Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

Riepilogo

Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell'attività telomerasi all'interno di varie cellule umane.

Abstract

Il protocollo di amplificazione di ripetizione dei telomeri (trap) è il saggio più diffuso per rilevare l'attività telomerasi all'interno di un dato campione. Il metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) consente misurazioni robuste dell'attività enzimatica dalla maggior parte dei lisati cellulari. Il TRAP a base di gel con primer con etichetta fluorescente limita la velocità di campionamento e la capacità di rilevare le differenze nei campioni è limitata a due o più cambiamenti nell'attività enzimatica. Il goccia Digital trap, ddtrap, è un approccio altamente sensibile che è stato modificato dal tradizionale saggio TRAP, permettendo all'utente di eseguire un'analisi robusta su 96 campioni per corsa e ottenere una quantificazione assoluta del DNA (prodotti di estensione telomerasi ) all'interno di ciascuna PCR. Pertanto, il saggio ddTRAP di nuova concezione supera i limiti del tradizionale saggio TRAP basato su gel e fornisce un approccio più efficiente, accurato e quantitativo per misurare l'attività della telomerasi all'interno di contesti clinici e di laboratorio.

Introduzione

I telomeri sono complessi di proteine del DNA dinamici alle estremità dei cromosomi lineari. I telomeri umani sono composti da una serie di ripetizioni di 5'-TTAGGG_n formazione del esamerico che variano in lunghezza tra 12 – 15 chilobasi (KB) alla nascita¹. La telomerasi umana, l'enzima ribonucleoproteina che mantiene i telomeri, è stato identificato per la prima volta nei lisati delle cellule di hela (linea cellulare tumorale)². Insieme, telomeri e telomerasi giocano un ruolo importante in uno spettro di processi biologici come la protezione del genoma, la regolazione genica e l'immortalità delle cellule tumorali^3,4,5,6.

La telomerasi umana è costituita principalmente da due componenti chiave, vale a dire la trascrittasi inversa telomerasi e l'RNA telomerasi (hTERT e hTERC, rispettivamente). La subunità proteica, hTERT, è la componente della trascrittasi inversa caticamente attiva dell'enzima telomerasi. Il modello di RNA, hTERC, fornisce telomerasi con il modello per estendere e/o mantenere i telomeri. La maggior parte dei tessuti somatici umani non hanno un'attività di telomerasi rilevabile. L'incapacità della DNA polimerasi di estendere la fine del filamento di DNA in ritardo, insieme alla mancanza di telomasi, porta all'accorciamento progressivo dei telomeri dopo ogni round di divisione cellulare. Questi fenomeni portano a un accorciamento dei telomeri nella maggior parte delle cellule somatiche fino a raggiungere una lunghezza criticamente abbreviata, per cui le cellule entrano in uno stato di senescenza replicativa. Il numero massimo di volte che una cellula può dividere è dettato dalla sua lunghezza telomeri e questo blocco alla divisione cellulare continua è pensato per prevenire la progressione a oncogenesi⁷. Le cellule tumorali sono in grado di superare la senescenza replicativa indotta da telomere e continuano a proliferare utilizzando telomerasi per mantenere i loro telomeri. Circa il 90% dei tumori attiva la telomerasi, rendendo l'attività della telomerasi di importanza critica sia nel rilevamento che nel trattamento del cancro.

Lo sviluppo del saggio TRAP negli anni novanta è stato determinante per l'identificazione dei componenti necessari dell'enzima telomerasi, nonché per la misurazione della telomerasi in una vasta gamma di cellule e tessuti, sia normali che cancerogene. Il saggio originale basato su gel PCR ha utilizzato substrati del DNA radioattivi etichettati per rilevare l'attività della telomerasi. Nel 2006, il saggio è stato adattato in forma non radioattiva utilizzando substrati con etichetta fluorescente^8,9. Utilizzando substrati con etichetta fluorescente, gli utenti sono stati in grado di visualizzare i prodotti di estensione telomerasi come bande su un gel esponendolo alla lunghezza d'onda di eccitazione corretta. La sensibilità del saggio TRAP e la sua capacità di rilevare l'attività telomerasi nei lisati di cellule grezze ha reso questo saggio il metodo più diffuso per il rilevamento dell'attività telomerasi. Tuttavia, il test TRAP ha dei limiti. Il saggio è a base di gel, rendendo difficile eseguire i replicati necessari negli studi a throughput medio-alto, e quindi, una corretta analisi statistica è raramente raggiunta. Inoltre, il saggio a base di gel è difficilmente quantificabile in modo affidabile a causa dell'incapacità di rilevare meno di due differenze nell'attività di telomerasi tra i campioni. Il superamento di queste due limitazioni è fondamentale per i saggi di attività enzimatica, come il TRAP, per passare a impostazioni cliniche o industriali per il rilevamento dell'attività di telomerasi nei campioni dei pazienti o negli studi sulla progettazione di farmaci.

La PCR digitale è stata inizialmente sviluppata in 1999 come mezzo per convertire la natura esponenziale e analogica della PCR in un saggio lineare e digitale¹⁰. La PCR digitale droplet (ddPCR) è l'innovazione più recente della metodologia di PCR digitale originale. La PCR digitale droplet è arrivata con l'avvento della microfluidica avanzata e della chimica dell'emulsione olio-in-acqua per generare in modo affidabile goccioline stabili e di dimensioni uguali. A differenza della PCR (qPCR) a base di gel e persino quantitativa, la ddPCR genera una quantificazione assoluta del materiale in ingresso. La chiave per ddPCR è la generazione di ~ 20.000 reazioni individuali di partizionamento di campioni in goccioline. Dopo la PCR end-point, il lettore di gocce scansiona ogni goccia in modo simile a un citometro a flusso, contando, ridimensionando e registrando la presenza o l'assenza di fluorescenza in ogni singola goccia (cioè assenza o presenza di ampliconi PCR in ogni goccia). Quindi, utilizzando la distribuzione di Poisson, le molecole di input sono stimate in base al rapporto delle goccioline positive al numero totale di goccioline. Questo numero rappresenta una stima del numero di molecole di input in ogni PCR. Inoltre, ddPCR viene eseguita e analizzata su una piastra di 96 pozzetti che consente all'utente di eseguire molti campioni, nonché di eseguire repliche biologiche e tecniche per un'adeguata analisi statistica. Di conseguenza, abbiamo combinato la potente quantificazione e la natura a throughput moderato di ddPCR con il saggio TRAP per sviluppare il saggio ddTRAP¹¹. Questo saggio è progettato per gli utenti di studiare e quantificare in modo robusto l'attività di telomerasi assoluta da campioni biologici^11,12. La sensibilità del ddTRAP consente la quantificazione dell'attività telomerasi da campioni limitati e preziosi, comprese le misurazioni a cella singola. Inoltre, gli utenti possono anche studiare gli effetti delle manipolazioni telomerasi e/o farmaci con quantificazione assoluta di meno di due cambiamenti (~ 50% differenze). Il ddTRAP è la naturale evoluzione del saggio TRAP nella natura digitale e ad alto rendimento dei moderni esperimenti di laboratorio e delle impostazioni cliniche.

Protocollo

1. preparazione e stoccaggio del tampone

1. Preparare 50 mL di 1x tampone di lisi RNasi-/DNase-free NP-40 Lysis (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM MgCl₂, 1 mm acido etilendiamaminetetraacetico (EDTA), 1% [VOL/VOL] NP-40, 10% [VOL/VOL] glicerolo, 150 mm NaCl, 5 mm β-mercaptoetanolo e 0,1 mm 4- fluoruro di benzenesulfonile (AEBSF)). Questo buffer può essere aliquotato e conservato a-20 ° c per un uso futuro. Evitare cicli di congelamento/scongelamento al fine di ottenere una lisi ottimale delle cellule.
2. Preparare 50 mL di tampone di estensione della trappola di RNAsi-/DNase-free 10x Stock (200 mM Tris-HCl [pH 8,0], 15 mM MgCl₂, 630 mm kcl, 0,5% [VOL/VOL] Tween 20, e 10 mm glicole etilenico-bis (β-amminoetiletere)-N, N, n ′, acido n′-tetraacetico (EGTA)). Questo buffer può essere aliquotato in aliquote di 1 mL e conservato a-20 ° c per un uso futuro.

2. lisi cellulare

1. Preparazione delle cellule
   1. Scongelare un'aliquota congelata del tampone di lisi NP-40. Una volta scongelati, posizionare il tampone di lisi sul ghiaccio. Aggiungere il fenilmetilsulfonil fluoruro (inibitore della proteasi PMSF) al tampone di lisi NP-40 per raggiungere una concentrazione finale di 0,2 mM.
      Nota: questo dovrebbe essere fatto immediatamente prima di lising le cellule.
   2. Rimuovere il liquido in eccesso dai pellet di cellule raccolti per garantire un pellet a celle secche. Si noti che i pellet di cellule, sia appena raccolti o precedentemente congelati (-80 ° c o Flash congelati nel liquido N₂), non devono contenere soluzioni residue di centrifugazioni precedenti poiché queste soluzioni possono interferire con le procedure a valle.
   3. Coltivare, raccogliere e congelare le linee cellulari telomerasi-positive e telomerasi-negative (fibroblasti BJ, IMR-90 o U2OS) al fine di utilizzarli come controlli positivi e negativi. Utilizzare nuovi lisati di controllo ogni volta che viene eseguito il test per garantire la riproducibilità del saggio.
      Nota: si consiglia di crescere una grande cultura delle cellule negative telomerasi e di quotare prima del congelamento per rimuovere eventuali artefatti correlati alla coltura tissutale che possono essere introdotti durante la coltura a lungo termine delle linee cellulari per contribuire a garantire risultati riproducibili di campione di controllo negativo.
   4. Collocare il pellet cellulare sul ghiaccio. Se le cellule sono state congelate, permettete loro di scongelare brevemente il ghiaccio.
      Nota: le dimensioni tipiche dei pellet di celle per il ddTRAP sono tra 500.000 e 1 milione. I pellet di cellule più piccoli possono essere utilizzati anche se necessario, ma il numero di cellulare deve essere conosciuto. Il ddTRAP può anche essere eseguito in base all'apporto proteico utilizzando un saggio proteico BCA (l'input di solito è 1 μg).
2. Lising delle cellule
   1. Lizzare le cellule nel tampone di lisi NP-40. Mantenere un'equivalenza cellulare di 25.000 cellule/μL di buffer. Ad esempio, lizzare un pellet (contenente 1 milione cellule) in 40 μL di tampone di lisi NP-40. Pipet delicatamente il lisato su e giù al fine di rompere aprire le cellule. Cercate di evitare di fare bolle.
   2. Lasciar lievitare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti. Assicurarsi di agitare delicatamente il lisato per impedire la formazione di gruppi di detriti cellulari. Questo può essere fatto ogni 10 minuti e ha lo scopo di mantenere il lisato una miscela omogeneizzata.
   3. Diluire il lisato cellulare (25.000 cellule/μL) 1:20 nel tampone di lisi NP-40, rendendo la nuova equivalenza delle cellule 1.250 cellule/μL. Ad esempio, diluire 5 μL di lisato cellulare in 95 μL di tampone di lisi.

3. reazione di estensione telomerasi

1. Preparare un Master Mix (tabella 1) per la reazione di estensione telomerasi (per reazione).
   Nota: è meglio preparare il mix master di reazione di estensione durante la lisi cellulare e conservarlo sul ghiaccio.
   1. Pipet 48 μL di miscela Master di estensione in ogni tubo PCR.
   2. Aggiungere 2 μL del lisato diluito (1.250 cellule/μL) alla reazione di estensione. Il volume totale dovrebbe ora essere 50 μL con un'equivalenza delle cellule finali di 50 celle/μL.
2. Eseguire la reazione di estensione telomerasi (tabella 2).
3. Conservare i prodotti di estensione telomerasi a 4 ° c per un massimo di 3 – 5 giorni; Tuttavia, è ottimale utilizzare i prodotti di estensione entro il primo 24 h.

4. impostazione PCR digitale droplet

1. Preparare un Master Mix (tabella 3) per il ddtrap (per reazione).
   Nota: una volta che i reagenti sono a temperatura ambiente, non metterli o il mix master sul ghiaccio. L'inserimento del mix su ghiaccio può aumentare la viscosità e portare a una scarsa formazione di gocciolina. La DNA polimerasi nel SuperMix di ddPCR è un avviamento a caldo e deve essere stabile a temperatura ambiente. Il SuperMix di ddPCR può essere conservato a 4 ° c dopo uno scongelamento iniziale da-20 ° c.
   1. Pipet 19,8 μL di miscela Master ddPCR in ogni tubo PCR.
   2. Aggiungere 2,2 μL di reazione di estensione a ciascun tubo. Si noti che il volume totale dovrebbe ora essere 22 μL.
      Nota: la quantità totale di campione necessaria per un ddTRAP è 20 μL (equivalenza cellulare di 100 celle). Il volume supplementare è una precauzione per errore di Pipet o perdita del campione.
2. Impostare la cartuccia di generazione della gocciolina.
   Nota: la cartuccia contiene tre diverse colonne di pozzetti etichettati.
   1. Caricare 20 μL della reazione preparata secondo il punto 4.1.2 nel pozzo del campione (pozzo medio) nella cartuccia. Evitare bolle durante il pipettaggio del campione.
      Nota: se ci sono bolle, toccare delicatamente il lato della cartuccia in modo che queste bolle arrivano alla parte superiore della soluzione.
   2. Caricare 70 μL di olio di generazione di gocciolina nel pozzo dell'olio (pozzo sinistro).
      Nota: per evitare contaminazioni, utilizzare rigorosamente un set separato di pipette e puntali per le fasi di generazione delle gocce di ddPCR. L'ordine di caricamento della cartuccia è importante. Il campione deve essere caricato prima di caricare l'olio come olio è più pesante e riempirà le camere microfluidiche e portare a scarsa formazione di gocciolina. Il numero minimo di campioni che è possibile eseguire è otto. Tutti i pozzi della cartuccia devono essere caricati con il campione come qualsiasi pozzo vuoto porterà ad una battuta d'arresto nella generazione di gocciolina dal generatore di gocciolina. Se non sono disponibili campioni adeguati per caricare tutti gli otto pozzetti all'interno di una cartuccia, è possibile caricare 20 μL di mix master ddTRAP (passaggio 4,1) nelle cartucce rimanenti.
   3. Fissare la guarnizione in posizione posizionandolo fino alle estremità della cartuccia.
      Nota: la mancanza o il posizionamento improprio della guarnizione impedirà al generatore di generare goccioline.
   4. Collocare la cartuccia caricata e assemblata nel generatore di gocciolina.
      Nota: la cartuccia è riconosciuta da un magnete nel generatore, che informerà l'utente quando la cartuccia è posizionata correttamente.
3. Rimuovere la cartuccia una volta generate le goccioline e il ciclo è completo (~ 60 – 90 s).
   1. Rimuovere delicatamente la guarnizione dalla cartuccia. Pipet le goccioline appena generate (bene), utilizzando una pipetta multicanale, in una piastra PCR 96-well.
      Nota: il volume approssimativo per l'emulsione di gocciolina appena generata deve essere di 40 – 43 μL.
   2. Sigillare il piatto con guarnizioni in lamina di alluminio PCR una volta che tutti i campioni sono caricati nella piastra 96-well per evitare l'evaporazione durante le fasi di PCR.
4. Caricare la piastra 96-pozzetto nel termociclatore ed eseguire la seguente reazione PCR (tabella 4).
   Nota: tutte le velocità di rampa tra le fasi di temperatura devono essere impostate a 2,5 ° c/s per riscaldare adeguatamente le reazioni.

5. rilevazione dei prodotti di estensione della telomerasi

1. Caricare la piastra 96-well nel lettore di gocciolina.
   Nota: accertarsi di orientare correttamente la piastra in modo che il campione a1 corrisponda a quello del supporto.
   1. Aprire il software associato al lettore di gocciolina. Fare doppio clic sul primo pozzo a1 per aprire la schermata dell'editor di esempio/pozzetto.
   2. Fare clic su esperimento e selezionare ABS dal menu a discesa.
      Nota: l' esperimento definisce il tipo di saggio da utilizzare (cioè la quantificazione assoluta o il saggio del numero di copie genetiche). ABS è sinonimo di quantificazione assoluta.
   3. Selezionare QX200 ddPCR Evagreen SuperMix per assicurarsi che il metodo di rilevamento corretto sia impiegato dal lettore. Fare clic su applica nella parte inferiore destra della schermata dell'editor di pozzetti per salvare le impostazioni definite dall'utente in tutti i pozzetti evidenziati.
      Nota: SuperMix definisce il tipo di miscela PCR e di rilevazione chimica che verrà letta dal lettore.
   4. Fare clic su target nella schermata dell'editor di ben del software per definire il campione.
   5. Definire il tipo di campione facendo clic sul menu a discesa destinazione e selezionando sconosciuto, riferimentoo NTC (controllo No-Template).
      Nota: Unknown si riferirebbe a un campione sperimentale, riferimento potrebbe essere un campione di controllo di attività telomerasi noto, e un NTC è un controllo critico per la determinazione della validità del saggio in termini di contaminazione e segnale di sottofondo.
   6. Etichettare tutti gli esempi nella sezione nome campione e fare clic su applica per assicurarsi che i pozzetti evidenziati vengano modificati in modo appropriato.
2. Fare clic su Esegui per eseguire/leggere la piastra. Selezionare le colonne o le righe nella schermata Opzioni di esecuzione quando viene richiesto di informare la macchina sull'orientamento in cui deve essere letta la piastra.

6. analisi dei dati

1. Determinare il numero di goccioline accettate per ogni campione facendo clic su singoli pozzetti. Fare doppio clic sui singoli pozzetti o sulle intestazioni di colonna/riga per visualizzare e analizzare i dati di esempio.
   Nota: i criteri più importanti per valutare se procedere o meno all'analisi di un campione specifico sono il numero di "goccioline accettate". Per il ddTRAP, i campioni con 10.000 o più goccioline accettate sono validi per un'ulteriore analisi. I dati possono essere forniti all'utente in molti formati, tra cui una tabella. csv, immagini. jpg, istogrammi, ecc. Ci sono molte risorse disponibili per l'analisi approfondita dei dati ddpcr, incluso il ddtrap^11,13. Queste risorse offrono una guida per l'analisi dei dati ddtrap, dalla selezione delle soglie^11,13 alla scelta dei campioni per ulteriori analisi^11,13, identificando falsi positivi e negativi¹³, e risoluzione dei problemi generali¹³.
2. Evidenziare i pozzetti che rappresentano le repliche di esempio e i campioni NTC. Analizzare i campioni in confronto alle linee di controllo NTC o negative, come le celle BJ (come indicato sopra al punto 2.1.2).
   1. Impostare manualmente la soglia per i campioni facendo clic sull'icona per impostare le soglie in basso a sinistra dello schermo. Impostare le soglie per ciascun pozzo individuale o per più pozzetti alla volta (consigliato).
      Nota: se lo sfondo viene rilevato nel NTC, può essere sottratto da tutti gli altri campioni per ' normalizzare ' il segnale e garantire che solo il vero segnale positivo viene analizzato. I valori NTC sono tipicamente nella gamma di molecole/μL 0.2 – 1 per il sistema tampone di lisi NP-40. Altri sistemi e componenti di buffer devono essere testati (ad esempio, buffer CHAPS).

Risultati

Utilizzando il ddTRAP, l'attività telomerasi è stata misurata in un pannello cellulare costituito dalle seguenti linee cellulari (Figura 1): carcinoma polmonare non a piccole cellule (H2882, H1299, Calu6, H920, A549 e H2887), carcinoma polmonare a piccole cellule (H82 e SHP77), e telomerasi-negativo fibroblasti (BJ). 1 milione pellet di cellule sono stati lisati in NP-40 buffer, e le reazioni di estensione telomerasi sono state eseguite in triplicates biolo...

Discussione

La misurazione dell'attività di telomerasi è fondamentale per una pletora di argomenti di ricerca tra cui, ma non limitati a, cancro, biologia dei telomeri, invecchiamento, medicina rigenerativa e progettazione di farmaci basati sulla struttura. Telomerasi RNP sono bassi abbondanti, anche nelle cellule tumorali, rendendo la rilevazione e lo studio di questo enzima impegnativo. In questo documento, abbiamo descritto le procedure passo-passo per il saggio ddTRAP di nuova concezione per quantificare in modo affidabile l'a...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul