Оценка клеточный иммунный ответ плодовой мушки Drosophila melanogaster, используя Assay фагоцитоза в естественных условиях

Резюме

Этот протокол описывает в естественных условиях фагоцитоза assay в взрослых Drosophila melanogaster для количественного определения фагоцитарной признание и распродажа микробной инфекции.

Аннотация

У всех животных врожденного иммунитета обеспечивает немедленное и надежное обороны против широкого спектра патогенных микроорганизмов. Гуморальный и клеточный иммунный ответ являются основными отраслями врожденного иммунитета, и многие факторы, регулирующие эти ответы эволюционно консервируют между беспозвоночных и млекопитающих. Фагоцитоз, центральный компонент клеточной врожденного иммунитета, осуществляется специализированными кровяных клеток иммунной системы. Плодовой мушки Drosophila melanogaster, стала мощным генетических модель для изучения молекулярных механизмов и физиологические последствия фагоцитоза в целом животных. Здесь мы показываем на основе инъекции в естественных условиях фагоцитоза assay для количественного определения поглощения частиц и уничтожения клетками крови дрозофилы , hemocytes. Процедура позволяет исследователям точно контролировать концентрации частиц и дозы, что позволяет получить высокую воспроизводимость результатов в короткий промежуток времени. Эксперимент, количественных, легко выполнить и может быть применен к экран для принимающей факторов, что влияние возбудителя признание, поглощение и распродажа.

Введение

Врожденной иммунной защиты являются первой линией обороны против болезнетворных микробов. Эти ответы могут быть функционально разделена на гуморальный и клеточный врожденного иммунитета, оба из которых являются опосредовано кодировке микрофлорой шаблон признание рецепторов (ПРРС) которые чувствуют патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs)¹. В млекопитающих и беспозвоночных, таких как нематода, Caenorhabditis elegans и плодовой мушки Drosophila melanogaster²сохраняются многие из сигнальные пути и механизмы эффекторных врожденного иммунитета. Плодовая муха стала мощной системы для изучения принимающей обороны против инфекционных микроорганизмов³. Дрозофилы генетически шансов справиться с возникающими, легко и недорого, выращенные в лабораториях и имеет время коротких поколения. Кроме того фрукты fly экспонатов высокоэффективных оборону против массив микробов, позволяя рассмотрение принимающих иммунитет против вирусных, бактериальных, грибковых или паразитарные патогенов.

Дрозофилы иммунологов исторически использовали вперед генетических экраны, геном общесистемной РНК опосредованной вмешательства (RNAi) скрининг насекомых клеточных линий и существующие мутант летать штаммов для изучения врожденного иммунитета – приводит к определение и характеристика несколько эволюционно сохранены гуморального иммунного пути^4,5,6,,78. Врожденное гуморальный иммунный ответ, вероятно, лучший характеризуется иммунной обороны в плодовых мух. После инфекции гуморальный ответ приводит к производства и системных выпуска антимикробного пептида (AMP) молекул в гемолимфа, крови, эквивалент в насекомых. Усилители производятся высоко сохранены платных и Imd, сигнальные пути. Путь платных гомологичных для млекопитающих рецепторы TLR/Ил 1R сигнализации, и путь Imd гомологичных млекопитающих фактор некроза опухоли альфа сигнализации. В платных дрозофилы, сигнализации индуцируется грамположительных бактерий, грибов и Виру дрозофилы Xs^6,9,10 и Imd сигнализации индуцируется грамотрицательных бактерий^{11 ,12}.

Клеточный иммунитет, состоящая из инкапсуляции, melanization и фагоцитоз инвазивных патогенов, осуществляют специализированные клетки крови, называемые hemocytes¹³. Существует три класса hemocytes в плодовой мухи: кристалл клетки, lamellocytes и plasmatocytes¹³. Кристалл клетки, которые составляют 5% циркулирующего hemocytes в личинки, выпуск proPhenoloxidase (редложить) ферментов приводит к melanization патогенов и принимающих тканей на участках раны. Lamellocytes, которые обычно не встречаются в здоровых эмбрионов или личинок, являются адэрентных клеток, которые инкапсулируют посторонних предметов. Эти клетки наведены на pupariation или когда паразитирующих осы яйца залегают в личинки. Фагоцитирующих plasmatocytes, которые составляют 95% циркулирующих hemocytes в личинок и все остальные hemocytes в взрослых, играть определенную роль в ткани, Ремоделирование во время разработки и, в частности, служат в качестве основных эффекторных клеток дрозофилы клеточного иммунитета.

Фагоцитоз немедленное и решающее значение линии иммунной защиты; микробы, которые нарушают принимающей эпителиальных барьер быстро охватил и устраняется фагоцитирующих клеток крови (всеобъемлющий обзор клеточной биологии фагоцитоза см. в Справочник ¹⁴). Этот процесс инициируется при кодировке микрофлорой распознавание рецепторов (ПРРС) на hemocytes признать возбудителя связанные молекулярные структуры (PAMPs) микробов. Когда-то привязаны к их цели, РРСС инициировать сигнальных каскадов, которые приводят к образованию ложноножки через ремоделирования Цитоскелет актина. Ложноножки окружают Микроб, который впоследствии охватил и включены в зарождающейся органеллы, фагосомы. Микробы уничтожаются как фагосомы проходит процесс созревания фагосомы, когда фагосомы торговли в глубь кровяные и подкисляет через серию взаимодействий с лизосом. In vitro и ячейки биологии исследования в mammalian клетках первичной играют важную роль в идентификации и установлению характеристик факторов, которые регулируют фагоцитоза, например млекопитающих Fc-гамма-рецептор и C3b рецепторов^,1516. Тем не менее возможность выполнения крупномасштабных экраны или в естественных условиях исследования ограничены в mammalian системами.

Здесь мы представляем в естественных условиях assay для фагоцитоза в взрослых плодовых мух, которая основана на процедуре, впервые представленный в лаборатории Дэвида Шнайдер в 2000 году¹⁷. Шнайдер лаборатории показали, что скальный hemocytes кластерного вдоль брюшной спинной судна легко фагоцитировать шарики полистироля и бактерий. Чтобы визуализировать фагоцитоза, мух вводят с дневно обозначенные частиц (например, кишечной палочки с флуоресцеин Изотиоцианаты (E. coli -FITC)), инкубировали 30 минут позволить hemocytes время, чтобы поглотить частицы, а затем вводится с Трипановый синий, который утоляет флуоресценции частиц не phagocytosed во время инкубационного периода. Затем весь спинной судов отражаются с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные. Этот семенных бумаги, используя сравнительно простой эксперимент, показали, что hemocytes фагоцитоз бактерий и латексные шарики, что бактериальных фагоцитоза могут тормозится предварительно инъекций летит с латексные шарики, и что летает без клеточных и гуморальных иммунные реакции даже подвержен кишечной палочки. Анализа, представленные в настоящем докладе основывается на результатах работы Шнайдер лаборатории для количественного определения в естественных условиях фагоцитоза путем измерения интенсивности флуоресценции частиц, обхватил спинной судно связанного hemocytes.

Подобно подходу, применяемому в mammalian системами, генетики дрозофилы первоначально используется генома всей в vitro RNAi экраны для идентификации генов, необходимых для клеточный иммунный ответ^{18,19,20 ,21,22,23}. Однако развитие взрослых в естественных условиях фагоцитоза assay включен последующих экспериментов, чтобы легко осуществляться в целом животных, таким образом позволяя исследователям для проверки биологического роль факторов, выявленных в исследования in vitro. Так обстояло дело с трансмембранного рецептор Eater, которая была впервые выявлена как бактериальный рецептор RNAi на экране с помощью S2 клетки²⁴ и затем позднее показано посредником Escherichia coli (E. coli), Enterococcus faecalis, и золотистый стафилококк (S. aureus) фагоцитоза в взрослых²⁵.

Наша лаборатория занятых в естественных условиях фагоцитоза assay вперед генетических экранов и генома всей ассоциации исследований (с использованием дрозофилы группа генетических ссылки (DGRP)) для выявления роман гены, которые регулируют фагоцитоза в взрослых hemocytes. Эти исследования привели к характеристике рецепторов PGRP-SC1A и PGRP-са²⁶, внутриклеточный везикул людьми белка Rab14²⁷, глютамат транспортер Полифем²⁸и RNA-связывая протеин Фокс-1²⁹.

Мы ожидаем, что будущие экраны, включения в естественных условиях фагоцитоза может привести к выявлению дополнительных генов, которые являются важными для клеточный иммунный ответ у дрозофилы. Экраны с помощью полностью виртуализированных инбредных линий, таких как DGRP или дрозофилы ресурсов синтетических населения (DSPR), можно определить природные варианты влияющие фагоцитоза или кровяные развития. Кроме того техника может быть принят в других видов дрозофила или используется для экрана нового сообщества ресурсы, такие как коллекции 250 видов дрозофилы , поддерживали центр фондовой (NDSSC видов национальной дрозофилы ) в Корнелльском университете. Эти эксперименты может осуществляться с помощью дневно меченых бактериальной или грибковой стенки bioparticles, которые доступны коммерчески или может осуществляться с помощью любое количество бактериальных или грибковых видов-условии, что микроб выражает флуоресцентные маркеры .

протокол

1. Подготовьте флуоресцеин частиц для инъекций

1. Воссоздания 10 мг коммерчески доступных, жар убитые бактерий частицы, помечены флюоресцеином (см. Таблицу материалы) на складе концентрации 10 мг/мл, добавляя 990 мкл стерильные ПБС и азид натрия 50 мм 10 мкл. Вихрь смешивать.
   1. Разделите на 8 мкл аликвоты одноразового использования в 0,2 мл пробирок и хранить в темной коробке при 4 ° C для сведения к минимуму связанного светочувствительность.
      Примечание: Азид натрия предохранитель является необязательным и может быть опущено, если акции 10 мг/мл с 1 мл стерильного ПБС, aliquoted и хранятся при температуре-20 ° C.
2. Сделайте раствор 10 мл 5% пищевой краситель в однократном ПБС, смешивая 500 мкл шприц фильтруют зеленый food окраску и 9,5 мл стерильного ПБС.
3. Вымойте частиц до инъекции для удаления азид натрия. Мкл стерильные 1 Mix 42 x PBS и 8 мкл 10 мг/мл в 1,7 мл трубку. Центрифуга на Макс скорость за 2,5 мин при комнатной температуре.
   1. Удалить супернатант, добавьте 50 мкл 1 x PBS и центрифуги на Макс скорость за 2,5 мин при комнатной температуре.
   2. Повторите шаги 1.3 и 1.3.1 2 x, для в общей сложности 3 стирок.
   3. После окончательного вымыть удалить супернатант и вновь приостановить частиц 1,6 мг/мл в 50 мкл 5% пищевой краситель в однократном ПБС.
   4. Оберните трубу в алюминиевой фольги для защиты от света. Хранить при 4 ° C, выбросьте после 1 недели.

2. Подготовьте инъекции станции и мух

1. Подготовьте площадку инъекции. Придать до 4 генотипов мух в то же время, использование лабораторных Лента разделить прямоугольной Муха₂ CO площадку на 4 секции. На скамейке рядом с микроскопом обозначения районов для размещения флаконов после мухи были выстроились на площадку (один для каждого угла площадки).
2. Подготовить ампул по возрасту совпадают, 4-7 дней-старый, мух для инъекций. Для каждого штамма проверяемый передача 5 кобелей и 5 сук в свежий, обозначенные флакон полуфабрикаты покупать и хранить при температуре 25 ° C.
3. Подготовить пневматические форсунки (см. Таблицу материалы), установив инструмент в 100 мс (короткие всплески давления газа высылать жидкости – позволяя доставки суб nanoliter томов) временный режим.
4. Подготовьте скольжениях микроскопа. Вырежьте полоски 1,5 дюймовый изоленты, сложить в петлю с клейкой стороной наружу и место на обозначенные микроскопа.

3. подготовить стеклянные капиллярные иглы

1. Вытяните стекла иглы (тонкие стены стеклянные капилляры) с помощью иглы съемник.
   1. Удерживая иглу под микроскопом с микрометра и разорвать отзыв, используя пинцет из нержавеющей стали тонкой точке #5. 100 мкм советы являются достаточными для прокалывания мухи кутикулы при сведении к минимуму ранив.
   2. Измерьте объем жидкости, которые будут вводиться в каждом летать. Загрузить игла с стерильных 5% пищевой краситель в однократном ПБС и высылать жидкость на падение минерального масла на стадии микрометра 0,01 мм.
      Примечание: Если жидкие капли имеет сферическую форму, объем в пиколитров рассчитывается как (размер)³/1910. ³⁰ иглы диаметром 100 мкм будет извлечь ~ 2 nL в 100 мс.

4. внедрить мух

1. Пипетка 10 мкл частиц 1,6 мг/мл на небольшой площади парафина.
   1. Забирают жидкость в иглу и смонтировать в сопло инжектора (см. Таблицу материалы).
   2. Анестезировать мух с CO₂ и выстроить их в их участком на flypad, с вентральной стороне вверх и руководителями, ориентированные на передней панели. Место флаконов в соответствующих областях на скамейке.
   3. Придать летит в верхней части живота с 5, 100 мс насосы жидкости (~ 10 nL всего).
   4. Передать соответствующие флаконы вводят мух, обратите внимание на время на флаконе. Хранить при температуре 25 ° C.
2. Загрузить новый игла с 0,4% Трипановый синий раствор.
3. Установите пневматические форсунки УСЛОВНЫЙ, который позволяет постоянный поток воздуха, чтобы подтолкнуть жидкость из иглы.
4. Анестезировать мух, после того, как они отдыхали на 30 минут и вводить с Трипановый синий, до тех пор, пока живот полный и растянутый.
   Примечание: При рассмотрении фагосомы созревания с частицами, помечены с рН чувствительных красителя, позволяют мух на отдых за 1 час и не вводите с Трипановый синий до монтажа мух.
5. Гору летит на скольжениях микроскопа с изоляционной лентой, вентральной стороне вниз. Нажимай на стороне лету крылья и закрепите их на ленту. Кроме того аккуратно вставьте головку в ленту, чтобы обеспечить, что летать не будет двигаться.
6. Сразу перейти к шагу 5.

5. Визуализация мух

1. Изображение плавает, один в то время, 25 x или 32 кратном увеличении с помощью микроскопа Перевернутый флуоресценции придает цифровой камеры и компьютера (см. Таблицу материалы). Сосредоточиться на спинной корабля летать с помощью компьютерного программного обеспечения для цифровой камеры.
2. Запишите время экспозиции и увеличение между экспериментов.
   Примечание: Теряя генотипов является потенциальным источником ошибки при фотографировании несколько штаммов в один присест. Чтобы избежать неправильной мух, запишите номер изображения первого и последнего летать фотографии для каждого генотипа.

6. Количественная оценка и нормализующее флюоресценция

1. Откройте программное обеспечение и одного изображения за один раз.
   1. Измеряют интенсивность флуоресценции спинной судна. Нарисуйте многоугольник вокруг спинной судна. Выберите меру и записывать интенсивности флуоресценции внутри полигона.
   2. Определите интенсивность флуоресценции фона. Скопируйте первый полигона и переместить его в районе, прилегающем к спинной корабля летать. Выберите меру и запись флуоресценции интенсивности области фона.
   3. Нормализовать флуоресценции спинной судна по флуоресценции фон:
      Дорсальная судно ÷ фон.
   4. Вычислить среднее нормированный интенсивности флуоресценции спинной судна всех мух в штамм.
   5. Повторите эксперимент 2 еще раз.
   6. Использование студентом непарные t-тест для сравнения средняя относительная флуоресценции интенсивности управления мух и проверить летит из трех экспериментов. Рассчитать размер эффекта, используя формулу: Коэна d = (₁M - M₂) ÷ SD_пула, где M₁ среднее генотипа 1 и M₂ среднее генотипа 2 &
      SD _{обобщённые} =
      где SD1 — стандартное отклонение генотипа 1 и SD2 — стандартное отклонение генотипа 2.

Результаты

Схема анализа в естественных условиях фагоцитоза, с использованием меченных флуоресцеин частиц показан на рисунке 1A. Мухи вентральной боковых вниз на куском изоленты и первых двух сегментов живота, где находится спинной судно, ясно видны (р...

Обсуждение

Коммерчески доступных, дневно обозначенные частиц используются для оценки фагоцитоза в целом (0,2 мкм карбоксилат модифицированные микросферы) или фагоцитоза микробов (дневно меченых тепло - или химически убил бактерий или дрожжи). Чтобы оценить фагосомы созревания, исследовате?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2μm Red Fluorescent Carboxylate Modified FluoSpheres	Invitrogen	F8810	Fluorescently-labeled latex beads to test general phagocytic capacity of phagocytes. (~580/~605 nm) Inject a 1:20 dilution in PBS with 5% dye.
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	E13231	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~495/~519 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	E23370	Killed E. coli labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~590/~617 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Texas Red conjugate	Invitrogen	E2863	Killed E. coli labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~595/~615 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	P35361	Killed E. coli labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-negative bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
pHrodo Red S. aureus BioParticles Conjugate for Phagocytosis	Invitrogen	A10010	Killed S. aureus labeled with pHrodo Red. Use to test phagocyte reconition, uptake, and phagosome maturation of gram-positve bacteria. (~560/~585 nm). No need to quench with Trypan Blue.
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms “TIMED” mode.
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	S23371	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~495/~519 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	S23372	Killed S. aureus labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~590/~617 nm)
S. aureus (Wood Strain without protein A) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2851	Killed S. aureus labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-positive bacteria. (~494/~518 nm)
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.
ZEISS SteREO Microscope (Discovery.V8)	Zeiss	SteREO Discovery.V8	Inverted fluorescence microscope for imaging flies. Use a digital camera (example: AxioCam HC camera) and the accompanying software (example: AxioVision 4.7 software) to take pictures.
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate	Invitrogen	Z23373	Killed labeled with Alexa Fluor 488. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~495/~519 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 594 conjugate	Invitrogen	Z23374	Killed labeled with Alexa Fluor 594. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~590/~617 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	Z2841	Killed labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~494/~518 nm)
Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae) BioParticles, Texas Red	Invitrogen	Z2843	Killed labeled with Texas Red. Use to test phagocyte recogntion and uptake of yeast. (~595/~615 nm)