Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Resumo

Em todos os animais, imunidade inata fornece uma defesa imediata e robusta contra um amplo espectro de patógenos. Respostas de imune humorais e celulares são os principais ramos da imunidade inata, e muitos dos fatores regulam estas respostas são conservados evolutivamente entre invertebrados e mamíferos. Fagocitose, o componente central da imunidade inata celular, é realizada por células especializadas do sistema imunológico. Mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem emergido como um poderoso modelo genético para investigar os mecanismos moleculares e fisiológicos impactos de fagocitose em animais inteiros. Aqui vamos demonstrar um ensaio baseado em injeção de fagocitose in vivo para quantificar a absorção de partículas e a destruição por células do sangue de Drosophila , hemócitos. O procedimento permite que os pesquisadores controlar com precisão a concentração de partículas e dose, tornando-se possível obter resultados altamente reprodutíveis em um curto espaço de tempo. O experimento é quantitativa, fácil de realizar e pode ser aplicado para esse reconhecimento do patógeno de influência, captação e afastamento de tela para fatores do hospedeiro.

Introdução

As defesas imunes inatas formam a primeira linha de defesa contra micróbios patogênicos. Estas respostas podem ser funcionalmente divididas em imunidade humoral e celular inata, ambos os quais são mediados por receptores de reconhecimento padrão germline codificado (PRRs) que detetam o patógeno associado padrões moleculares (PAMPs)¹. Muitas das vias de sinalização e mecanismos efetores da imunidade inata são conservados em mamíferos e invertebrados, como o nematódeo, Caenorhabditis elegans e a mosca da fruta, Drosophila melanogaster². A mosca de fruta tem emergido como um poderoso sistema para estudar a defesa do hospedeiro contra microorganismos infecciosos³. Drosófila é geneticamente tractable, fácil e barata, criados em laboratórios e tem um tempo de geração curto. Além disso, a mosca da fruta apresenta defesas altamente eficientes contra uma matriz de micróbios, permitindo que o exame da imunidade do hospedeiro contra patógenos virais, bacterianas, fúngicas ou parasitárias.

Drosófila imunologistas historicamente utilizaram telas genéticas para a frente, todo o genoma mediada por RNA interferência (RNAi seleção de linhas de células de inseto e pré-existentes cepas moscas mutantes para examinar a imunidade inata – levando à) identificação e caracterização de vários caminhos imune humoral evolutivamente conservada^4,5,6,7,8. A resposta imune inata humoral é, sem dúvida, o melhor caracterizada a defesa imunológica em moscas de fruta. Após a infecção, a resposta humoral leva para a produção e liberação sistêmica de peptídeo antimicrobiano moléculas (AMP) para a hemolinfa, o sangue equivalente em insetos. Amplificadores são produzidos pelo pedágio altamente conservado e Imd vias de sinalização. O pathway pedágio é homólogo de mamíferos receptor TLR/IL-1R sinalização e via Imd é homóloga à sinalização de mamíferos de fator de necrose tumoral-alfa. No pedágio da drosófila, sinalização é induzida por bactérias gram-positivas, fungos e Drosophila X virus^6,9,10 e Imd sinalização é induzida por bactérias Gram-negativas^{11 ,12}.

Imunidade celular, composta de encapsulamento, melanização e fagocitose de patógenos invasivos, realizada por células especializadas de sangue chamadas de hemócitos¹³. Existem três classes de hemócitos na mosca da fruta: cristal células, lamellocytes e plasmatocytes¹³. Pilhas de cristal, que compõem 5% dos hemócitos circulantes em larvas, liberam enzimas proPhenoloxidase (proPO) levando a melanização de agentes patogénicos e tecidos do hospedeiro em locais da ferida. Lamellocytes, que normalmente não são encontrados em embriões saudáveis ou larvas, são células aderentes que encapsulam objetos estranhos. Estas células são induzidas mediante pupariation ou quando parasitam ovos de Vespa são depositados em larvas. Plasmatocytes fagocíticas, que compõem 95% da circulação hemócitos em larvas e todos os restantes hemócitos em adultos, desempenhar um papel no tecido remodelação durante o desenvolvimento e, nomeadamente, servir como a célula principais efetoras da imunidade celular de Drosophila .

Fagocitose uma linha imediata e crucial de defesa imune inata; micróbios que quebrou a barreira epitelial do hospedeiro são rapidamente tragados e eliminados por células fagocíticas (para uma revisão abrangente da biologia das células de fagocitose consulte referência ¹⁴). Esse processo é iniciado quando o reconhecimento de padrões codificados germline receptores (PRRs) sobre hemócitos reconhecem patógenos associados a padrões moleculares (PAMPs) de micróbios. Uma vez acoplado para seus destinos, PRRs iniciem cascatas de sinalização que levam à formação de pseudopods através da remodelação de citoesqueleto de actina. Os pseudopods cercam o micróbio, que posteriormente é engolido e interiorizado em uma organela nascente, o fagossomo. Os micróbios são destruídos como o fagossoma sofre o processo de maturação do fagossoma quando o fagossoma é traficado para o interior do hematócito e acidifica através de uma série de interações com lisossomos. Em vitro e célula de estudos de biologia em células de mamíferos primária têm sido fundamentais para identificar e caracterizar os fatores que regulam a fagocitose, como os mamíferos do Fc-gama e C3b receptores^15,16. No entanto, a capacidade de executar telas em grande escala ou estudos in vivo são limitadas nos sistemas dos mamíferos.

Aqui nós apresentamos um ensaio in vivo para fagocitose em adultos de moscas de fruta, que é baseado em um procedimento introduzido pelo laboratório de David Schneider em 2000¹⁷. O laboratório de Schneider mostrou que sessile hemócitos agrupados ao longo do vaso dorsal abdominal prontamente fagocitam bactérias e esferas de poliestireno. Para visualizar a fagocitose, moscas são injetadas com partículas fluorescente etiquetadas (tais como Escherichia coli rotulado com isotiocianato de fluoresceína (e. coli -FITC)), incubadas durante 30 minutos para permitir que o tempo de hemócitos engolir as partículas e então injetado com trypan azul, que sacia a fluorescência de partículas não fagocitados durante o período de incubação. Voar vasos dorsais são então fotografados usando um microscópio fluorescente invertido. Este trabalho seminal, utilizar um experimento relativamente simples, demonstrado que hemócitos fagocitam bactérias e grânulos de látex, a fagocitose bacteriana podem ser inibidos pela pre-injeção de moscas com grânulos de látex, e que voa sem celular e humoral respostas imunes são suscetíveis nem de Escherichia coli. O ensaio apresentado neste relatório baseia-se o trabalho do laboratório Schneider para quantificar a fagocitose in vivo medindo a intensidade da fluorescência das partículas tragado por hemócitos vaso dorsal associado.

Semelhante à abordagem tomada nos sistemas dos mamíferos, Drosophila geneticistas inicialmente usado todo o genoma in vitro RNAi telas para identificar genes necessários para a resposta imune celular^{18,19,20 ,21,22,23}. No entanto, o desenvolvimento do ensaio fagocitose in vivo adulto habilitado experimentos de acompanhamento a efectuar facilmente em animais inteiros, permitindo assim que os investigadores para verificar o biológico o papel dos factores identificados em estudos in vitro. Tal foi o caso com o receptor do transmembrane comedor, que foi identificada pela primeira vez como um receptor bacteriano em uma tela de RNAi usando S2 células²⁴ e então mais tarde mostrada para mediar a Escherichia coli (e. coli),, Enterococcus faecalis, e fagocitose de Staphylococcus aureus (S. aureus) em adultos²⁵.

Nosso laboratório empregou o ensaio in vivo de fagocitose em telas de genéticas para a frente e estudos de associação de genoma-largo (usando o painel de referência genética drosófila (DGRP)) para identificar novos genes que regulam a fagocitose de hemócitos adultos. Estes estudos levaram à caracterização os receptores PGRP-SC1A e PGRP-SA²⁶, a vesícula intracelular tráfico de proteína Rab14²⁷, o glutamato transportador Polifemo²⁸e RNA-proteína obrigatória Fox-1²⁹.

Nós antecipamos que futuras telas incorporando a fagocitose in vivo podem levar à identificação de genes adicionais que são importantes para a resposta imune celular em Drosophila. Telas usando linhas puras totalmente sequenciado, tais como o DGRP ou a drosófila sintético população recurso (DSPR), podem identificar variantes naturais que afectam a fagocitose ou hematócito desenvolvimento. Além disso, a técnica poderia ser adotada em outras espécies de Drosophila ou usada para recursos da comunidade nova tela, como a coleção de 250 espécies de Drosophila , mantido pelo nacional drosófila espécie Stock Center (NDSSC ) em Cornell. Estas experiências podem ser realizadas usando fluorescente-etiquetadas bacteriana ou fúngica-parede bioparticles que estão disponíveis comercialmente, ou podem ser realizadas usando qualquer número de espécies bacterianas ou fúngicas – desde que o micróbio expressa marcadores fluorescentes .

Protocolo

1. prepare as partículas de fluoresceína para injeção

1. Reconstituir a 10 mg de disponíveis comercialmente, calor-matou as bactérias partículas marcadas com fluoresceína (ver Tabela de materiais) a uma concentração das ações de 10 mg/mL, adicionando 990 µ l estéril 1X PBS e 10 µ l 50 milímetros de azida de sódio. Vórtice de misturar.
   1. Divida em 8 alíquotas de µ l descartáveis em tubos de 0,2 mL e armazenar em uma caixa escura a 4 ° C para minimizar a sensibilidade associada à luz.
      Nota: Azida de sódio conservante é opcional e pode ser omitida se a existências de 10mg/mL são feitas com 1 mL estéril 1X PBS, aliquotadas e armazenado a-20 ° C.
2. Fazer uma solução de 5% corante em 1X PBS misturando 500 µ l seringa filtrada alimento verde para colorir e 9,5 mL estéril 1X PBS 10 mL.
3. Lave as partículas antes da injeção para remover a azida de sódio. Mix 42 µ l estéril 1 x PBS e 8 µ l de 10 mg/mL em um tubo de 1,7 mL. Centrifugar a velocidade máxima de 2,5 min à temperatura ambiente.
   1. Remover o sobrenadante, adicionar 50 µ l 1 x PBS e centrifugar a velocidade máxima para 2,5 min à temperatura ambiente.
   2. Repita as etapas de 1.3 e 1.3.1 x 2, para um total de 3 lavagens.
   3. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante e ressuspender as partículas a 1,6 mg/mL em 50 µ l de corante de 5% em PBS 1x.
   4. Enrole o tubo em papel alumínio para proteger da luz. Armazenar a 4 ° C, descarte após 1 semana.

2. preparar a estação de injeção e moscas

1. Prepare a almofada de injeção. Para injetar até 4 genótipos de moscas ao mesmo tempo, uso fita de laboratório para dividir uma retangular CO₂ mosca almofada em 4 seções. No banco perto do microscópio, designe áreas para colocar os frascos, uma vez que foram chamadas moscas no teclado (um para cada canto da almofada).
2. Preparar frascos de idade correspondente, 4-7 dias-velhas, moscas para injeção. Para cada tensão a ser testado, transferir 5 machos e 5 fêmeas para um tubo de fresco, etiquetado de alimentos preparados voar e manter a 25 ° C.
3. Preparar o injetor pneumático (veja a Tabela de materiais), definindo o instrumento para um modo de temporizado 100 ms (rajadas curtas de pressão do gás para expulsar o líquido – permitindo a entrega de volumes de subnanolitros).
4. Prepare as lâminas de microscópio. Cortadas tiras de 1,5 polegadas de fita isolante, dobre em forma de laço com o lado adesivo para fora e coloque numa lâmina de microscópio rotulada.

3. prepare agulhas capilar de vidro

1. Puxe o vidro agulhas (capilares de vidro de parede fina) usando um extrator de agulha.
   1. Segure a agulha sob o microscópio com um micrômetro e quebrar a ponta usando #5 pinças de aço inoxidável de ponta fina. 100 µm dicas são suficientes para furar a cutícula da mosca, minimizando ferindo.
   2. Medir o volume de líquido que será injetado em cada mosca. Carregar a agulha estéril 5% corante em PBS 1x e expelir o líquido sobre uma gota de óleo mineral em um micrômetro de palco de 0.01 mm.
      Nota: Se a gota de líquido é esférica, o volume em picoliters é calculado como (tamanho)³/1910. ³⁰ uma agulha com um diâmetro de 100 µm ejetará ~ 2 nL em 100 ms.

4. injetar moscas

1. Pipete 10 µ l de partículas de 1,6 mg/mL em uma pequena praça de parafilme.
   1. Puxar o líquido para a agulha e montar no bico injetor (ver Tabela de materiais).
   2. Anestesiar moscas com CO₂ e alinhá-las em sua área designada no flypad, com o lado ventral para cima e as cabeças voltadas para a frente da almofada. Colocar os frascos em áreas correspondentes no banco.
   3. Injete moscas no canto superior do abdómen com 5, bombas de 100 ms do líquido (total de ~ 10 nL).
   4. Transferir as moscas injetadas para os frascos apropriados, observe o tempo no rótulo do frasco. Manter a 25 ° C.
2. Carregar uma nova agulha com 0,4% solução de azul de Tripan.
3. Defina o injetor pneumático para GATED, que permite um fluxo constante de ar para empurrar o líquido fora a agulha.
4. Anestesiar moscas depois de eles tem descansado por 30 min e injetar com Trypan azul até o abdômen distendido e completo.
   Nota: Ao examinar a maturação do fagossoma com partículas rotuladas com um corante sensíveis ao pH, permitir moscas descansar por 1 h e não injetar com trypan azul antes de moscas de montagem.
5. Monte voa em corrediças do microscópio com fita isolante, lado ventral para baixo. Empurre as asas para o lado da mosca e fixe-os com a fita. Também, empurre suavemente a cabeça para a fita para garantir que a mosca não se moverá.
6. Afastar-se imediatamente para a etapa 5.

5. imagem de moscas

1. Imagem voa, um de cada vez, no x 25 ou 32 ampliação de x usando um microscópio de fluorescência invertido ligado a uma câmera digital e computador (consulte a Tabela de materiais). Focar o vaso dorsal da mosca usando software de computador para a câmera digital.
2. Registre o tempo de exposição e ampliação entre experiências.
   Nota: Perder a noção de genótipos é uma potencial fonte de erro quando fotografar estirpes múltiplas em uma única sessão. Para evitar moscas de tachar, anote o número de imagem da primeira e última fotografia voar para cada genótipo.

6. quantificar e normalizando a fluorescência

1. Abra o software e abra uma imagem de cada vez.
   1. Medir a intensidade da fluorescência do vaso dorsal. Desenhe um polígono ao redor do vaso dorsal. Selecione a medida e registro da intensidade de fluorescência dentro do polígono.
   2. Determine a intensidade de fluorescência do fundo. Copie o primeiro polígono e movê-lo para uma área adjacente ao vaso dorsal da mosca. Selecione a medida e intensidade de fluorescência registro da área de plano de fundo.
   3. Normalize a fluorescência de vaso dorsal por fluorescência do fundo:
      Fundo de ÷ vaso dorsal.
   4. Calcule que a média normalizada a intensidade de fluorescência vaso dorsal de todas as moscas em uma cepa.
   5. Repita a experiência 2 vezes mais.
   6. Uso um estudante está pareado t-teste para comparar as intensidades de fluorescência relativa média de controle de moscas e testar voa das experiências de três. Calcular o tamanho de efeito usando a fórmula: Cohen d = (₁M - M₂) ÷ SD_{em pool}, onde M₁ é a média do genótipo 1 e M₂ é a média de genótipo 2 &
      SD _{em pool} =
      onde SD1 é o desvio padrão de genótipo 1 e SD2 é o desvio padrão de genótipo 2.

Resultados

Um esquema do ensaio in vivo de fagocitose partículas de fluoresceína-etiquetado é mostrado na figura 1A. Moscas são montado lado ventral para baixo em um pedaço de fita isolante e os dois primeiros segmentos do abdome, onde se encontra o vaso dorsal, é claramente visível (figura 1B). Principais fontes de erro experimental surgem em etapas do processo (Figura 1) de imagem e a injeção. Usando...

Discussão

Comercialmente disponíveis, fluorescente etiquetadas partículas são utilizadas para avaliar a fagocitose em geral (0,2 µm carboxilato-modificado microesferas) ou fagocitose de micróbios (fluorescente-etiquetadas calor - ou quimicamente matou as bactérias ou leveduras). Para avaliar a maturação do fagossoma, pesquisadores podem selecionar partículas rotuladas com um pH sensíveis corante fluorescente quando o pH diminui de neutro a ácido, como a fagolisossoma. Como alternativa, para examinar os pass...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)