液滴デジタルトラップ (ddTRAP): 液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応へのテロメア反復増幅プロトコルの適応

要約

我々は正常に液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応に採用される標準的なテロメア反復増幅プロトコル (TRAP) アッセイを変換しました。DdTRAP と呼ばれるこの新しいアッセイは、より高感度で定量的であり、様々なヒト細胞内のテロメラーゼ活性のより良い検出および統計分析を可能にします。

要約

テロメア反復増幅プロトコル (TRAP) は、所与のサンプル内のテロメラーゼ活性を検出するために最も広く使用されているアッセイです。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法は、ほとんどの細胞溶解物からの酵素活性のロバストな測定を可能にします。蛍光標識されたプライマーを用いたゲルベースのトラップはサンプルのスループットを制限し、サンプルの差を検出する能力は酵素活性の2倍以上の変化に制限される。液滴のデジタルトラップ、ddTRAP は従来のトラップの試金から変更された非常に敏感なアプローチであり、ユーザーが実行ごとの96サンプルの強い分析を行い、DNA の絶対定量化を得ることを可能にする (テロメラーゼの延長プロダクト) は、各 PCR 内で入力します。従って、新しく開発された ddTRAP の試金は従来のゲルベースのトラップの試金の限界を克服し、実験室および臨床設定内のテロメラーゼの活動を測定するためにより有効で、正確な、量的なアプローチを提供する。

概要

テロメアは、線状染色体の末端にある動的な DNA-タンパク質複合体です。ヒトテロメアは、出生¹で 12-15 キロベース (kb) の長さが異なる 5 '-TTAGGG_n hexameric の繰り返しの配列で構成されています。ヒトテロメラーゼは、テロメアを維持する ribonucleoprotein 酵素を、HeLa 細胞溶解物 (癌細胞株)²で最初に同定した。共に、テロメアとテロメラーゼは、ゲノム保護、遺伝子調節、および癌細胞不滅性^{3、4、5、6}などの生物学的プロセスのスペクトルにおいて主要な役割を果たしています。

ヒトテロメラーゼは主に、テロメラーゼ逆転写酵素とテロメラーゼ RNA (hTERT および hTERC) の2つの主要成分から構成されています。タンパク質サブユニットは、hTERT、テロメラーゼ酵素の触媒活性逆転写酵素成分である。RNA テンプレート、hTERC は、テロメアを拡張および/または維持するためのテンプレートをテロメラーゼに提供する。ほとんどのヒト体細胞組織は、検出可能なテロメラーゼ活性を有しない。DNA ポリメラーゼが不足している DNA の末端を広げることができないことは、テロメラーゼの欠如とともに、細胞分裂の毎ラウンド後のテロメアの漸進的短縮につながります。これらの現象は、ほとんどの体細胞において、非常に短い長さに達するまでテロメア短縮をもたらし、それによって細胞は複製老化の状態に入る。細胞が分裂できる最大回数はそのテロメア長によって決まり、このブロックはもとづき⁷への進行を防ぐと考えられています。がん細胞はテロメア誘発複製の老化を克服することができ、テロメラーゼを利用してテロメアを維持することによって増殖を続けています。癌の約 90% がテロメラーゼを活性化し、癌の検出と治療の両方においてテロメラーゼ活性を極めて重要なものにします。

1990年代の TRAP アッセイの開発は、テロメラーゼ酵素の必要な成分の同定、ならびに正常および癌性の両方の細胞および組織の広い範囲におけるテロメラーゼの測定に役立った。元のゲルベース PCR アッセイは、テロメラーゼの活性を検出するために放射能標識された DNA 基質を使用しました。2006では、アッセイは、蛍光標識された基材^8、9を用いて非放射性形態に適応した。蛍光標識された基質を使用することにより、ユーザーは正しい励起波長に曝露することによってテロメラーゼ伸長製品をゲル上のバンドとして可視化することができました。トラップアッセイの感度と、粗細胞溶解物中のテロメラーゼ活性を検出する能力は、このアッセイをテロメラーゼ活性検出に最も広く使用されている方法にしました。しかし、TRAP アッセイには限界があります。このアッセイはゲルベースであるため、適度な高スループットの試験では必要とされる反復を行うことが困難であり、適切な統計分析はほとんど達成されません。さらに、ゲルベースのアッセイは、サンプル間のテロメラーゼ活性の2倍未満の差を検出できないため、確実に定量化することが困難である。これら2つの制限を克服することは、患者のサンプルまたは薬物設計研究におけるテロメラーゼの活性を検出するための臨床または業界の設定に移動するトラップなどの酵素活性アッセイにとって重要である。

デジタル PCR は、PCR の指数的およびアナログ的性質を線形およびデジタルアッセイ¹⁰に変換する手段として、1999年に最初に開発されました。液滴デジタル PCR (ddPCR) は、元のデジタル PCR の方法論の最新の技術革新です。液滴デジタル PCR は確実に安定した、同じ大きさの液滴を生成するために、高度なマイクロ流体と水中油エマルジョン化学の出現によって来ました。ゲルベースであっても定量 PCR (qPCR) とは異なり、ddPCR は入力材料の絶対定量を生成します。DdPCR の鍵は、サンプルを液滴に分割することによって、〜2万の個々の反応を生成することです。エンドポイント PCR に続いて、液滴読み取り装置は、フローサイトメーターのような方法で各液滴をスキャンし、カウント、サイジング、および個々の液滴における蛍光の有無 (すなわち、各液滴における PCR アンプリコンの存在または不在) を記録する。次いで、ポアソン分布を用いて、液滴の総数に対する正の液滴の比率に基づいて入力分子が推定される。この数値は、各 PCR における入力分子数の推定値を表します。さらに、ddPCR は、ユーザーが多くのサンプルを実行することを可能にし、適切な統計分析のために生物学的および技術的な複製を行うことができる96ウェルプレート上で実行され、分析します。その結果、ddPCR の強力な定量と中程度のスループットの性質をトラップアッセイと組み合わせて、ddTRAP アッセイ¹¹を開発しました。このアッセイは、生物学的試料^11,12からの絶対的なテロメラーゼ活性を研究し、確実に定量化するためにユーザが設計されています。DdTRAP の感受性は単一細胞の測定を含む限られた、貴重なサンプルからのテロメラーゼの活動の定量化を可能にする。さらに, ユーザーは、2倍未満の変化 (〜 50% の差) の絶対定量とテロメラーゼの操作および/または薬物の効果を研究することができます。DdTRAP は現代実験室の実験および臨床設定のデジタルおよびより高い効率の性質にトラップの試金の自然な進化である。

プロトコル

1. バッファの準備と保存

1. 50の1x ストック RNase-/DNase-free NP-40 溶解バッファー (10 mM トリス-HCl [pH 8.0]、1 mM MgCl₂、1 mm ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、1% [vol/VOL] NP-40、10%(vol/vol] グリセロール、150 mm NaCl、5 mm β-メルカプトエタノール、および 0.1 mm 4-benzenesulfonyl 塩酸塩 (AEBSF))。このバッファは、将来の使用のために-20 ° c で等分および保存することができます。細胞の最適な溶解を得るために、凍結/解凍サイクルを避けてください。
2. 10倍のストック RNase-/DNase-free トラップ拡張バッファー (200 mm MgCl-HCl [pH 8.0]、15 mm アミノエチルシステイン2、630 mM KCl、0.5% [vol/vol] トゥイーン20、および 10 mM エチレングリコール-ビス (β-エーテル)-n、n、n ′、N′-tetraacetic 酸 (EGTA)) を50準備します。この緩衝液を 1 mL アリコートに等分し、将来の使用のために-20 ° c で保存することができます。

2. 細胞溶解

1. 細胞の調製
   1. 40溶解バッファーの冷凍アリコートを解凍します。解凍したら、溶解バッファーを氷上に置きます。40溶解バッファーに phenylmethylsulfonyl フッ化物 (PMSF プロテアーゼ阻害剤) を添加し、0.2 mM の最終濃度に達します。
      注: これは、セルを溶解するする直前に行う必要があります。
   2. 収集した細胞ペレットから余分な液体を除去して、乾燥細胞ペレットを確保します。これらの溶液が下流の手順に干渉する可能性があるため、新たに採取された、または以前に凍結していた (-80 ° c または液体 N₂のフラッシュ冷凍の) 細胞ペレットは、以前の centrifugations からの残留溶液を含まないようにしてください。
   3. それらをポジティブおよびネガティブコントロールとして使用するために、テロメラーゼ陽性およびテロメラーゼ陰性細胞株 (BJ 線維芽細胞、IMR-90 または U2OS) の両方を成長、収集、凍結します。アッセイの再現性を確保するために毎回新しい制御溶解液を使用します。
      注意: テロメラーゼ陰性細胞の大規模な培養は、細胞株の長期培養中に導入されるかもしれない組織培養関連のアーティファクトを除去するために凍結する前に増殖させ、等分することをお勧めします。陰性対照サンプル。
   4. 細胞ペレットを氷上に置く。細胞が凍結していた場合は、氷の上で簡単に解凍することができます。
      注: ddTRAP の典型的な細胞ペレットサイズは、50万と100万細胞の間にあります。より小さい細胞ペレットは、必要に応じて使用することもできるが、細胞数は、理想的には既知でなければならない。DdTRAP は、BCA タンパク質アッセイ (入力は通常1μ g) を使用してタンパク質入力に基づいて行うこともできます。
2. 細胞の溶解する
   1. 40溶解バッファー内のセルを溶解します。25000細胞/μ l のバッファーの細胞等価性を維持してください。例えば、溶解は40μ l の NP-40 溶解バッファーにペレット (100万細胞を含む) を含有する。セルを開くために、溶解液をそっと pipet ます。泡を作ることを避けるようにしてください。
   2. 細胞を氷上で30分溶解ことができるようにします。細胞デブリのクラスターが形成されないように、溶解液を優しく渦巻きしてください。これは、10分ごとに行うことができ、溶解液を均質化した混合物を維持することを意味します。
   3. 細胞溶解液 (25000 細胞/μ l) 1:20 を NP-40 溶解バッファーに希釈し、新しい細胞等価性1250細胞/μ l を作ります。例えば、5μ l の細胞溶解液を95μ l の溶解バッファーに希釈します。

3. テロメラーゼ伸長反応

1. テロメラーゼ伸長反応 (反応ごと) のためのマスターミックス (表 1) を準備します。
   注: 細胞溶解中に伸長反応マスターミックスを準備し、それを氷上に保管することをお勧めします。
   1. Pipet 48 μ l の拡張マスターミックスを各 PCR チューブに混合します。
   2. 希釈した (1250 細胞/μ l) ライセートの2μ l を伸長反応に加える。総容積は今50細胞/μ l の最終的な細胞の等量の50μ l であるべきである。
2. テロメラーゼ伸長反応を行う (表 2)。
3. テロメラーゼ延長製品を4° c で 3 ~ 5 日間保管してください。ただし、最初の24時間以内に拡張製品を使用することが最適です。

4. 液滴デジタル PCR セットアップ

1. DdTRAP (反応ごと) のマスターミックス (表 3) を準備します。
   注: 試薬が室温になったら、それらまたはマスターミックスを氷上に置かないでください。氷の上にミックスを配置すると、粘度が上昇し、液滴の形成につながる可能性があります。DdPCR スーパーミックスの DNA ポリメラーゼはホットスタートであり、室温で安定している必要があります。DdPCR スーパーミックスは、初期解凍後-20 ° c で4° c で保存することができます。
   1. Pipet 19.8 μ l の ddPCR マスターミックスを各 PCR チューブに挿入します。
   2. 各チューブに2.2 μ l の伸長反応を加えます。合計体積が22μ l であることに注意してください。
      注: ddTRAP に必要なサンプルの総量は、20μ l (100 細胞の細胞当量) です。余分なボリュームは、pipet エラーまたはサンプルの損失のための予防措置です。
2. 液滴生成カートリッジをセットアップします。
   注: カートリッジには、ラベル付けされたウェルの3つの異なる列が含まれています。
   1. ステップ4.1.2 に従って調製した反応の20μ l をカートリッジ内の試料ウェル (中段ウェル) にロードする。サンプルをピペッティングするときは、泡を避けてください。
      注: 気泡がある場合は、カートリッジの側面を軽くタップして、これらの泡が溶液の上部に来るようにします。
   2. オイルウェルに70μ l の液滴発生油を負荷する (左よく)。
      注: 汚染を避けるために、厳密に ddPCR 液滴生成ステップのためのピペットおよび先端の別のセットを使用してください。カートリッジのロード順序は重要です。油が重くなるにつれて試料を装填しなければならず、マイクロ流体チャンバを満たし、低液滴形成につながる。実行できるサンプルの最小数は8です。任意の空の井戸は、液滴発生器からの液滴発生で停止につながるように、カートリッジのすべてのウェルは、サンプルと一緒にロードする必要があります。カートリッジ内に8個のウェルをすべてロードするのに十分なサンプルがない場合は、ddTRAP マスター・ミックスの20μ l (ステップ 4.1) を残りのカートリッジにロードすることができます。
   3. ガスケットをカートリッジの端に固定して、取り付けます。
      注: ガスケットの欠如または不適切な配置は、発電機が液滴を発生させるのを防ぎます。
   4. ロードされ、組み立てられたカートリッジをドロップレット・ジェネレーターに入れます。
      注: カートリッジは発電機の磁石によって認識され、カートリッジが適切に配置されたときにユーザーに通知されます。
3. 液滴が生成され、サイクルが完了したら、カートリッジを取り外します (~ 60 ~ 90 秒)。
   1. カートリッジからガスケットをそっと取り外します。Pipet は、新たに生成された液滴 (右井戸) をマルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル PCR プレートに挿入します。
      注: 新たに生成された液滴エマルジョンのおおよその体積は、40〜43μ l でなければなりません。
   2. プレートをアルミ箔 PCR プレートシールで熱シールすると、PCR ステップ中の蒸発を防ぐために、すべてのサンプルが96プレートにロードされます。
4. 96-ウェルプレートを thermocycler にロードし、次の PCR 反応を行います (表 4)。
   注: 適切に反応を加熱するためには、温度ステップ間のすべてのランプレートを2.5 ° c/s に設定する必要があります。

5. テロメラーゼ拡張製品の検出

1. 96-ウェルプレートを液滴読み取り装置にロードします。
   注: A1サンプルがホルダと一致するように、プレートの向きを正しくしてください。
   1. ドロップレットリーダーに関連付けられているソフトウェアを開きます。最初のウェルA1をダブルクリックして、サンプル/ウェルエディタ画面を開きます。
   2. [実験] をクリックし、ドロップダウンメニューから [ ABS ] を選択します。
      注:実験は、使用するアッセイの種類 (すなわち、絶対定量または遺伝子コピー数アッセイ) を定義します。ABSは絶対定量の略です。
   3. QX200 DdPCR Evagreen スーパーミックスを選択して、正しい検出方法がリーダーによって使用されていることを確認します。[ウェルエディタ] 画面の右下にある [適用] をクリックして、強調表示されているすべての井戸にユーザー定義の設定を保存します。
      注:スーパーミックスは、読者が読み取る PCR ミックスと検出化学のタイプを定義します。
   4. サンプルを定義するために、ソフトウェアのウェルエディタ画面でターゲットをクリックしてください。
   5. [ターゲット] ドロップダウンメニューをクリックし、[不明]、[参照]、または [ NTC ] (テンプレートなしのコントロール) のいずれかを選択して、サンプルのタイプを定義します。
      注: Unknownは、実験的サンプルを参照し、参照は既知のテロメラーゼ活性の対照サンプルであり得る、およびNTCは、汚染という点でアッセイの妥当性を決定するための重要な制御であり、バックグラウンドシグナル。
   6. [サンプル名] セクションのすべてのサンプルにラベルを付け、[適用] をクリックして、ハイライト表示されたウェルを適切に編集します。
2. プレートを実行/読み込みするには、[実行] をクリックします。プレートの読み取り方向を機械に通知するよう求められたら、[実行オプション] 画面で列または行のいずれかを選択します。

6. データ分析

1. 個々の井戸をクリックして、各サンプルの受け入れられた液滴の数を決定します。個々のウェルまたは列/行ヘッダーをダブルクリックして、サンプルデータを表示および分析します。
   注: 特定のサンプルの分析を進めるかどうかに関する最も重要な基準は、「受け入れられた液滴」の数です。DdTRAP の場合、1万以上の受け入れられた液滴を有するサンプルは、さらなる分析のために有効である。データは、.csv テーブル、.jpg イメージ、ヒストグラムなど、さまざまな形式でユーザーに提供できます。DdTRAP^11、13などの ddPCR データの詳細な分析に使用できる多くのリソースがあります。これらのリソースは、閾値^11,13の選択から、さらなる分析のためのサンプルの選択までの ddTRAP データを分析するためのガイド^11,13, 偽陽性とネガ¹³を識別し、一般的なトラブルシューティング¹³.
2. サンプルの反復および NTC サンプルを表すウェルをハイライトします。BJ 細胞などの NTC コントロールラインまたはネガティブ制御線と比較してサンプルを分析します (ステップ2.1.2 の上に示しました)。
   1. 画面の左下にあるしきい値を設定するアイコンをクリックして、サンプルのしきい値を手動で設定します。個々のウェルまたは複数のウェルのしきい値を一度に設定します (推奨)。
      注: 「NTC」でバックグラウンドが検出された場合は、他のすべてのサンプルから減算してシグナルを「正規化」し、真陽性シグナルのみが分析されるようにすることができます。NTC 値は、通常、NP-40 溶解バッファーシステムの 0.2-1 分子/μ l の範囲にあります。他のバッファー・システムおよびコンポーネントをテストする必要があります (例えば、バッファー)。

結果

DdTRAP を用いて、テロメラーゼの活性を、以下の細胞株からなる細胞パネルで測定した (図 1): nonsmall 細胞肺癌 (H2882、H1299、Calu6、H920、A549、および H2887)、小細胞肺癌 (H82 および SHP77)、およびテロメラーゼ陰性線維芽細胞 (BJ)。100万細胞ペレットを NP −40バッファーで溶解し、テロメラーゼ伸長反応を生物学的 triplicates で行った。一般的で強く推?...

ディスカッション

テロメラーゼの活動の測定は、癌、テロメア生物学、老化、再生医療、および構造ベースの薬物設計を含むが、これらに限定されない研究テーマの茄多に重要です。テロメラーゼ RNPs は、がん細胞であっても、豊富に不足しているため、この酵素の検出と研究は困難です。本論文では、新たに開発した ddTRAP アッセイについて、細胞内のテロメラーゼ活性を確実に定量化するためのステップ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0	Ambion	AM9855G	RNAse/DNAse free
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G	RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9261	RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40	Thermo Scientific	28324
100% Ultrapure Glycerol	Invitrogen	15514011	RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride	Thermo Scientific	36978	Powder
2-Mercaptoethanol	SIGMA-ALDRICH	516732
Nuclease Free H20	Ambion	AM9932	RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix	Thermo Scientific	R72501	2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl	Ambion	AM9640G	RNAse/DNAse free
100% Tween-20	Fisher	9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0	Fisher	50-255-956	RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer	Integrated DNA Technology (IDT)	Custom Primer (HPLC Purified)	5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes	USA Scientific	1402-2900	strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix	Bio Rad	1864034
Twin-Tec 96 Well Plate	Fisher	Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal	Bio Rad	1814040
Droplet generator cartidges (DG8)	Bio Rad	1863008
Droplet generator oil	Bio Rad	1863005
Droplet generator gasket	Bio Rad	1863009
96-well Thermocycler T100	Bio Rad	1861096
PX1 PCR Plate Sealer	Bio Rad	1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software	Bio Rad	1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio Rad	1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips	Thermo Scientific		10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul