מלכודת droplet דיגיטלית (ddTRAP): הסתגלות פרוטוקול Telomere חזרה הגברה על תגובת שרשרת התגובה של רביב דיגיטלי

Summary

הצלחנו להמיר בהצלחה את התקן טלומר חוזר פרוטוקול (מלכודת) האפשרות להיות מועסק בתגובות שרשרת droplet דיגיטלית פולימראז. שיטת הפעולה החדשה, הנקראת ddtrap, רגישה יותר וכמותית, ומאפשרת זיהוי טוב יותר וניתוח סטטיסטי של פעילות טלומראז בתוך תאים אנושיים שונים.

Abstract

הפרוטוקול של הגברה חוזרת של טלומר (TRAP) הוא הדבר הנפוץ ביותר לזיהוי פעילות טלומר בתוך מדגם נתון. השיטה המבוססת על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מאפשרת מדידות איתנות של פעילות אנזימים ממרבית תאי התאים. המלכודת המבוססת על ג'ל עם התווית התחל מגבילה את התפוקה לדוגמה, והיכולת לזהות הבדלים בדגימות מוגבלת לשני שינויים מתקפל או גדולים יותר בפעילות האנזים. המלכודת ה-droplet הדיגיטלית, ddTRAP, היא גישה רגישה מאוד ששונתה מתוך מבנה המלכודת המסורתי, מה שמאפשר למשתמש לבצע ניתוח מעמיק על 96 דגימות לכל הפעלה ולהשיג קוונפיקציה מוחלטת של ה-DNA (telomerase מוצרים הרחבה ) בתוך כל ה-PCR. לכן, שיטת ddtrap שפותחה לאחרונה גוברת על המגבלות של שיטת ההשמנה המסורתית ג'ל מבוססת ומספקת גישה יעילה יותר, מדויקת וכמותית למדידת פעילות טלומראז בתוך המעבדה והגדרות קליניות.

Introduction

טלומרים הם מתחמי DNA-פרוטאין דינמיים בקצות כרומוזומים ליניאריים. טלומרים אנושיים מורכבים ממערך של 5 '-TTAGGG_n hexameric חוזר אשר משתנה באורך בין 12 – 15 קילו (kb) בלידה¹. מחיקת האדם, האנזים הריבונאופלפרוטאין השומר על הטלומרים, זוהה לראשונה ב-"הלה תאי" (קו תאי סרטן)². יחד, טלומרים ו טלומרים לשחק תפקיד מרכזי בספקטרום של תהליכים ביולוגיים כגון הגנת הגנום, תקנות גנים, סרטן תאים אלמוות^3,4,5,6.

האדם טלומראז מורכב בעיקר של שני מרכיבים מרכזיים, כלומר טלומראז הפוכה הטרנסקריפטאז ו טלומראז RNA (htert ו htert, בהתאמה). החלבון התחתי, htert, הוא מרכיב הפוכה פעיל היפוך הטרנססקריפט של האנזים טלומראז. תבנית RNA, hterc, מספקת טלומראז עם התבנית כדי להרחיב ו/או לשמור טלומראז. לרוב הרקמות הגופניות האנושיות אין פעילות מוחקת. חוסר היכולת של דנ א פולימראז להאריך את סופו של בפיגור של ה-dna יחד עם חוסר של טלומראז מוביל את הקיצור המתקדם של טלומראז לאחר כל סיבוב של החטיבה התאית. תופעות אלו מובילות לקיצור ברוב התאים הסומטיים עד שהם מגיעים לאורך מקוצר ביקורתי, לפיו תאים נכנסים למצב של הזדקנות מחודשת. המספר המקסימלי של פעמים תא יכול לחלק מוכתב על ידי האורך שלה טלומר ובלוק זה להמשך החטיבה התא הוא חשב למנוע התקדמות אונגנזה⁷. תאים סרטניים מסוגלים להתגבר על הזדקנות המושרה telomere ולהמשיך להתרבות על ידי ניצול telomere כדי לשמור על telomere שלהם. כ 90% של סרטן להפעיל טלומראז, מה שהופך פעילות טלומראז חשוב באופן ביקורתי בזיהוי וטיפול בסרטן.

ההתפתחות של שיטת המלכודת בשנות ה-90 הייתה אינסטרומנטלית בזיהוי המרכיבים הנחוצים של האנזים הטלומראז, כמו גם למדידת היקף התאים והרקמות, הן נורמליות והן סרטניים. שיטת ה-PCR המקורית המבוססת על ג'ל השתמשה ברדיוגנטית מתייגת מצעים DNA כדי לזהות פעילות טלומראז. בשנת 2006, העיבוד הותאם לצורה לא רדיואקטיבית באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים^8,9. באמצעות fluorescently אופן התווית מצעים, המשתמשים הצליחו להמחיש את מוצרי ההרחבה טלומראז כמו להקות על ג'ל על ידי חשיפת אותו גל עירור הנכון. הרגישות של שיטת המלכודת ויכולתה לזהות פעילות טלומראז ב-lysates תא גולמי הפכה את השיטה הנפוצה ביותר לשימוש הנפוץ ביותר עבור זיהוי פעילות טלומראז. עם זאת, לשיטת ההשמנה יש מגבלות. הטיפול הינו מבוסס ג'ל, ומקשה על ביצוע השכפל הדרוש בינוני ועד תפוקה גבוהה, ולכן מושגת לעתים רחוקות ניתוח סטטיסטי מתאים. יתרה מזאת, היכולת המבוססת על ג'ל קשה לכמת באופן אמין עקב חוסר מזהה פחות מאשר כפולה הבדלים בפעילות טלומראז בין דגימות. התגברות על שתי מגבלות אלה היא קריטית לטיפול בפעילות אנזימטית כגון המלכודת לעבור להגדרות הקליניות או התעשייה לאיתור פעילות טלומראז בדגימות מטופלים או בלימודי עיצוב סמים.

ה-PCR הדיגיטלי פותח בתחילה ב-1999 כאמצעי להמרת האופי האקספוננציאלי והאנלוגי של הPCR לתוך שיטת ליניארי ודיגיטלית מסוג¹⁰. ה-PCR הדיגיטלי (ddPCR) הוא החדשנות העדכנית ביותר של מתודולוגיית ה-PCR הדיגיטלית המקורית. ה-PCR הדיגיטלי של Droplet הגיע עם הופעתו של מיקרופלואידיקה מתקדם מיקרופלואידיקה וכימיה אמולסיה שמן במים כדי ליצור באופן אמין טיפות בגודל יציב ובמידה שווה. בניגוד ל-PCR המבוסס על ג'ל ואפילו כמותי, ddPCR יוצר קוונפיקציה מוחלטת של חומר הקלט. המפתח ddPCR הוא הדור של ~ 20,000 תגובות בודדות על ידי מחיצות דגימות לתוך טיפות. בעקבות ה-PCR של נקודת הסיום, הקורא droplet סורק כל droplet בצורה של זרימה-cytometer לספור, לגודל, ולהקליט את הנוכחות או העדר של הזריחה בכל droplet בודדת (כלומר, היעדרות או נוכחות של הגברה PCR ב-droplet). לאחר מכן, באמצעות התפלגות פואסון, מולקולות קלט מוערכות בהתאם ליחס של טיפות חיוביות למספר הכולל של טיפות. מספר זה מייצג הערכה של מספר מולקולות הקלט ב-PCR. יתר על כן, ddPCR מבוצע ומנותח על צלחת 96-באר אשר מאפשר למשתמש להפעיל דגימות רבות, כמו גם לבצע משכפל ביולוגי וטכני לניתוח סטטיסטי תקין. כתוצאה מכך, אנו שילבו את הקוונפיקציה עוצמה והתפוקה הבינונית של הטבע ddPCR עם בדיקת המלכודת כדי לפתח את השיטת Ddpcr¹¹. שיטת העבודה מיועדת למשתמשים ללמוד ולכמת את הפעילות המוחלטת של טלומראז מדגימות ביולוגיות^11,12. רגישות ה-ddtrap מאפשרת את כימות הפעילות של טלומראז מדגימות מוגבלות ויקרות, כולל מדידות תא יחיד. יתר על כן, משתמשים יכולים גם ללמוד את ההשפעות של מניפולציות טלומראז ו/או תרופות עם כימות מוחלטת של פחות מאשר שינויים כפולה (~ 50% הבדלים). ה-ddTRAP הוא האבולוציה הטבעית של הגדרת המלכודת לטבע הדיגיטלי והתפוקה הגבוהה יותר של ניסויי מעבדה מודרניים והגדרות קליניות.

Protocol

1. הכנה ואחסון של מאגר

1. להכין 50 mL של 1x מניות RNase-/Dnaset-free NP-40 לליזה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl [pH 8.0], 1 מ"מ MgCl₂, 1 מילימטר החומצה (edta), 1% [vol/VOL] NP-40, 10% [vol/vol] גליצרול, 150 מ"מ הנאל, 5 מ"מ β-mercaptoethanol, ו 0.1 mM 4- הידרואנסולולוניל פלווריד (AEBSF)). ניתן לצטט מאגר זה ולאחסנו ב-20 ° c לשימוש עתידי. הימנע הקפאת/הפשרת מחזורי על מנת לקבל לפירוק מיטבי של תאים.
2. הכינו 50 מ ל של 10x מניות RNase-/Dnaset-free מאגר הרחבה של השמנה (200 mM טריס-HCl [pH 8.0], 15 מ"מ MgCl₂, 630 Mm kcl, 0.5% [vol/Vol] רצף 20, ו 10 מ"מ אתילן גליקול-bis (β-עמינח האתר)-N, N, n ′, n′-הטטראצטט חומצה (egta)). מאגר זה יכול להיות מצוטט לתוך 1 mL המאחסן ומאוחסן ב-20 ° c לשימוש עתידי.

2. הפירוק התא

1. הכנת התאים
   1. הפשרת הנורית הקפואה של מאגר הליליזה של NP-40. לאחר הפשפה, הנח את מאגר הליזה על הקרח. הוסף פנילתילסולולוניל פלואוריד (מעכב פרוטאז PMSF) למאגר הליזה NP-40 כדי להגיע לריכוז הסופי של 0.2 מ"מ.
      הערה: יש לעשות זאת מייד לפני שתשיר את התאים.
   2. הסר את כל הנוזלים העודפים מן כדורי התא שנאספו כדי להבטיח גלולה תא יבש. שים לב כי כדורי תא, אם נאסף טרי או קפוא בעבר (-80 ° צ' או הבזק קפוא ב-N הנוזלי), אסור לכלול פתרונות שאריות מcentrifugations הקודם כמו פתרונות אלה עלולים להפריע להליכי הזרם.
   3. לגדול, לאסוף, ולהקפיא גם telomerase-חיובי ו-telomerase וחק קווי תא (BJ פיברותקיעות, IMR-90 או U2OS) על מנת להשתמש בהם כפקדים חיוביים ושליליים. השתמש בבקרת שליטה חדשה בכל פעם שהוא מבוצע כדי להבטיח את האפשרות לשמירה על המצב.
      הערה: מומלץ שתרבות גדולה של תאים טלומראז-שליליים תגדל ומצוטט לפני הקפאה כדי להסיר את כל החפצים הקשורים לרקמות הקשורות שניתן להציג במהלך התרבות הארוכת טווח של קווי התאים כדי להבטיח תוצאות מסוימות של דגימת הבקרה השלילית.
   4. . הניחו את כדורי התא על הקרח אם התאים קפאו, אפשר להם להפשיר בקצרה על קרח.
      הערה: גדלי כדוריות התאים האופייניות ל-ddTRAP הם בין 500,000 לבין 1,000,000 תאים. כדורי תא קטנים יותר עשויים לשמש גם במקרה הצורך, אך יש להכיר את מספר התאים/באופן אידיאלי. ניתן גם לבצע את ddTRAP בהתבסס על קלט חלבון באמצעות שיטת החלבון BCA (הקלט בדרך כלל הוא 1 μg).
2. ליסינג של התאים
   1. Lyse את התאים במאגר הליזה NP-40. שמור על תא שקילות של 25,000 תאים/μL של מאגר. לדוגמה, lyse גלולה (המכילה 1,000,000 תאים) ב 40 μL של מאגר הליזה NP-40. בעדינות ללטף את הליפוסט למעלה ולמטה על מנת לשבור את התאים. לנסות להימנע ביצוע בועות.
   2. הניחו לתאים להיות בקרח במשך 30 דקות. הקפד בעדינות מערבולת הליפוסט כדי למנוע אשכולות של פסולת תאים מיוצרים. זה יכול להיעשות כל 10 דקות והוא נועד לשמור על הליפוסט תערובת הומוגניים.
   3. לדלל את התא ליפוסט (25,000 תאים/μL) 1:20 ב NP-40 מאגר הליזה, ביצוע שקילות התא החדש 1,250 תאים/μL. לדוגמה, לדלל 5 μL של תא ליפוסט לתוך 95 μL של מאגר הליזה.

3. מחיקת הארכה של טלומראז

1. הכינו תמהיל ראשי (טבלה 1) לתגובת ההרחבה של טלומראז (לכל תגובה).
   הערה: מומלץ להכין את תגובת השלוחה מאסטר לערבב במהלך הפירוק התא ולאחסן אותו על הקרח.
   1. Pipet 48 μL של בסיס הרחבה מיקס לתוך כל צינור PCR.
   2. הוסף 2 μL של מדולל (1,250 תאים/μL) לאחר תגובת ההרחבה. הנפח הכולל צריך כעת להיות 50 μL עם שקילות התא הסופי של 50 תאים/μL.
2. בצע את תגובת ההרחבה של טלומראז (שולחן 2).
3. אחסן את מוצרי ההרחבה של טלומראז ב-4 ° צ' עד 3 – 5 ימים; עם זאת, מיטבי להשתמש במוצרי ההרחבה בתוך 24 ה-h הראשון.

4. התקנת ה-PCR הדיגיטלי של Droplet

1. הכינו תמהיל ראשי (שולחן 3) עבור ה-ddtrap (לכל תגובה).
   הערה: ברגע שהריאגנטים נמצאים בטמפרטורת החדר, אל תמקם אותם או את התערובת הראשית על הקרח. הצבת התערובת על הקרח עשויה להגביר את הצמיגות ולהוביל ליצירת droplet ירודה. הדי-אן-איי פולימראז ב-ddPCR הוא התחלה חמה וצריך להיות יציב בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את שילוב ddPCR ב-4 ° c לאחר ההפשרה הראשונית מ-20 ° c.
   1. Pipet 19.8 μL של המיקס הראשי של ddPCR לתוך כל צינור PCR.
   2. הוסף 2.2 μL של תגובת ההרחבה לכל צינורית. שים לב שאמצעי האחסון הכולל צריך להיות כעת 22 μL.
      הערה: הסכום הכולל של המדגם הדרוש עבור ddTRAP הוא 20 μL (שקילות תא של 100 תאים). נפח נוסף הוא אמצעי זהירות עבור שגיאה pipet או אובדן לדוגמה.
2. הגדר את מחסנית הדור droplet.
   הערה: המחסנית מכילה שלוש עמודות שונות של בארות המסומנות בתווית.
   1. טען 20 μL של התגובה שהוכנו על פי שלב 4.1.2 לתוך המדגם היטב (באמצע) במחסנית. להימנע בועות בעת ליטוף את המדגם.
      הערה: אם יש בועות, הקש בעדינות על צד המחסנית כך שבועות אלה יגיעו לראש הפתרון.
   2. טען 70 μL של שמן הדור droplet לתוך הבאר שמן (שמאל טוב).
      הערה: כדי למנוע זיהום, השתמש בקפדנות בערכה נפרדת של פיפטות וטיפים לצעדי הדור של ה-ddPCR. הסדר של טעינת המחסנית חשוב. המדגם חייב להיות טעון לפני טעינת שמן כמו שמן הוא כבד יותר ימלא את התאים microfluidic ולהוביל מערך droplet עני. המספר המינימלי של דגימות שניתן להפעיל הוא שמונה. כל הבארות של מחסנית חייב להיות טעון עם המדגם כמו כל הטוב הריק יוביל לעצירה בדור droplet ממחולל ה-droplet. אם דגימות מתאימות אינן זמינות לטעינת כל שמונה הבארות בתוך מחסנית, 20 μL של ערבוב מאסטר ddTRAP (שלב 4.1) ניתן לטעון לתוך מחסניות הנותרות.
   3. אבטח את האטם במקומו על-ידי הטבאתו לקצות המחסנית.
      הערה: חוסר או מיקום לא תקין של האטם ימנע את הגנרטור מיצירת טיפות.
   4. הצב את המחסנית שנטענה והורכבה במחולל ה-droplet.
      הערה: המחסנית מזוהה על-ידי מגנט במחולל, אשר יודיע למשתמש כאשר המחסנית ממוקמת כהלכה.
3. הסר את מיכל הדיו לאחר שהטיפות נוצרות והמחזור יושלם (~ 60-90 s).
   1. הסר את האטם בעדינות ממיכל הדיו. Pipet טיפות החדש שנוצר (טוב מאוד), באמצעות הצנרת רב-ערוצי, לצלחת 96-הטוב PCR.
      הערה: הנפח המשוער לתחליב ה-droplet החדש שנוצר צריך להיות 40 – 43 μL.
   2. החום חותם את הצלחת עם רדיד אלומיניום PCR הלוח החותמות פעם כל הדגימות נטענות בצלחת 96-באר כדי למנוע אידוי במהלך שלבי ה-PCR.
4. לטעון את הצלחת 96-היטב לתוך הציקלוניר ולבצע את תגובת ה-PCR הבאה (שולחן 4).
   הערה: כל שיעורי השיפוע בין שלבי הטמפרטורה חייבים להיות מוגדרים ל-2.5 ° צ'/s כדי לחמם כראוי את התגובות.

5. זיהוי מוצרי ההרחבה של טלומראז

1. טען את הצלחת 96-באר בקורא ה-droplet.
   הערה: הקפד לכוון את הצלחת כראוי כך שמדגם A1 תואם את זה של המחזיק.
   1. פתח את התוכנה המשויכת לקורא ה-droplet. לחץ פעמיים על הראשון בבאר A1 כדי לפתוח את מדגם/מסך עורך גם.
   2. לחץ על ניסוי ובחר באפשרות ABS מהתפריט הנפתח.
      הערה : הניסוי מגדיר את סוג הסדר בו יש להשתמש (כלומר, כימות מוחלטות או שיטת העתקת מספרים גנטית). ABS מייצג כימות מוחלטות.
   3. בחר באפשרות QX200 ddPCR ev, בכדי להבטיח ששיטת הזיהוי הנכונה מעובדת על-ידי הקורא. לחץ על החל בצד הימני התחתון של מסך העורך היטב כדי לשמור את ההגדרות המוגדרות על-ידי המשתמש לכל הבארות המסומנות.
      הערה: Supermix מגדיר את סוג שילוב ה-PCR וכימיית הזיהוי שייקרא על-ידי הקורא.
   4. לחץ על היעד במסך עורך היטב של התוכנה כדי להגדיר את המדגם.
   5. הגדר את סוג המדגם על-ידי לחיצה על התפריט הנפתח TARGET ובחירה באפשרות לא ידועה, הפניה או ntc (ללא תבנית בקרה).
      הערה: לא ידוע מתייחס למדגם ניסיוני , הפניה יכולה להיות דגימת שליטה של פעילות טלומראז ידועה, ו- ntc הוא שליטה קריטית לקביעת חוקיות האימות במונחים של זיהום ו . אות רקע
   6. סמן את כל הדגימות במקטע שם לדוגמה ולחץ על החל כדי לוודא שהבארות המסומנות מסומנות כראוי.
2. לחץ על הפעל כדי להפעיל/לקרוא את הלוח. בחר בעמודות או בשורות במסך אפשרויות הפעלה כאשר תתבקש ליידע את המחשב אודות הכיוון שבו יש לקרוא את הלוח.

6. ניתוח נתונים

1. קבע את מספר הטיפות המקובלות עבור כל מדגם על-ידי לחיצה על בארות נפרדות. לחץ פעמיים על כותרות הבארות או העמודות הבודדות כדי להציג ולנתח את הנתונים לדוגמה.
   הערה: הקריטריונים החשובים ביותר בשאלה האם להמשיך בניתוח של מדגם מסוים הוא מספר "טיפות מקובלות". עבור מלכודת ddTRAP, דגימות עם 10,000 או טיפות מקובלים יותר תקפים לניתוח נוסף. ניתן לספק נתונים למשתמש בפורמטים רבים, כולל טבלת. csv, תמונות jpg, היסטולגרמות, וכו '. ישנם משאבים רבים זמינים לניתוח מעמיק של נתוני ddpcr, כולל מלכודת ddpcr^,13. משאבים אלה מציעים מדריך לניתוח נתוני ddtrap, מבחירת ספי^11,13 לבחירת דוגמאות לניתוח נוסף^11,13, זיהוי תוצאות חיוביות שגויות ושליליות¹³, ו כללי פתרון בעיות¹³.
2. סמן את הבארות המייצגים משכפל לדוגמה ודגימות NTC. נתח את הדגימות בהשוואה ל-NTC או לקווי בקרה שליליים, כגון תאי BJ (כמפורט לעיל בשלב 2.1.2).
   1. קבע באופן ידני את הסף עבור הדגימות על-ידי לחיצה על הסמל להגדרת ספי הקצה בצד השמאלי התחתון של המסך. הגדר סף עבור כל היטב אדם או עבור בארות מרובות בכל פעם (מומלץ).
      הערה: אם הרקע מזוהה ב-NTC, ניתן לחיסור מכל הדגימות האחרות כדי ' לנרמל ' את האות ולהבטיח שרק האות החיובי האמיתי ינותח. ערכי NTC הם בדרך כלל בטווח של 0.2 – 1 מולקולה/μL עבור מערכת מאגר הליזה NP-40. יש לבדוק מערכות מאגר אחרות ורכיבים אחרים (לדוגמה, מאגרי בחורים).

תוצאות

באמצעות מלכודת ddomמחק נמדד בלוח התא המורכב של קווי התא הבאים (איור 1): סרטן ריאות תא קטן (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, ו H2887), סרטן ריאות תא קטן (H82 ו-SHP77), ו-טלומראז-שלילי פיברותקיעות (BJ). 1,000,000 כדורי תא היתה לאחר מאגר NP-40, ו-טלומראז תגובות הארכה בוצעו בטריליטים ביולוגיים. פק?...

Discussion

המדידה של פעילות טלומראז היא קריטית לשפע של נושאי מחקר כולל, אבל לא מוגבל, סרטן, טלומראז ביולוגיה, הזדקנות, רפואה רגנרטיבית, ועיצוב מבנה מבוסס סמים. Telomerase RNPs נמוכים בשפע, גם בתאים סרטניים, מה שהופך את האיתור והמחקר של האנזים הזה מאתגר. במאמר זה, תיארנו את ההליכים צעד אחר צעד עבור הצורך החדש שפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul