el teclado (uno para cada esquina de la almohadilla).
2. Preparar los frascos de edad comparable, 4-7 días-viejos, moscas para la inyección. Para cada cepa a ensayar, transferir 5 machos y 5 hembras en un frasco fresco, etiquetado de los alimentos preparados de mosca y mantener a 25 ° C.
3. Preparar el inyector neumático (véase Tabla de materiales) estableciendo el instrumento en un modo de tiempo de 100 ms (ráfagas cortas de presión de gas para expulsar el líquido, lo que permite la entrega de volúmenes sub-nanoliter).
4. Preparar los portaobjetos de microscopio. Cortar tiras de 1,5 pulgadas de cinta aislante, doblar en forma de bucle con el lado adhesivo hacia fuera y coloque en un portaobjetos de microscopio etiquetado.

3. prepare agujas capilares de vidrio

1. Tire las agujas de cristal (Capillares de vidrio de paredes delgadas) utilizando un extractor de aguja.
   1. Mantener la aguja bajo el microscopio con un micrómetro y romper la punta con unas pinzas de acero inoxidable de punta fina #5. 100 μm consejos son suficientes para perforar la cutícula de la mosca minimizando hiriendo.
   2. Medir el volumen de líquido que se inyecta en cada vuelo. La aguja de carga con estériles colorante de 5% en PBS 1 x y expulsar el líquido sobre una gota de aceite mineral en un micrómetro de 0,01 mm.
      Nota: Si la gota de líquido es esférica, el volumen en picolitros se calcula como (tamaño)³/1910. ³⁰ una aguja con un diámetro de 100 μm expulsará ~ 2 nL en 100 ms.

4. Inyecte moscas

1. Pipetear 10 μl de partículas de 1,6 mg/mL en una pequeña plaza de parafilm.
   1. Tire el líquido en la aguja y montar en el inyector (véase Tabla de materiales).
   2. Anestesiar a moscas con CO₂ y se alinean en sus áreas designadas en el flypad, con la parte ventral hacia arriba y la cabeza orientada hacia la parte delantera de la almohadilla. Coloque los frascos en las áreas correspondientes en el Banco.
   3. Moscas en la parte superior del abdomen se inyectan con 5, 100 ms bombas de líquido (~ 10 total de nL).
   4. Transferir las moscas inyectadas a los viales adecuados, tenga en cuenta el tiempo en el vial. Mantener a 25 ° C.
2. Cargar una nueva aguja con 0.4% solución de azul tripán.
3. Ponga el inyector neumático en recinto cerrado, que permite un flujo constante de aire para empujar el líquido de la aguja.
4. Anestesiar a moscas después descansaron durante 30 minutos e inyecte con azul de tripán hasta que el abdomen está lleno y dilatado.
   Nota: Al examinar la maduración del fagosoma con partículas con un tinte pH-sensible, permite moscas descansar durante 1 hora y no se inyecte con trypan azul antes de montaje de moscas.
5. Montaje moscas en portaobjetos con cinta aislante, la parte ventral hacia abajo. Empuje las alas al lado de la mosca y fíjelos a la cinta. También, empuje suavemente la cabeza en la cinta para asegurar que la mosca no se moverá.
6. Inmediatamente vaya al paso 5.

5. proyección de imagen de moscas

1. Imagen vuela, a la vez, x 25 o 32 aumentos con un microscopio de fluorescencia invertido conectado a una cámara digital y computadora (véase Tabla de materiales). Se centran en el vaso dorsal de la mosca usando software de computadora para la cámara digital.
2. Registrar el tiempo de exposición y ampliación entre experimentos.
   Nota: Perder la pista de genotipos es una fuente potencial de error al fotografiar las tensiones múltiples en una sola sesión. Para evitar el etiquetado falso moscas, anote el número de la imagen de la primera y la última fotografía de mosca para cada genotipo.

6. cuantificación y normalización de la fluorescencia

1. Abra el software y abrir una imagen en un momento.
   1. Medir la intensidad de la fluorescencia del vaso dorsal. Traza un polígono en torno al vaso dorsal. Elige la medida y registrar la intensidad de fluorescencia dentro del polígono.
   2. Determinar la intensidad de la fluorescencia de fondo. Copiar el primer polígono y moverlo a un área adyacente al vaso dorsal de la mosca. Seleccione la medida y la intensidad de fluorescencia de registro de la zona de fondo.
   3. Normalizar la fluorescencia del vaso dorsal por la fluorescencia de fondo:
      Fondo de vaso dorsal ÷.
   4. Calcular que el promedio normalizado intensidad de fluorescencia de vaso dorsal de todas las moscas en una cepa.
   5. Repetir el experimento 2 veces más.
   6. Uso un estudiante de desapareado t-test para comparar las intensidades de fluorescencia relativa promedio de moscas control y prueba de vuela de los tres experimentos. Calcular el tamaño del efecto utilizando la fórmula: d de Cohen = (M₁- M₂) ÷ SD_agrupados, donde M₁ es la media de genotipo 1 y M₂ es la media de genotipo 2 y
      SD _agrupado =
      donde SD1 es la desviación estándar de genotipo 1 y SD2 es la desviación estándar de genotipo 2.

Resultados

En figura 1Ase muestra un esquema del ensayo de fagocitosis in vivo usando partículas marcados con fluoresceína. Las moscas son montado lado ventral hacia abajo en un pedazo de cinta aislante y los dos primeros segmentos del abdomen, donde se encuentra el vaso dorsal, es claramente visible (figura 1B). Principales fuentes de error experimental se presentan en la inyección y proyección de imagen pasos del procedimiento (

Discusión

Comercialmente disponibles, fluorescencia etiquetadas partículas se utilizan para evaluar fagocitosis en general (0,2 μm modificado carboxylate microesferas) o fagocitosis de microbios (marcada con fluorescencia calor o químicamente mató las bacterias o levaduras). Para evaluar la maduración del fagosoma, los investigadores pueden seleccionar partículas con un tinte pH-sensible que fluoresce cuando pH de neutro a ácido, como en el fagolisosoma. Alternativamente, para examinar los pasos iniciales de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)